治疗微小残留癌的方法

摘要

本申请公开了治疗受试者中微小残留癌的方法。所述方法涉及使受试者中的扩散癌细胞(DCC)与骨形态发生蛋白7(BMP7)衍生蛋白接触，其中所述接触在所述受试者的所述被接触的DCC中诱导或维持休眠，以治疗所述受试者中的微小残留癌。本申请还公开了涉及使受试者中的DCC与选自LY2、LY3和LY4的蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)抑制剂接触的方法，其中所述接触根除所述受试者中的DCC以治疗所述受试者中的微小残留癌。

说明书

本申请要求2018年3月26日提交的美国临时专利申请系列号62/648,166的优先权，其全部内容在此通过引用并入。

本发明是在由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所授予的R01 CA109182，U54CA16131和P30 CA196521，以及由国防部国会指导医学研究计划授予的BC 132674的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

发明领域

本发明涉及在受试者中治疗微小残留癌的方法。

背景技术

内质网(“ER”)管腔中的蛋白质解折叠激活三个主要通路，PERK、IRE1α和ATF6，也被称为解折叠蛋白应答(“UPR”)，其使细胞能够纠正并在该应激下存活(Walter等,“TheUnfolded Protein Response:From Stress Pathway to Homeostatic Regulation,”Science 334:1081-1086(2011)and Ron等,“Signal Integration In the EndoplasmicReticulum Unfolded Protein Response,”Nat.Rev.Mol.Cell Biol.8:519-529(2007))。最近的证据表明，在各种类型的癌症中，UPR是一种可使肿瘤细胞对由癌基因和缺氧等信号引起的翻译负荷增加而对内质网和氧化条件产生需求做出应答的机制(Blais等,“Activating Transcription Factor 4is Translationally Regulated by HypoxicStress,”Mol.Cell.Biol.24:7469-7482(2004)；Chevet等,“Endoplasmic ReticulumStress-Activated Cell Reprogramming in Oncogenesis,”Cancer Discov.5:586-597(2015)；Tameire等,“Cell Intrinsic and Extrinsic Activators of the UnfoldedProtein Response in Cancer:Mechanisms and Targets for Therapy,”Semin.CancerBiol.33:3-15(2015)；Hart等,“ER Stress-Mediated Autophagy Promotes Myc-Dependent Transformation and Tumor Growth,”J.Clin.Invest.122:4621-4634(2012)；Martin-Perez等,“Activated ERBB2/HER2 Licenses Sensitivity to Apoptosis UponEndoplasmic Reticulum Stress Through a PERK-Dependent Pathway,”Cancer Res.74:1766-1777(2014)；Rajasekhar等,“Postgenomic Global Analysis of TranslationalControl Induced by Oncogenic Signaling,”Oncogene 23:3248-3264(2004)；Rajasekhar等,“Oncogenic Ras and Akt Signaling Contribute to GlioblastomaFormation by Differential Recruitment of Existing mRNAs to Polysomes,”Mol.Cell 12:889-901(2003)；Rojo等,“4E-Binding Protein 1,A Cell SignalingHallmark in Breast Cancer that Correlates With Pathologic Grade andPrognosis,”Clin.Cancer Res.13:81-89(2007)；and Sequeira等,“Inhibition ofeIF2alpha Dephosphorylation Inhibits ErbB2-Induced Deregulation of MammaryAcinar Morphogenesis,”BMC Cell Biol.10:64(2009))。癌基因激活的通路通过激活mTOR的信号传导和翻译起始来提升ER客户蛋白的载量(Hart等,“ER Stress-MediatedAutophagy Promotes Myc-Dependent Transformation and Tumor Growth,”J.Clin.Invest.122:4621-4634(2012)；Ozcan等,“Loss of the Tuberous SclerosisComplex Tumor Suppressors Triggers the Unfolded Protein Response to RegulateInsulin Signaling and Apoptosis,”Mol.Cell 29:541-551(2008)；and Tameire等,“Cell Intrinsic and Extrinsic Activators of the Unfolded Protein Response inCancer:Mechanisms and Targets for Therapy,”Semin.Cancer Biol.33:3-15(2015))。已进一步显示PERK和IRE1α-XBP-1通路有助于适应缺氧和微环境应激(Bi等,“ER Stress-Regulated Translation Increases Tolerance to Extreme Hypoxia and PromotesTumor Growth,”EMBO J.24:3470-3481(2005)；Blais等,“Activating TranscriptionFactor 4is Translationally Regulated by Hypoxic Stress,”Mol.Cell.Biol.24:7469-7482(2004)；Chen等,“XBP1 Promotes Triple-Negative Breast Cancer byControlling the HIF1alpha Pathway,”Nature 508:103-107(2014)；Romero-Ramirez等,“X box-Binding Protein 1Regulates Angiogenesis in Human PancreaticAdenocarcinomas,”Transl.Oncol.2:31-38(2009)；Rouschop等,“The Unfolded ProteinResponse Protects Human Tumor Cells During Hypoxia Through Regulation of theAutophagy Genes MAP1LC3B and ATG5,”J.Clin.Invest.120:127-141(2010)；Schewe等,“ATF6alpha-Rheb-mTOR Signaling Promotes Survival of Dormant Tumor Cells InVivo,”Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.105:10519-10524(2008)；and Ye等,“The GCN2-ATF4Pathway is Critical for Tumour Cell Survival and Proliferation in Response toNutrient Deprivation,”EMBO J.29:2082-2096(2010))，这表明UPR允许对变化的环境进行适应。

PERK的活化可协调抗氧化和自噬应答，从而在失去与基底膜的粘附力的过程中保护乳腺上皮细胞(Avivar-Valderas等,“PERK Integrates Autophagy and OxidativeStress Responses to Promote Survival During Extracellular Matrix Detachment,”Mol.Cell.Biol.31:3616-3629(2011))。该存活应答涉及与抑制mTOR的LKB1-AMPK-TSC2通路的快速活化关联(Avivar-Valderas等,“Regulation of Autophagy during ECMDetachment is Linked to a Selective Inhibition of mTORC1 by PERK,”Oncogene 32(41):4932-40(2013))的ATF4和CHOP转录程序(Avivar-Valderas等,“PERK IntegratesAutophagy and Oxidative Stress Responses to Promote Survival DuringExtracellular Matrix Detachment,”Mol.Cell.Biol.31:3616-3629(2011))。人DCIS病变展示出了增强的PERK磷酸化和自噬(Avivar-Valderas等,“PERK Integrates Autophagyand Oxidative Stress Responses to Promote Survival During ExtracellularMatrix Detachment,”Mol.Cell.Biol.31:3616-3629(2011)and Espina等,“MalignantPrecursor Cells Pre-Exist in Human Breast DCIS and Require Autophagy forSurvival,”PloS One 5:e10240(2010))，并且PERK在乳腺上皮中的条件性消除延迟了由HER2原癌基因引起的乳腺癌变(Bobrovnikova-Marjon等,“PERK Promotes Cancer CellProliferation and Tumor Growth by Limiting Oxidative DNA Damage,”Oncogene 29:3881-3895(2004)and Bobrovnikova-Marjon等,“PERK-Dependent Regulation ofLipogenesis During Mouse Mammary Gland Development and AdipocyteDifferentiation,”Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.105:16314-16319(2008))。此外，HER2能提升肿瘤细胞中的蛋白毒性水平，激活JNK和IRE信号传导并使HER2

休眠的(静息的)肿瘤细胞也被显示依赖于PERK和ATF6信号传导来存活(Ranganathan等,“Dual Function of Pancreatic Endoplasmic Reticulum Kinase inTumor Cell Growth Arrest and Survival,”Cancer Res.68:3260-3268(2008)；Ranganathan等,“Functional Coupling of p38-Induced Up-Regulation of BiP andActivation of RNA-Dependent Protein Kinase-Like Endoplasmic Reticulum Kinaseto Drug Resistance of Dormant Carcinoma Cells,”Cancer Res.66:1702-1711(2006)；and Schewe等,“ATF6alpha-Rheb-mTOR Signaling Promotes Survival of DormantTumor Cells In Vivo,”Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.105:10519-10524(2008))。肝脏中的静息胰腺扩散癌细胞(“DCC”)也展示出了PERK依赖性的UPR，其与E-钙粘蛋白表达的丧失和MHC-1的下调有关，有利于休眠期间的免疫逃避(Pommier等,“Unresolved EndoplasmicReticulum Stress Engenders Immune-Resistant,Latent Pancreatic CancerMetastases,”Science 360(6394):eaao4908(2018)，其全部内容通过引用并入本文)。在MMTV-HER2模型中，还发现骨髓和肺中的静息DCC为E-钙粘蛋白阴性(Harper等,“Mechanismof Early Dissemination and Metastasis in Her2

本公开涉及克服本领域中的缺陷。

本公开的一个方面涉及一种治疗受试者中的微小残留癌的方法。所述方法涉及使受试者中的扩散癌细胞(DCC)与骨形态发生蛋白7(“BMP7”)衍生蛋白接触，其中所述接触在所述受试者的所述被接触的DCC中诱导或维持休眠，以治疗所述受试者中的微小残留癌。这方面的方法可以被用来预防微小残留癌在所述受试者中发展成侵袭性生长。

另一个方面涉及治疗受试者中的微小残留癌的方法，所述方法涉及使受试者中的扩散癌细胞(DCC)与选自LY2、LY3和LY4的蛋白激酶RNA样内质网激酶(“PERK”)抑制剂接触，其中所述接触根除所述受试者中的DCC，以治疗所述受试者中的微小残留癌。

又一个方面涉及一种治疗受试者中的晚期癌症的方法。所述方法涉及使受试者中的扩散癌细胞(DCC)与选自LY2、LY3和LY4的蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)抑制剂接触，其中所述接触根除所述受试者中的DCC，以治疗所述受试者中的晚期癌症。

在下文中，其中证实了LY4作为PERK的选择性和强效抑制剂，能阻止HER2驱动的转移，这得益于其能够特异性引起休眠DCC的消除。如本公开内容所述，PERK抑制剂代表了在微小残留疾病阶段期间一种靶向单一休眠细胞的新策略，其单独或与抗增殖疗法组合施用从而有助于预防致死性转移。下文的描述还证实骨形态发生衍生蛋白可以在已扩散的肿瘤细胞中诱导休眠。

图1A-1C显示了静息的扩散HER2

图2A-2G证实在HER2

图3A-3G显示了在单个扩散的肿瘤细胞水平上，LY4 PERK抑制降低了肺和骨髓中的转移性疾病。图3A为免疫印迹，其显示了PERK抑制剂LY4(2μM)在经血清饥饿过夜并用EGF(100ng/ml)处理15分钟的MCF10A-HER2细胞中对PERK磷酸化(T980)的抑制。在图3B中，每天向MMTV-HER2

图4A-4F显示了LY4处理对转移和循环肿瘤细胞(“CTC”)的作用。图4A显示了赋形剂和LY4处理的动物中的单个宏转移的基准化面积(n＝21和15)。p由Mann-Whitney检验得到。图4B是显示通过对细胞纺锤体进行HER2染色定量循环肿瘤细胞/ml血液的图。图4C显示的图像和图表示出了每个肺切片/动物的P-Rb

图5A-5C证实在Her2

图6A-6C显示了PERK抑制剂LY4在MMTV-HER2

图7A-7F显示了LY4处理对P-PERK水平、P-组蛋白H3水平和肿瘤大小的作用。图7A为用于测定来自赋形剂和LY4处理的动物的MMTV-neu肿瘤裂解物中P-PERK水平的蛋白质印迹。图7B显示了来自赋形剂(上部)和LY4处理的(下部)雌性的肿瘤体积(mm

图8A-8D显示PERK的抑制损害了MMTV-HER2

图9A-9F显示了LY4的处理降低了磷酸化HER2和下游信号传导通路的水平。图9A显示了MMTV-HER2乳腺肿瘤切片中对P-HER2、P-PERK和P-EIF2α的IHC的代表性图像。请注意，P-HER2阳性边缘与P-PERK和P-EIF2α的染色重叠。比例尺，100μm。图9B显示了来自MMTV-HER2雌性的单细胞(原发性乳腺肿瘤)(行)的高通量靶向基因表达(列)图谱的分层聚类。图9C显示了在赋形剂和LY4处理的乳腺肿瘤中的代表性P-HER2和总HER2 IHC染色。该图显示了赋形剂和LY处理的肿瘤中的P-HER2评分。通过IHC强度和面积计分，对肿瘤切片中P-HER2水平的定量(n＝11)(参见图10A)。比例尺，50μm。p由Mann-Whitney检验得到。在图9D中，将MCF10A-HER2细胞饥饿过夜，并进行+/-LY4(2μM)处理，然后在收集前加入+/-EGF(100ng/ml)15分钟。通过蛋白质印迹法评估P-HER2，P-EGFR，P-AKT，P-S6和P-ERK，以及总HER2和EGFR的水平。GAPDH和β-TUB用作上样对照。显示了三者的代表性印迹。P-HER2(n＝3)±s.d.的密度分析。p由学生t检验得到。在图9E中，如图9D中所示处理MCF10A-HER2细胞并执行表面受体生物素化测定。评估了总HER2和P-HER2的表面水平。显示了P-HER2的密度测定。在图9F中，如图9D中所示处理MCF10A-HER2细胞并且执行了可逆表面受体生物素化测定。评估了总HER2和P-HER2的胞吞水平。显示了两次实验中的一个。

图10A-10C显示了MCF10A-HER2细胞中P-HER2水平的定量。图10A显示了用于定量乳腺肿瘤切片中P-HER2水平的评分系统。根据这些代表性图像中显示的确定分数，将IHCP-HER2阳性面积乘以其强度分数。比例尺，100μm。在图10B中，将MCF10A-HER2细胞饥饿过夜，并进行+/-LY4(2μM)处理，然后在收集前加入+/-EGF(100ng/ml)20分钟。通过蛋白质印迹评估P-HER2/Y1112和P-HER2/Y877的水平。GAPDH和HSP90用作上样对照。图10C显示了在表面生物素化测定中使用的提取物输入(input)。

图11A-11E显示，先抑制CDK4/6后抑制PERK增强了LY4的抗转移效应。图11A是体内实验的示意图，该体内实验被设计为在MMTV-neu/HER2

图12A-12G显示了提出的包括使用LY4的单一疗法或组合疗法，并且实验显示，用CDK4/6抑制剂阿贝西尼与LY4组合治疗黑素瘤细胞差异性地影响了2D和3D培养物中的体外细胞活力。图12A是阿贝西尼和LY4组合原理的示意图。图12B是柱状图，显示了用0nM、10nM或50nM阿贝西尼体外处理Braf突变的黑素瘤细胞(WM35)1周，然后用2μM LY4处理48小时的结果。图12C包括在用阿贝西尼预处理1周，然后用2μM LY4处理后用DAPI染色的细胞图像。将5,000个细胞接种在基质胶上。在图12D-12E中，WM35黑色素瘤细胞用阿贝西尼预处理5周，然后经LY4的完全培养基溶液和阿贝西尼处理。细胞用台酚蓝染色以鉴定活细胞。图12D是显示阿贝西尼敏感细胞的图。图12E是显示抗阿贝西尼的细胞的图。图12F显示了在用阿贝西尼预处理5周并用2μM LY4和阿贝西尼共同处理后，用DAPI染色的细胞图像。将1,000个细胞接种在基质胶上。图12G表明，当用阿贝西尼诱导生长停滞时，细胞会上调PERK靶标(GADD34)，这可能解释了为什么细胞对LY4敏感。将对阿贝西尼初始或耐药(R)的WM35黑色素瘤细胞在具有赋形剂(-)或150和300nM阿贝西尼的培养物中处理24小时。然后裂解细胞，并通过蛋白质印记检测GADD34的表达。将微管蛋白(Tubulin)表达用作上样对照。请注意，在阿贝西尼初始细胞中，GADD34被上调，提示PERK的激活。抗性细胞似乎显示出更高水平的GADD34，其在额外的阿贝西尼处理后不会改变或降低。

图13A-13C证实了BMP7-F9对ERK/p38活性比以及与休眠特征基因相关的各种mRNA的效应。图13A显示了如通过蛋白质印迹法在HEp3 HNSCC细胞中确定的，与对照相比，以2ng/ml，5ng/ml和10ng/ml的BMP7-F9处理(分别为第二、第三和第四灰色柱：对照为第一黑色柱)降低了ERK/p38活性比。在2-6和24小时(第二至第四组的柱子)后观察了对ERK/p38活性比的效应。在最初的30分钟内，BMP7(第一柱组)刺激了ERK活性。图13B显示BMP7-F9的处理诱导了编码休眠签名基因的DEC2、p53和p27mRNA(10ng/ml BMP7-F9，24小时)。图13C显示，如通过免疫荧光法(10ng/ml，24小时)测得的，对相同细胞的BMP7-F9处理能诱导NR2F1的核积累，NR2F1是一种潜在的诱导休眠的转录因子。箭头指示NR2F1荧光。图13A和图13B中的差异，通过学生t检验计算得出p<0.05。这些数据支持以下假设，即BMP7-F9是休眠基因的强诱导剂，已发现所述休眠基因在自发性休眠DCC中上调，或经由重编或TGFβ2信号传导在骨髓中被诱导。

图14A-14E显示了体外和体内BMP7-F9如何诱导T-HEp3细胞的生长停滞。图14A显示BMP7-F9对T-HEp3细胞的处理在体外将其增殖抑制了48小时，这通过细胞滴度蓝测定法(RFU，相对荧光单位)确定。图14B为图14C-14D中使用的体内实验方法的示意图。T-HEp3细胞在体外用BMP7-F9预处理24小时，然后接种在鸡胚绒膜尿囊膜(“CAM”)上(图14C)，其中每天将它们用赋形剂或BMP7-F9(50ng/ml)进行体内处理，然后收集肿瘤并定量HEp3 HNSCC细胞的数量(图14D)和P-H3的水平(图14E)。图14E中的箭头指示重叠的P-H3和DAPI荧光。这些数据支持以下假设：在图13B中识别出的休眠标志物与在CAM系统中的短期实验中的体外和体内生长抑制相关。

图15A-15C显示了在疾病小鼠模型中对BMP7-F9处理的评估。图15A是用于评估BMP7-F9对转移开始作用的体内实验方法的示意图。HEp3-GFP HNSCC肿瘤长至约300mm

本文公开了治疗受试者中微小残留癌的方法。本公开内容的一个方面涉及一种治疗受试者中微小残留癌的方法。该方法涉及使受试者中的扩散癌细胞(DCC)与骨形态发生蛋白7(BMP7)衍生蛋白接触。使受试者中的扩散癌细胞(DCC)与骨形态发生蛋白7(BMP7)衍生蛋白接触，可以在所述受试者的所述被接触的DCC中诱导或维持休眠，从而治疗所述受试者的微小残留癌。

如本文所用，短语“微小残留癌”包括这样的情况或病症，其中通过标准的放射线照相和组织学标准，缺乏受试者中具有癌症的证据，但是其中所述受试者实际上在血液(如CTC)或骨髓或淋巴结(如DTC)具有残留的癌细胞(即，DCC)。微小残留癌可能会发生在用化学疗法、手术和/或放射疗法治疗癌症之后。标准的射线照相和组织学检测方法可包括，例如，成像检测(X射线，超声，MRI)；对已知的肿瘤标志物或循环肿瘤标志物如PSA进行血液或免疫化学测试；测试活组织检查或细胞学标本中的已知肿瘤标志物，以评估例如存在的肿瘤细胞数量或此类细胞的相对稀有性。

在本领域中众所周知，肿瘤细胞可以以CTC和DTC的形式早期从原发性肿瘤扩散。实际上，已经在肿瘤手术后没有疾病证据的受试者中鉴定出了DTC。在癌症病史未能排除捐献器官的罕见情况下，即使捐献者无疾病长达30年，接受者也发生了捐献者源性的转移(MacKie等,“Fatal Melanoma Transferred in a Donated Kidney 16 Years afterMelanoma Surgery,”N.Engl.J.Med.348:567-568(2003)，其全部内容通过引用并入本文)。

对个体患者内的转移的肿瘤系统发生学和全基因组测序表明了原发性肿瘤向转移以及转移向转移的传播，这提供了证据证明连续性/线性生长模型不能解释个体患者中的后期(10年以上)复发(Gundem等,“The Evolutionary History of Lethal MetastaticProstate Cancer,”Nature 520:353-357(2015)and Naxerova等,“Using TumourPhylogenetics to Identify the Roots of Metastasis in Humans,”Nature ReviewsClinical Oncology 12:258-272(2015)，其全部内容通过引用并入本文)。

单细胞CTC分析也显示了CTC与原发性肿瘤之间的遗传谱系关联(Ni等,“Reproducible Copy Number Variation Patterns Among Single Circulating TumorCells of Lung Cancer Patients,”PNAS 110(52):21083-88；Heitzer等,“Complex TumorGenomes Inferred from Single Circulating Tumor Cells by Array-CGH and Next-Generation Sequencing,”Cancer.Res.73:2965-75(2013)；and Lohr等,“Whole-ExomeSequencing of Circulating Tumor Cells Provides a Window into MetastaticProstate Cancer,”Nature Biotech.32:479-484(2014)，其全部内容通过引用并入本文)。

此外，在人类中，CTC/DTC与原发癌的分期或大小无关(Krishnamurthy等,“Detection of Minimal Residual Disease in Blood and Bone Marrow in EarlyStage Breast Cancer,”Cancer 116(14):3330-3337(2010),其全部内容通过引用并入本文)。相反，CTC和DTC被认为保留了形成转移/复发疾病的能力。特别是，CTC和DTC的检测已被证明可预测乳腺癌和前列腺癌中的转移和复发(Braun等,“A Pooled Analysis of BoneMarrow Micrometastasis in Breast Cancer,”NEJM 353:793-802(2005)；Hayes等,“Circulating Tumor Cells at Each Follow-up Time Point During Therapy ofMetastatic Breast Cancer Patients Predict Progression-Free and OverallSurvival,”Clin.Cancer Res.12(14):4218-4224(2006)；and de Bono等,“CirculatingTumor Cells Predict Survival Benefit from Treatment in Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer,”Clin.Cancer Res.14:6302-6309(2008)，其全部内容通过引用并入本文)。

转移被认为是由增殖的DCC和已经经历了再活化的休眠的DCC引起的。考虑到患者可以在肿瘤切除后数年发展出转移灶，因此认为休眠的DCC可能是导致癌症晚期复发的主要因素。如本文所用，术语“休眠”是指暂时的有丝分裂及生长停滞，其被定义为细胞休眠，在这类休眠中内在和/或外在机制驱使单个DCC或DCC小群体进入静息(可逆的生长停滞)。休眠性病变的第二种类型是血管生成性休眠，在这类休眠中分裂细胞和由于不良血管形成而死亡的细胞之间的平衡使得肿瘤块保持恒定。第三类是免疫介导的休眠，在这类休眠中免疫系统通过持续的细胞毒活性使增殖的肿瘤块保持恒定，所述持续的细胞毒活性持续降低正在生长的癌细胞的数量(参见，例如，Sosa等,“Mechanisms of Disseminated CancerCell Dormancy:An Awakening Field,”Nat.Rev.Cancer 14(9):611-622(2014),其全部内容通过引用并入本文)。休眠细胞可能来自既定的原发性肿瘤、继发性肿瘤和/或浸润前病变。

在本文公开的方法的一个实施方案中，被接触的DCC为休眠的癌细胞，这意味着所述癌细胞正在经历暂时的有丝分裂/生长停滞或衰退样行为。

通过进行阴性选择消除造血谱系细胞，然后对EpCAM或CK8/18进行阳性染色，可以检测到骨髓抽吸物中的DCC。在组合的条件下，可以对细胞进行休眠标志物的染色，以确定它们是处于增殖状态还是休眠状态。后者可以在固定后进行。为了进行全基因组或全转录组分析，将来自骨髓的EpCAM阳性DCC进行活体分离，并进行全基因组或转录组分析(

本文所述的方法可以进一步涉及在所述接触之前检测所述受试者中的DCC的存在。如下表1所示，休眠的DCC是可以识别的，因为它们在表型上可与其他细胞类型区分开(Sosa等,“Mechanisms of Disseminated Cancer Cell Dormancy:An Awakening Field,”Nat.Rev.Cancer 14(9):611-622(2014),其全部内容通过引用并入本文)。

表1.DCC标志物

已经在术前13-72％的前列腺癌患者和术后5年以上20-57％的无疾病证据患者的骨髓中鉴定出了DTC(Morgan等,“Disseminated Tumor Cells in Prostate CancerPatients after Radical Prostatectomy and without Evidence of Disease PredictsBiochemical Recurrence,”Clin.Cancer Res.15:677-683(2009)and Weckermann等,“Perioperative Activation of Disseminated Tumor Cells in Bone Marrow ofPatients with Prostate Cancer,”J.Clin.Oncol.27(10):1549-56(2009),其全部内容通过引用并入本文)。DTC的检测可预示在具有临床休眠的患者中复发。

如本文所用，短语“临床休眠”是指从原发肿瘤去除到疾病复发之间的较长的临床无疾病时间(例如，大于5年)。临床休眠在前列腺癌、乳腺癌、食道癌、肾癌、甲状腺癌、B细胞淋巴瘤和黑色素瘤中很常见(Lam等,“The Role of the Microenvironment–DormantProstate Disseminated Tumor Cells in the Bone Marrow,”Drug Discov.TodayTechnol.11:41-47(2014)；Gelao等,“Tumour Dormancy and Clinical Implications inBreast Cancer,”Ecancermedicalscience 7:320(2013)；Ellis等,“Detection andIsolation of Prostate Cancer Cells from Peripheral Blood and Bone Marrow,”Urology 61:277-281(2003)；Morgan等,“Disseminated Tumor Cells in ProstateCancer Patients after Radical Prostatectomy and without Evidence of DiseasePredicts Biochemical Recurrence,”Clin.Cancer Res.15:677-683(2009)；andPfitzenmaier等,“Telomerase Activity in Disseminated Prostate Cancer Cells,”BJU Int.97:1309-1313(2006)，其全部内容通过引用并入本文)，并且驻留在远处的器官中，包括骨骼，淋巴结，肝脏和肺，在那里它们可以保持一段较长时间(例如，大于10年)的休眠状态，直到在某些患者发生临床转移。

在实施本文描述的方法的一些实施方案中，所述受试者已经被诊断出患有CTC。

在实施本文描述的方法的一些实施方案中，所述受试者已经被诊断出患有DTC和/或非转移性癌症。

如本文所用，“受试者”为，例如，患者如癌症患者，并且包括任何动物，但是优选哺乳动物。在一个实施方案中，所述受试者为人受试者。合适的人受试者包括，但不限于，已被诊断患有扩散癌细胞和/或非转移性癌症的儿童、成人和老年受试者。

在其他实施方案中，所述受试者可以是牛、羊、猪、猫、马、鼠、犬、兔等。

在实施本文描述的方法过程中，使受试者中的DCC接触以诱导或维持DCC的休眠。这意味着在DCC中建立持续的非增殖状态或在DCC中继续非增殖状态。

在一个实施方案中，在已经诊断出患有癌症的受试者中治疗微小残留癌。例如，但不限于，所述受试者已经被诊断出患有以下中的一种或多种癌症：乳腺癌、多发性骨髓瘤、肺癌、非小细胞肺癌、脑癌、宫颈癌、套细胞淋巴瘤、白血病、肝细胞癌、前列腺癌、尿道和皮肤黑色素瘤、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤和结直肠癌。

其他癌症也可能适合用本文描述的方法治疗。

在一个实施方案中，在受试者中治疗与乳腺癌有关或与之相关的微小残留癌。所述乳腺癌可以选自以下中的一种或多种：浸润性乳腺癌、导管原位癌(DCIS)、小叶原位癌(LCIS)和炎性乳腺癌。

多种分子因子可用于对乳腺癌进行分子分类，包括激素受体和人表皮生长因子受体2(HER2)的状态。HER2和基底样基团是在激素受体阴性乳腺癌中鉴定出的主要分子亚型(Schnitt,“Classification and Prognosis of Invasive Breast Cancer:FromMorphology to Molecular Taxonomy,”Modern Pathology 23:S60-S64(2010),其全部内容通过引用并入本文)。在一个实施方案中，所述乳腺癌为HER2

在本文描述的方法的一些实施方式中，所述受试者已经进行了手术切除以去除肿瘤。例如，所述受试者可能已经经历了以下中的一种或多种：乳房切除术、前列腺切除术、皮肤病灶去除、小肠切除术、胃切除术、开胸手术、肾上腺切除术、阑尾切除术、结肠切除术、卵巢切除术、甲状腺切除术、子宫切除术、舌状切除术、结肠息肉切除术和结肠直肠切除术。

在本文描述的方法中，使受试者中的扩散癌细胞(DCC)与骨形态发生蛋白7(BMP7)衍生蛋白接触。BMP7是TGFβ超家族的成员，其分泌自骨髓基质成骨细胞且可能会影响DCC/DTC的微环境。BMP7在间充质细胞向骨和软骨的转化中起关键作用，并且已显示能可逆地诱导前列腺癌干细胞样细胞的衰退(Kobayashi等,“Bone Morphogenetic Protein 7inDormancy and Metastasis of Prostate Cancer Stem-Like Cells in Bone,”J.Exp.Med.208(13):2641-55(2011),其全部内容通过引用并入本文)。前-BMP7是前体-BMP7和成熟BMP7之间的中间体，它是通过对前-蛋白质进行蛋白水解处理而生成的，其生成成熟同型二聚体的亚基。

人BMP7蛋白是TGF-β超家族中的一种分泌信号分子，最初因其能够诱导骨形成而被鉴定出来，但后来被公认为是一种能介导许多不同细胞类型的生长和分化的多功能细胞因子。人BMP7蛋白在细胞中被表达成由292个氨基酸组成的前体蛋白，并且通过蛋白水解去除信号肽和前-肽产生成熟的、具有生物学活性的BMP7。包含信号肽(前29个氨基酸)、前-结构域和成熟肽(粗体)的野生型人BMP7蛋白氨基酸序列表示为SEQ ID NO：1，如下所示：

本领域普通技术人员应当理解，可以通过蛋白水解切割除去所述信号肽，从而产生完整的前-结构域/成熟肽，其被称为前-BMP7。

野生型人成熟BMP7是由两个糖基化的、139个氨基酸二硫键连接的、约35kDa的同二聚体蛋白组成的二聚体。每个同二聚体蛋白具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列：

人BMP7蛋白的变体包括SEQ ID NO：2所示的人成熟BMP7的变体，在SEQ ID NO：3所示的共有序列中指出了特定的氨基酸变化：

与野生型成熟人BMP7蛋白相比，本公开所述的人成熟BMP7蛋白的特定变体具有升高的特异性活性、改善的溶解度特性、改善的生物利用度、与内源性循环抑制剂降低的结合、和/或降低的EBF活性。

人BMP7蛋白的合适变体选自下组：F93V/N110G；Y65G/I86L/T89A/N110G；Y65G/I86L/N110G/Y128F；Y65G/I86L/N110G/Y128W；Y65G/I86L/F93V/N110G/Y128W(BMP7-F9)；Y65G/T89A/N110G/Y128F；Y65G/I86L/N110G；和Y65G/V114M(参见下表2)。

表2.人BMP7的示例性变体

在一个实施方案中，BMP7的变体选自下组：Y65G/I86L/N110G/Y128W和Y65G/I86L/F93V/N110G/Y128W。

在一个实施方案中，所述BMP7衍生物为前-BMP7的改造的BMP7变体。所述前-BMP7的改造的变体可以在对应于BMP7成熟蛋白结构域的氨基酸位置上包含氨基酸取代。可以将前-BMP7的改造的变体加工成成熟的BMP7衍生蛋白。包含与所述人成熟BMP7蛋白变体N端融合的前-结构域的前-BMP7的合适的变体选自下组：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16，如表3所示。

表3.人前-BMP7的示例性变体

用于本文描述的方法的合适的BMP7衍生物蛋白包括人前体-BMP7的变体(即SEQID NO：1)。

在一个实施方案中，所述BMP7衍生蛋白是与成熟的野生型BMP7蛋白相比具有增强的生物活性(例如，高达大于50倍或更多倍的生物活性)和生物物理特性(例如，增强的溶解性和稳定性)的成熟BMP7蛋白。

在另一个实施方案中，所述BMP7衍生物为BMP7-F9(SEQ ID NO：8)。

本文提及的野生型BMP7蛋白或其变体，包括提及的SEQ ID NO.，是指同二聚体，其中每个单体亚基具有确定的序列。例如，提及BMP7-F9(SEQ ID NO：8)是指这样的同二聚体：其中每个单体亚基具有SEQ ID NO：8所示的序列，并且所述亚基通过一个或多个二硫键连接。

对于本文所述的功能测定法，用特定的前-BMP7蛋白或其变体治疗或者施用是指用特定的成熟BMP7的同型二聚体治疗或者施用，所述特定的成熟BMP7即野生型或其变体，所述同型二聚体通常与野生型人前-结构域处于非共价复合物的状态下。

根据本文所述的方法，可以通过将所述BMP7衍生蛋白施用给受试者来进行接触。

BMP7对受试者的作用可能取决于BMP受体2(BMPR2)，其表达已显示与前列腺癌患者的复发和骨转移呈负相关(Kobayashi等,“Bone Morphogenetic Protein 7 inDormancy and Metastasis of Prostate Cancer Stem-Like Cells in Bone,”J.Exp.Med.208(13):2641-55(2011),其全部内容通过引用并入本文)。因此，在一个实施方案中，在受试者中接触的DCC为骨形态发生蛋白受体阳性(BMPR

本文所述的方法可以进一步包括向所述受试者施用化学治疗剂、免疫治疗剂、表观遗传剂或电离辐射。

如本文所用，术语“化学治疗剂”是指合成的、生物的或半合成的化合物，其不是酶并且其能杀死癌细胞或抑制癌细胞的生长，同时对非癌性细胞的影响较小。可以使用任何合适的化学治疗剂。

合适的化学治疗剂包括，但不限于，蒽环类、紫杉烷、激酶抑制剂、抗体、氟嘧啶和铂类药物。示例性的蒽环类药物包括，但不限于，阿霉素、柔红霉素、表柔比星、米托蒽醌和伊达比星。示例性的紫杉烷包括，但不限于，多西紫杉醇和紫杉醇。示例性的激酶抑制剂包括，但不限于，拉帕替尼、甲磺酸伊马替尼和吉非替尼。示例性的抗体包括，但不限于，阿仑单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、利妥昔单抗、曲妥珠单抗和异丁珠单抗替西坦。示例性的氟嘧啶包括，但不限于，5-氟尿嘧啶、卡培他滨、替加氟、替加氟-尿嘧啶、氟尿苷、5-氟脱氧尿苷和S-1。示例性的铂类药物包括，但不限于，顺铂、卡铂、奥沙利铂和奈达铂。

其他合适的化学治疗剂包括，但不限于，烷基化剂(例如，二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、噻替帕、六甲基三聚氰胺、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲霉素、去卡巴嗪、雌莫司汀、链霉菌素和替莫唑胺(temozolomide)、长春花生物碱(例如长春碱、长春新碱和长春瑞滨)、鬼臼毒素(例如依托泊苷和替尼泊苷)、抗生素(例如博来霉素、放线菌素、丝裂霉素和缬草苷)和喜树碱类似物(例如伊立替康或托泊替康)。

在一些实施方案中，所述化学治疗剂为选自曲妥珠单抗

如本文所用，术语“免疫治疗剂”是指能够在受试者中诱导或增强免疫应答的试剂。在癌症背景下，免疫治疗剂可刺激免疫系统更有效地靶向癌细胞。合适的免疫治疗剂可以选自免疫检查点抑制剂、干扰素和肿瘤疫苗。

免疫检查点抑制剂是抑制免疫检查点参与的化合物。示例性的免疫检查点调节剂包括PD-1抑制剂(例如派姆单抗(Pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab))、PD-L1抑制剂(例如阿特朱单抗(atezolizumab)、avelumab和德瓦鲁单抗(durvalumab))和CTLA-4抑制剂(例如伊匹单抗(ipilimumab))。

干扰素(“IFN”)是通过对靶细胞的直接效应和通过激活免疫应答而保护免于疾病侵害的细胞因子家族。IFN可以产生于并作用于肿瘤细胞和免疫细胞。I型IFN包括IFNα蛋白、IFNβ、IFNε、IFNκ和IFNω。已知I型IFN介导抗多种恶性肿瘤的抗肿瘤效应(Moschos等,Interferons in the Treatment of Solid Tumors,”Cancer Treat.Res.126:207–241(2005),其全部内容通过引用并入本文)。

如本文所用，术语“肿瘤疫苗”是指在受试者中刺激产生针对肿瘤或癌细胞的免疫应答的组合物。肿瘤疫苗通常由对所述受试者来说可能是自体的(来自自身)或同种异体的(来自其他的)癌症相关物质或细胞(抗原)来源，以及其他成分(例如佐剂)组成，所述其他成分进一步刺激和加强对抗原的免疫应答。肿瘤疫苗可导致刺激受试者的免疫系统产生针对一种或几种特定抗原的抗体，和/或产生杀伤性T细胞以攻击具有那些抗原的癌细胞。

如本文所用，术语“表观遗传剂”是指在这样的试剂：在与这种试剂接触时或接触后，或者这种试剂施用时或施用后，能改变细胞DNA的表观遗传状态(例如，甲基化状态)的试剂。

合适的表观遗传剂可以选自，例如，组蛋白脱乙酰基酶(“HDAC”)抑制剂、5-氮杂胞苷、视黄酸、三氧化二砷、Zeste 2多梳抑制复合物2亚单位增强子(EZH2)抑制剂、溴结构域(“BRD”)抑制剂，及其衍生物。

示例性的HDAC抑制剂包括，但不限于，曲古抑菌素A、曲霉毒素B、苯甲酰胺、苯基丁酸酯、丙戊酸、伏立诺他(vorinostat)、贝利诺司他(belinostat)、LAQ824、帕比司他(Panobinostat)、恩替司他、CI994和莫塞替诺特(mocetinostat)。

示例性的EZH2抑制剂包括，但不限于，3-deazaneplanocin A(DZNep)、EPZ005687、GSK126、EI1、UNC1999和EPZ-6438(Kim等,“Targeting EZH2 in Cancer,”Nat.Med.22(2):128-134(2016),其全部内容通过引用并入本文)。

示例性的溴结构域抑制剂包括，但不限于，JQ1、I-BET151/762、PF-1和RVX-208(Wadhwa等,“Bromodomain Inhibitor Review:Bromodomain and Extra-terminal FamilyProtein Inhibitors as a Potential New Therapy in Central Nervous SystemTumors,”Cureus 8(5):e620(2016),其全部内容通过引用并入本文)。

其他示例性表观遗传剂包括DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂，包括但不限于，氮杂胞苷和地西他滨。

DCC/DTC微环境在增强休眠中起关键作用。核受体亚家族2F组成员1(NR2F1)是核激素受体和转录调节因子，其是构成肿瘤细胞休眠特征的转录因子网络中的关键节点。当应用于雌激素受体阳性(ER

在头颈部鳞癌细胞(HNSCC)患者源性异种移植(PDX)模型中，已显示NR2F1能在进行肿瘤手术后上调并诱导局部和远处残余肿瘤细胞的休眠(Sosa,“Dormancy Programs asEmerging Antimetastasis Therapeutic Alternatives,”Mol.Cell.Oncol.3(1):e1029062(2016),其全部内容通过引用并入本文)。NR2F1表达的可塑性表明，残留肿瘤细胞的表观基因组的变化可能受外部和内部信号控制，并决定了DCC的命运。已显示NR2F1可能通过调节染色质重编程来限制诱导的多能干细胞(iPS)的重编程(Onder等,“ChromatinModifying Enzymes as Modulators of Reprogramming,”Nature 483(7391):598-602(2012),其全部内容通过引用并入本文)。NR2F1也是维持休眠肿瘤细胞中全局抑制性染色质的关键，同时还允许特定休眠基因的启动子(包括其自身的启动子)中存在活跃的染色质状态(Sosa等,“NR2F1 Controls Tumour Cell Dormancy via SOX9-and RARbeta-DrivenQuiescence Programmes,”Nat.Commun.6:6170(2015),其全部内容通过引用并入本文)，这强调了存在由NR2F1和微环境线索调控的精心设计的表观遗传程序，导致了肿瘤细胞的休眠。在一个实施方案中，所述DTC为NR2F1

已经显示DCC能表达高水平的PERK通路活化(Bragado等,“MicroenvironmentsDictating Tumor Cell Dormancy,”Recent Results Cancer Res.195:25-39(2012)；Sosa等,“Regulation of Tumor Cell Dormancy by Tissue Microenvironments andAutophagy,”Adv.Exp.Med.Biol.734:73-89(2013)；Goswami等,“The Phosphoinositide3-Kinase/Akt1/Par-4 Axis:A Cancer-Selective Therapeutic Target,”Cancer Res.66(6):2889-92(2006)；and Schewe等,“ATF6alpha-Rheb-mTOR Signaling PromotesSurvival of Dormant Tumor Cells in vivo,”PNAS 105(30):10519-24(2008)，其全部内容通过引用并入本文)，其介导ISR。通过PERK和EIF2α磷酸化的ISR信号传导导致总体翻译的减少，以及基因特异性翻译、氧化应激和ROS产生的增加，蛋白质降解，RNA降解，自噬和脂质生物合成，这可能有助于肿瘤细胞的存活。

另一个方面涉及一种治疗受试者中微小残留癌的方法，所述方法包括使受试者中的扩散癌细胞(DCC)与选自LY2、LY3和LY4的蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)抑制剂接触，其中所述接触根除所述受试者中的DCC以治疗所述受试者中的微小残留癌。

在一个实施方案中，所述DCC具有磷酸化PERK活性。因此，所述方法可以进一步包括使所述受试者中的DCC与PERK抑制剂、MEK抑制剂、CDK4/6抑制剂或其任意组合接触。

根据本文描述的方法的一个实施方案，可以通过向所述受试者施用PERK抑制剂来进行接触。

在一个实施方案中，所述PERK抑制剂为式(I)所示的化合物

其中R选自下组，或其药学上可接受的盐：

X为CH或N；

R

R

在另一个实施方案中，所述PERK抑制剂为式(Ia)所示的化合物

其中R选自下组，或其药学上可接受的盐：

X为CH或N；

R

R

当所述抑制剂为式(I)或式(Ia)所示的化合物时，R可以是

如本文所用，术语“烷基”是指脂肪族烃基，所述脂肪族烃基可以为直链或支链，在链中具有约1至约6个碳原子或1至约3个碳原子(或者以“C

术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。在一个实施方案中，卤素是氟。

在上下文允许的情况下，术语“一种或多种化合物”和等同表达是指本文所述的化合物，所述表达包括前药、药学上可接受的盐、氧化物和溶剂化物，例如，水合物。

本文所述的化合物可包含一个或多个不对称中心，因此可产生对映异构体、非对映异构体和其他立体异构形式。每个手性中心可以根据绝对立体化学定义为(R)-或(S)-。本发明旨在包括所有这些可能的异构体，及其混合物，包括外消旋和光学纯的形式。旋光的(R)-和(S)-、(-)-和(+)-、或(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术拆分。还应当包括所有互变异构形式。

对“化合物”的引用旨在包括该化合物的盐、溶剂化物、氧化物和包合物以及该化合物的任何此类形式的任何立体异构形式或混合物，其比例为任何比例。因此，根据一些实施方案，以盐的形式提供本文所述的化合物，包括在药物组合物、治疗方法和化合物本身的上下文中所述的化合物。

术语“溶剂化物”是指固态的化合物，其中合适的溶剂分子被引入晶格中。用于治疗性施用的合适的溶剂在所施用的剂量下是生理可耐受的。用于治疗性施用的合适的溶剂的实例为乙醇和水。当水为溶剂时，溶剂化物称为水合物。通常，通过将化合物溶解在适当的溶剂中并通过冷却或使用反溶剂分离溶剂化物来形成溶剂化物。溶剂化物通常在环境条件下干燥或共沸。

包合物在Remington,The Science and Practice of Pharmacy,19th Ed.1:176-177(1995)中由描述，该文献的全部内容通过引用并入本文。最常用的包合物是具有环糊精的包合物，并且所有天然和合成的环糊精复合物均被本发明特别涵盖。

术语“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒酸或碱(包括无机酸和碱以及有机酸和碱)制得的盐。

术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合用于与人和低等动物的细胞接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏性反应等，并且与合理的收益/风险比相当。

合适的PERK抑制剂可以选自LY2、LY3、LY4及其组合(参见下表4)。PERK抑制剂可以是LY2、LY3和/或LY4的药学上可接受的盐。

表4.示例性的PERK抑制剂

在一些实施方案中，与不抑制EIF2AK1、EIF2AK2或EIF2AK4的PERK抑制剂进行接触。

在一个实施方案中，所述PERK抑制剂不抑制AXL。根据该实施方案，所述PERK抑制剂选自LY3和LY4。

在另一个实施方案中，所述PERK抑制剂不抑制Flt3、MNK2或NTRK。根据该实施方案，所述PERK抑制剂为LY4。

在一个实施方案中，通过向所述受试者施用MEK抑制剂来进行接触。示例性的MEK抑制剂是本领域众所周知的并且包括，例如，PD184352、PD318088、PD98059、PD334581、RDEA119/BAY 869766(参见，例如，Iverson等,“RDEA119/BAY 869766:A Potent,Selective,Allosteric Inhibitor of MEK1/2for the Treatment of Cancer,”CancerRes.69(17):6839-47(2009)，其全部内容通过引用并入本文)。

在另一个实施方案中，通过向所述受试者施用CDK4/6抑制剂来进行接触。示例性的CDK4/6抑制剂在本领域中是众所周知的，并且包括例如阿贝西利(LY2835219)、帕博西尼(Palbociclib)(PD0332991)和瑞博西尼(ribociclib)(LEE011)。

在一个实施方案中，所述方法可以进一步涉及在所述接触之前选择没有疾病迹象的受试者。例如，所述受试者可以在所述接触之前处于癌症缓解中。

在实施本文描述的方法中，在受试者中治疗微小残留癌。这样的治疗可以包括，但不限于，向需要最小残留癌治疗的受试者施用一种或多种能有效治疗所述受试者的所述疾病(即，癌症或微小残留癌)的化合物。

在一个实施方案中，本公开所述的治疗方法在能有效诱导扩散肿瘤细胞(“DTC”)中的休眠和/或诱导休眠DTC的死亡的条件下进行。

在实施本公开所述的治疗方法中，向受试者施用化合物可以涉及以治疗有效量施用包含所述化合物(即，本公开所述的BMP7衍生蛋白和PERK抑制剂)的药物组合物，所述治疗有效量是指能有效治疗所述受试者的所述病症和/或疾病的化合物的量。这样的量通常根据本领域普通技术人员的能力范围内的许多因素而变化。这些包括，但不限于，特定的受试者，以及所述受试者的年龄、体重、身高、一般身体状况和病史，所用的特定化合物，以及配制它的运载体和为之选择的给药途径；治疗的时间或持续时间；以及所治疗的病症的性质和严重性。

施用通常涉及施用药学上可接受的剂型，其是指本文所述化合物的剂型并且包括，例如，片剂、糖衣丸、散剂、e剂(elixir)、糖浆、液体制剂、包括混悬剂、喷雾剂、吸入剂、片剂、锭剂、乳剂、溶液剂、颗粒剂、胶囊剂和栓剂，以及用于注射的液体制剂，包括脂质体制剂。技术和配方通常可以在Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack PublishingCo.,Easton,Pa.,最新版中找到，所述文献的全部内容通过引用并入本文。

在实施本公开所述的治疗方法中，所述药物(即，本公开所述的BMP7衍生蛋白和PERK抑制剂)可以任何合适的量包含在任何合适的运载体物质中。药物可以以占组合物总重量的高达99重量％的量存在。可以以适合以下途径的剂型提供组合物：口服、肠胃外(例如静脉内，肌肉内)、直肠、皮肤、鼻腔、阴道，吸入、皮肤(贴剂)或眼内给药。因此，组合物可以是以下剂型：例如，片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、包括水凝胶的凝胶剂、糊剂、软膏剂、乳膏、膏药、滴剂、渗透递送装置、栓剂、灌肠剂、注射剂、植入物、喷雾剂或气雾剂。

根据本公开所述的药物组合物可以被配制成在施用后立即或在施用后的任何预定时间或时间段大量释放活性药物。

控释制剂包括(i)在很长的时间段内在体内产生基本恒定浓度的药物的制剂；(ii)在预定的滞后时间后，在很长的时间段内在体内产生基本恒定浓度的药物的制剂；(iii)通过在体内维持相对恒定的有效药物水平并同时使与所述活性药物物质的血浆水平的波动相关的不良副作用最小化，从而在预定时间段内维持药物作用的制剂；(iv)通过例如在患病的细胞、组织或器官附近或里面空间放置控释组合物来定位药物作用的制剂；和(v)通过使用运载体或化学衍生物将药物递送至特定靶细胞类型来靶向药物作用的制剂。

在以下情形下优选以控释制剂形式进行给药：其中药物具有(i)狭窄的治疗指数(即导致有害副作用或毒性反应的血浆浓度与导致产生治疗效应的血浆浓度药物之间的差异很小；通常，治疗指数(TI)定义为是中值致死剂量(LD50)与中值有效剂量(ED50)的比值)；(ii)狭窄的胃肠道吸收窗；(iii)非常短的生物半衰期，以至于需要在一天中频繁给药，以将血浆水平维持在治疗水平。

可以采用多种策略中的任何一种来获得控制释放，在所述控制释放中所讨论药物的释放速率大于代谢速率。可以通过适当选择各种制剂参数和成分，包括例如各种类型的控释组合物和包衣，来获得控释。因此，将药物与适当的赋形剂一起配制为药物组合物，所述药物组合物在施用后会以受控方式释放所述药物(单个或多个单位片剂或胶囊组合物、油溶液剂、混悬剂、乳剂、微胶囊、微球、纳米颗粒、贴剂、和脂质体)。

因此，根据本公开所述的方法进行的施用可以通过以下方式进行：口服、局部施用、透皮施用、肠胃外施用、皮下施用、静脉内施用、肌肉内施用、腹膜内施用、通过鼻内滴注、通过腔内或膀胱内滴注、眼内施用、动脉内施用、病灶内施用、或通过粘膜给药。化合物可以单独施用或与合适的药物运载体一起施用，并且可以是固体或液体形式，例如片剂、胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂或乳剂。

药物(即，本公开的BMP7衍生物蛋白和PERK抑制剂)可以口服施用，例如与惰性稀释剂一起口服施用，或与可吸收的可食用运载体一起口服施用，或者可以封闭在硬或软壳胶囊中口服施用，或者可以压制成片剂口服施用，或者可以随餐混合口服施用。对于口服治疗性施用，可以将药物与赋形剂结合并以片剂、胶囊剂、e剂(elixir)、混悬剂、糖浆剂等形式使用。这样的组合物和制剂应包含至少0.001％的活性化合物。当然，这些组合物中化合物的百分比可以变化，并且可以方便地在单元重量的约0.01％至约10％之间。在这样的治疗有用的组合物中活性化合物的量使得能够获得合适的剂量。在一个实施方案中，制备组合物以使得口服剂量单位包含约1μg至1g的活性化合物。

片剂、胶囊剂等还可包含粘合剂，例如黄蓍树胶，阿拉伯胶，玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉，马铃薯淀粉，海藻酸；润滑剂，例如硬脂酸镁；和甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精。当剂量单位形式为胶囊剂时，其除上述类型的材料外，还可包含液体运载体，例如脂肪油。

各种其他材料可以作为涂层存在或用于改变剂量单位的物理形式。例如，片剂可以用虫胶、糖或两者进行包衣。除活性成分外，糖浆还可包含蔗糖作为甜味剂，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂，染料，以及调味剂如樱桃味或橙味调味剂。

也可以肠胃外施用治疗剂。可以在水中以适当的方式与表面活性剂例如羟丙基纤维素混合来制备溶液或悬浮液。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散液。示例性的油为石油、动物、植物或合成源性的油，例如花生油、大豆油或矿物油。通常，水、盐水、水性右旋糖和相关的糖溶液，以及乙二醇类如丙二醇、透明质酸及其衍生物、羧甲基纤维素和其他可溶性多糖衍生物，或聚乙二醇是优选的液体运载体，特别对于可注射溶液来说更是如此。在普通的储存和使用方法下，如果这些制剂不是以无菌方式生产的话，则它们含有防腐剂以防止微生物的生长。

适用于注射用途的药物形式包括无菌的水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。所述形式必须是无菌的，并且必须以易于注射的程度流动。它必须在制造和储存的条件下是稳定的，并且必须受到保护，以免受微生物如细菌和真菌的污染。运载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、其合适的混合物以及植物油。

还可以将治疗剂以气雾剂的形式直接施用至气道。对于用作气雾剂，可以将治疗剂的溶液或混悬液与合适的推进剂一起包装在加压的气雾剂容器中，所述推进剂例如，与常规助剂一起的烃类推进剂如丙烷、丁烷或异丁烷。治疗剂也可以以非加压形式例如在喷雾器或雾化器中进行施用。

在一个实施方案中，施用可使受试者中可检测的休眠DCC的量提升至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。

在另一个实施方案中，施用可使受试者中可检测的DCC的量减少至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。

在本公开的上下文中，“治疗”是指在受试者中维持没有症状性疾病(例如，癌症)的证据。

在一个实施方案中，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”特别表示消除受试者中的微小残留癌。术语治疗包括在DCC中诱导休眠。术语治疗还包括消除所述受试者中的休眠DCC。术语治疗还包括减少受试者中可检测到的休眠DCC的量或数量。

本公开的另一个方面涉及治疗受试者中的微小残留癌的方法。该方法涉及使受试者中的扩散癌细胞(DCC)与选自LY2、LY3和LY4的蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)抑制剂接触，其中所述接触根除所述受试者中的DCC以治疗所述受试者中的微小残留癌。

如上所述，本公开所述的方法适合于在已经诊断出患有以下中的一种或多种疾病的受试者中治疗微小残留癌：乳腺癌、多发性骨髓瘤、肺癌、非小细胞肺癌、脑癌、宫颈癌、套细胞淋巴瘤、白血病、肝细胞癌、前列腺癌、黑素瘤、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、结直肠癌和其他癌症。

癌症可以是选自以下的的乳腺癌：浸润性乳腺癌、导管原位癌(DCIS)、小叶原位癌(LCIS)和炎性乳腺癌。

在一个实施方案中，所述乳腺癌为HER2

在另一个实施方案中，所述受试者已经被诊断出患有扩散肿瘤细胞和/或非转移性癌症。

如上所述，本公开所述的方法可以进一步涉及向所述受试者施用化学治疗剂、免疫治疗剂、表观遗传剂或电离辐射。

当将化学治疗剂施用于所述受试者时，所述化学治疗剂可以是选自曲妥珠单抗

当向所述受试者施用免疫治疗剂时，所述免疫治疗剂选自免疫检查点抑制剂、干扰素或肿瘤疫苗。

当将表观遗传剂施用给所述受试者时，所述表观遗传剂可以选自组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂、5-氮杂胞苷、视黄酸、三氧化二砷、Zeste 2多梳抑制复合物2亚单位增强子(“EZH2”)抑制剂、溴结构域(BRD)抑制剂及其衍生物。

接触可以通过向所述受试者施用所述PERK抑制剂来进行。合适的PERK抑制剂已在上文中详细描述，并且包括，但不限于，LY2、LY3和LY4。

在一个实施方案中，所述方法还涉及在所述接触之前检测所述受试者中DTC的存在。如上面更详细的描述，所述DTC可以为NR2F1

所述方法可以进一步涉及使所述受试者中的DCC/DTC与BMP7衍生蛋白接触。在一个实施方案中，通过向所述受试者施用所述BMP7衍生物蛋白来使所述受试者中的DCC/DTC与BMP7衍生蛋白接触。合适的BMP7衍生蛋白如上所述。在一个实施方案中，所述BMP7衍生蛋白为BMP7-F9。

在一个实施方案中，所述PERK抑制剂不抑制EIF2AK1、EIF2AK2或EIF2AK4。

如上所述，所述受试者可以是哺乳动物，优选为人。

在一个实施方案中，所述方法可以进一步涉及在所述接触之前选择没有疾病迹象的受试者。例如，所述受试者可以在所述接触之前处于癌症缓解中。

本公开的又一个方面涉及治疗受试者中的晚期癌症的方法。该方法涉及使受试者中的扩散癌细胞(DCC)与选自LY2、LY3和LY4的蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)抑制剂接触，其中所述接触根除所述受试者中的DTC以治疗所述受试者中的微小残留癌。

如本文所用，术语“晚期癌症”是指II期癌症、III期癌症和/或IV期癌症，或指已转移的任何癌症。应当理解，癌症疾病状态的“晚期”性质可以由医师确定。

如上详述，所述受试者可能已经被诊断出患有乳腺癌、多发性骨髓瘤、肺癌、非小细胞肺癌、脑癌、子宫颈癌、套细胞淋巴瘤、白血病、肝细胞癌、前列腺癌、黑色素瘤、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤或结直肠癌。

在一个实施方案中，所述癌症为选自下组的乳腺癌：浸润性乳腺癌、导管原位癌(DCIS)、小叶原位癌(LCIS)和炎性乳腺癌。乳腺癌可以是HER2

所述方法可以进一步涉及向所述受试者施用化学治疗剂、免疫治疗剂、表观遗传剂或电离辐射。在一个实施方案中，所述化学治疗剂为选自曲妥珠单抗

在一个实施方案中，通过向所述受试者施用所述PERK抑制剂来进行所述接触。

所述方法可以进一步涉及在所述接触之前检测所述受试者中DCC/DTC的存在。

如上所述，所述DTC可以为NR2F1

实施例

实施例1-实施例2-6的材料和方法

试剂、细胞培养和处理：EGF获自PeproTech(Rocky Hill，NJ)，并以100ng/ml进行使用。毒胡萝卜素(Thapsigargin)购自Sigma(St.Louis,MO)，并以2nM进行使用。通过稳定转染H2B-Dendra2质粒产生ZR75.1-H2B-Dendra2细胞系(Gurskaya等,“Engineering of aMonomeric Green-to-Red Photoactivatable Fluorescent Protein Induced by BlueLight,”Nat.Biotechnol.24:461-465(2006),其全部内容通过引用并入本文)。对于3D培养，将MCF10A-HER2、SKBR3和ZR75.1-H2B-Dendra2细胞铺板于生长因子降低的基质胶(Corning，Corning，NY)中，并按照先前的描述进行生长(Avivar-Valderas等,“Regulationof Autophagy during ECM Detachment is Linked to a Selective Inhibition ofmTORC1 by PERK,”Oncogene 32(41):4932-40(2013),其全部内容通过引用并入本文)。当提到“低密度”时，接种3,500个细胞/8孔，对于“高密度”，则接种20,000个细胞/8孔。媒介物(DMSO)或LY4(2μM)的处理在2D培养下每隔24小时替换一次，在3D培养下每隔48小时替换一次。

小鼠、肿瘤生长和组织处理：FVB/N-Tg(MMTVneu)小鼠品系获自杰克逊实验室(Sacramento，CA)。这些小鼠在小鼠乳腺肿瘤病毒启动子/增强子的转录控制下表达未激活的neu(HER2)形式。在进行任何实验之前，雌性先经历一轮妊娠，断奶后至少要有两周没有哺乳。每天向24-32周龄的雌性腹膜内注射媒介物(90％玉米油，10％乙醇)或LY4(50mpk)，共两周。对于联合治疗，在开始使用LY4进行上述治疗之前，每天用阿贝西尼(50mpk)通过灌胃处理24-32周龄雌性，持续4周。使用公式(Dxd

乳腺全标本染色：将固定在10％缓冲福尔马林中的乳腺在胭脂红明矾染液(胭脂红0.2％，硫酸铝钾0.5％)(Sigma,St.Louis,MO)中孵育2天。然后，将它们脱水并转移到水杨酸甲酯溶液中，然后再使用立体显微镜进行成像。

IHC和IF：如先前所述进行石蜡包埋切片的IHC和IF(Avivar-Valderas等,“Regulation of Autophagy during ECM Detachment is Linked to a SelectiveInhibition of mTORC1 by PERK,”Oncogene 32(41):4932-40(2013)，其全部内容通过引用并入本文)。简而言之，将载玻片脱蜡并连续再水化。在柠檬酸盐缓冲液(10mM，pH 6)、EDTA缓冲液(1mM，pH 8)或Tris/EDTA(pH9)中进行热诱导的抗原修复。将玻片在0.1％Triton

在免疫细胞荧光的情况下，通过在多制备载玻片上以500rpm进行细胞离心3分钟来制备固定细胞的细胞离心涂片(100,000-200,000个细胞/细胞离心涂片)，并从通透操作开始按照下面的说明进行染色步骤。对于3D培养物的染色，将腺泡在4℃下在4％的PFA中固定20分钟，在室温下用0.5％Triton

在图10A中解释了对P-HER2水平的评分。对于乳腺导管中的CK8/18和SMA的评分，在每只动物的20个低倍视野中将CK8/18的表达评估为阴性(0)、低(1)或高(2)，同样对SMA进行评估，并将两个得分之和作为最终分数(从0到4)。

显微观察：通过使用Nikon Eclipse TS100显微镜、Leica DM5500或共焦LeicaSP5多光子显微镜捕获了图像。

TUNEL原位细胞死亡检测：使用原位细胞死亡检测试剂盒AP(Roche，Basel，Switzerland)评估凋亡水平。将来自肿瘤的石蜡切片脱蜡，重新水化并在0.2％TRITON

免疫印迹分析：如先前所述，在RIPA缓冲液中裂解细胞，并通过免疫印迹分析蛋白(Ranganathan等,“Functional Coupling of p38-Induced Up-Regulation of BiP andActivation of RNA-Dependent Protein Kinase-Like Endoplasmic Reticulum Kinaseto Drug Resistance of Dormant Carcinoma Cells,”Cancer Res.66:1702-1711(2006),其全部内容通过引用并入本文)。使用以下其他抗体对膜进行印迹：P-PERK(T982)(Tenkerian等,“mTORC2 Balances AKT Activation and eIF2alpha Serine51Phosphorylation to Promote Survival Under Stress,”Mol.Cancer Res.13:1377-1388(2015),其全部内容通过引用并入本文)、PERK(Santa Cruz，Dallas，TX)、P-EGFR(Y1148)、EGFR，P-AKT(S473)、P-S6(S235/236)(Cell signaling,Danvers,MA)、GAPDH(Millipore,Darmstadt,Germany)和β-微管蛋白(Abcam,Cambridge,MA)。为了诱导ER应激，收集前将MCF10A-HER2细胞铺板于低粘附力平板中24小时。

细胞表面生物素化和内吞作用测定：对于细胞表面的生物素化，按照制造商的说明使用Pierce细胞表面蛋白质分离试剂盒，并进行微小的改动。简而言之，将MCF10A-HER2细胞进行血清和EGF饥饿并进行24小时的+/-LY4处理，然后再用+/-EGF(100ng/ml)刺激20'。然后，用冰冷的PBS洗涤细胞，并在4℃下将表面蛋白生物素化30分钟。淬灭后，收集细胞并使用RIPA缓冲液裂解。将蛋白裂解物与NeutrAvidin琼脂糖珠一起孵育，并通过与含有DTT(50mM)的SDS-PAGE样品缓冲液孵育来释放结合的蛋白。对于内吞作用测定(Cihil等,“The Cell-Based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis andRecycling of Plasma Membrane Proteins,”J.Vis.Exp.e50867(2013),其全部内容通过引用并入本文)，对细胞进行类似处理，但是在用EGF处理之前，将细胞表面蛋白生物素化。在37℃以+/-EGF(100ng/ml)孵育20分钟(以诱导胞吞作用)后，将细胞用冰冷的PBS洗涤，并与剥离缓冲液一起孵育(以去除细胞表面的生物素化：75mM NaCl，1mM MgCl

单细胞靶向基因表达分析：将来自MMTV-neu 28-30周龄雌性的原发性肿瘤用胶原酶消化成单细胞悬液。将来自MMTV-neu 15-30周龄雌性的肺用胶原酶消化成单细胞悬液，然后重悬于FACS缓冲液中。然后将细胞用抗-HER2-PE，抗-CD45-APC和DAPI染色，并使用BDFACSAria分选仪分选HER2+/CD45-细胞群。将分选的细胞以312,500个细胞/ml的浓度重悬于培养基中，然后将80μl与20μl悬浮剂(C1 Fluidigm)混合。使用C1单细胞Preamp IFC10-17μm进行单细胞分离。使用Ambion的单细胞至CT qRT-PCR试剂盒和20x TaqMan基因表达FAM-MGB测定法进行预扩增。将所得cDNA在C1 DNA稀释剂1/3中进一步稀释，并使用96.96IFC(Fluidigm)、Juno System控制器和用于高通量qPCR的Biomark HD进行基因表达分析。使用TaqMan快速高级预混液进行qPCR反应。使用Fluidigm实时PCR分析软件和Clustergrammer基于Web的工具进行分析(Fernandez等,“Clustergrammer,A Web-BasedHeatmap Visualization and Analysis Tool for High-Dimensional BiologicalData,”Sci.Data 4:1-12(2017)，其全部内容通过引用并入本文)，以用于层次聚类热图。

生化测定：重组的人EIF2AK3(PERK)催化结构域(氨基酸536-1116；目录号PV5107)、GFP-eIF2α(目录号PV4809)底物和Terbium标记的磷酸化eIF2α抗体(目录号PR8956B)从Invitrogen(Carlsbad,CA)购得。从大肠杆菌表达并纯化了HIS-SUMO-GCN2催化结构域(氨基酸584-1019)。在不存在或存在抑制剂的条件下，在由50mM HEPES(pH 7.5)、10mM MgCl

基于细胞的TR-FRET测定法：简而言之，将表达GFP-eIF2α的GripTite

ATF4-luc测定法：用表达ATF4-luc的慢病毒(SABiosciences，Frederick，MD)转导293细胞，并在含有1μg/ml嘌呤霉素的生长培养基中进行选择。为了确定化合物对ER应激诱导的ATF4活性的效应，将293-ATF4-luc细胞以每孔15,000个细胞接种在涂有聚D-赖氨酸的96孔板中，并使其附着过夜。然后将细胞用测试化合物预处理30分钟。加入衣霉素(2μM)以诱导ER应激，并将板在37℃下孵育6小时。然后吸出培养基，并将细胞在被动裂解缓冲液(Promega Cat#E194A)中在平板振荡器上裂解5分钟。使用萤光素酶测定试剂(PromegaCat#E1501)在Wallac 1420Victor2

细胞活力测定：分别在PERK抑制剂不存在或PERK抑制剂存在48、72或96小时的情况下，监测Hela、HT-1080和Bx-PC-3细胞在96孔板中的生长。使用CellTiter-

统计分析：所有点代表独立的生物样品，误差棒代表标准差，并且使用Graph PadPrism软件用Mann-Whitney测试确定统计显著性。

实施例2–静息的HER2

已经显示，PERK通路的激活是UPR诱导的与休眠表型相关的生长停滞和存活的关键效应子(Brewer等,“PERK Mediates Cell-Cycle Exit During the MammalianUnfolded Protein Response,”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:12625-30(2000)；Ranganathan等,“Dual Function of Pancreatic Endoplasmic Reticulum Kinase inTumor Cell Growth Arrest and Survival,”Cancer Res.68:3260-3268(2008)；andRanganathan等,“Functional Coupling of p38-Induced Up-Regulation of BiP andActivation of RNA-Dependent Protein Kinase-Like Endoplasmic Reticulum Kinaseto Drug Resistance of Dormant Carcinoma Cells,”Cancer Res.66:1702-1711(2006)，这些文献中的每一个的全部内容均通过引用并入本文)。在MMTV-HER2动物中，较高百分比的小鼠发展成肺转移，这可能是由早期DCC或晚期DCC引发的(Guy等,“Expression of theNeu Protooncogene in the Mammary Epithelium of Transgenic Mice InducesMetastatic Disease,”Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.89:10578-10582(1992)；Husemann等,“Systemic Spread Is an Early Step in Breast Cancer,”Cancer Cell 13:58-68(2008)；Harper等,“Mechanism of Early Dissemination and Metastasis in Her2

接下来，通过测试来自不同亚型和来源(淋巴结、肺、肝)的17种乳腺癌转移来评价这些相关性在人乳腺转移性病变中是否也成立(表5)。对乳腺癌转移进行细胞角蛋白染色，以鉴定转移病变、Ki67和GADD34。与小鼠模型中的相比，晚期人转移性病变在不同患者之间以及同一病变的不同区域之间显示出两种标志物均更加异质的染色模式。然而，观察到增殖水平(Ki67)和ER应激活化(GADD34)之间的与转移类型无关的相反的相关性(图1B)。这个分析证实了小鼠模型中的发现，并且证实GADD34可能有助于鉴定转移部位中的UPR

表5.人乳腺癌转移样本

*高(H)；低(L)；中(I)

通过对MMTV-HER2小鼠肺中的DCC、微转移和宏转移进行单细胞靶向基因表达分析，评估了转移细胞中存在的增殖、静止、休眠和ER应激的标志物。将来自MMTV-HER2雌性的肺处理成单细胞悬浮液，并分选HER2

实施例3–PERK的抑制消除了骨髓和肺中的静息DCC，进而抑制了肺转移

以上实施例的结果促使了对选择性PERK抑制剂对休眠DCC命运和转移形成的作用进行评估。LY2、LY3和LY4(LY系列抑制剂)已被确定为是有效的选择性的PERK抑制剂，具有适当的类似药物的特性以支持体内研究(Pytel等,“PERK Is a Haploinsufficient TumorSuppressor:Gene Dose Determines Tumor-Suppressive Versus Tumor PromotingProperties of PERK in Melanoma,”PLoS Genet.12:1-22(2016),其全部内容通过引用并入本文)。在体外激酶测定法(使用eIF2α作为底物)和基于细胞的测定法中测试了LY系列抑制剂，研究了eIF2α磷酸化及其下游输出ATF4(表6)。与GSK2656157相比，所有这三种抑制剂均显示出相似的或更高的效力(Axten等,“Discovery of GSK2656157:An Optimized PERKInhibitor Selected for Preclinical Development,”ACS Med.Chem.Lett.4:964-968(2013),其全部内容通过引用并入本文)；在表达HER2的MCF10A细胞中有效降低了P-PERK(P-T980)水平及其下游靶标ATF4(图2C和图3A)；并使这些同样的细胞对低剂量毒胡萝卜素治疗敏感，从而显示了这些PERK抑制剂如何选择性地影响对ER应激的适应性(图2D)。

通过使用生化酶分析法(图2E)，LY4显示出了最高的特异性，在低于15μM的浓度下没有呈现出次级激酶靶标，而LY2、LY3和GSK2656157在低于5μM甚至在1μM的浓度下呈现出了几个次级靶标。通过使用DicoveR

表6.不同PERK抑制剂的酶促的和基于细胞的IC

表7.其他eiF2α激酶的体外抑制比较

用媒介物或LY4(50mpk)每日腹膜内注射治疗24-32周龄的单胎MMTV-HER2雌性小鼠，持续两个星期。收集乳腺、肺、胰腺、骨髓和肿瘤以进行进一步分析。LY4的耐受性良好，体重无明显变化，这与最近的表明对血糖水平或胰脏功能没有效应的研究一致(Pytel等,“PERK Is a Haploinsufficient Tumor Suppressor:Gene Dose Determines Tumor-Suppressive Versus Tumor Promoting Properties of PERK in Melanoma,”PLoSGenet.12:1-22(2016),其全部内容通过引用并入本文)。对MMTV-HER2雌性的总细胞计数没有效应表示该抑制剂对骨髓细胞稳态或外周血白细胞没有显著效应(图2F)。

PERK的抑制导致乳腺导管和胰腺组织中的P-PERK和P-eIF2α水平显著降低(尽管特别地在胰岛中仅部分降低)(图3B)。结论是全身性LY4递送能有效抑制PERK激活和eIF2α磷酸化。对PERK的抑制并未完全耗尽PERK活性，这可能使小鼠能控制其胰腺功能和葡萄糖水平(Yu等,“Type I Interferons Mediate Pancreatic Toxicities of PERKInhibition,”Proc.Natl.Acad.Sci.112:15420-15425(2015),其全部内容通过引用并入本文)。

高百分比的MMTV-HER2动物发展成向肺转移，这可以在进展的早期开始(Guy等,“Expression of the Neu Protooncogene in the Mammary Epithelium of TransgenicMice Induces Metastatic Disease,”Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.89:10578-10582(1992)；Husemann等,“Systemic Spread Is an Early Step in Breast Cancer,”CancerCell 13:58-68(2008)；Harper等,“Mechanism of Early Dissemination and Metastasisin Her2

因此，在具有小和/或明显大肿瘤的动物中监测了LY4 PERK抑制剂对转移性疾病的效应。所有经过媒介物治疗的动物均表现出转移，其能在H&E染色的切片中检测到。将展示出＞100个细胞的病变归类为宏转移，因为它们通常也对增殖标志物呈阳性(图1A)。每只动物的宏转移的定量(5个非连续肺切片)显示，仅治疗两周后，LY4减少了宏转移的数量和发生率(图3C)，同时不会影响这些转移灶的面积(图4A)。这表明PERK的抑制可能在转移的初始阶段起作用，而不是缩小已建立的宏转移。因此，接下来评估了LY4的治疗是否会影响肿瘤细胞从原发部位开始的浸润或从孤立的DCC向微转移(包含2-100个细胞)的过渡。直接在血液样品中检测HER2

为了进一步测试LY4处理是否可以选择性地靶向周期之外的人DCC的存活，在3D培养物中对这种生物学进行了建模。将稳定表达与组蛋白H2B融合的可光转换荧光蛋白(Dendra2)的人ZR75.1 HER2

实施例4–PERK抑制阻滞了HER2驱动的早期和晚期乳腺肿瘤进展

已经证明与休眠最为相关的静息UPR

对24周龄的单胎雌性乳腺的分析表明，经媒介物治疗的MMTV-HER2动物表现出具有次级和三级致密分支的导管(图6A，左图)，并且组织学分析显示频繁的乳腺增生性病变(图6A，右图，黑色箭头)。相反，经LY4治疗的动物显示出“正常化”的腺结构，其分支密度较小，类似于非转基因的正常FVB小鼠的乳腺树(图3B)。LY4治疗的动物还显示出空腔乳腺导管的数量急剧增加，构成了结构中的60％以上，而对照雌性中则为约20％(图6B和图5C)。闭塞性增生和DCIS样病变的数量也减少到少于媒介物治疗的动物的一半。通过细胞角蛋白8/18表达的不均匀水平评估发现，对照HER2

一旦动物表现出体积范围为30至200mm

在Matrigel中用LY4处理具有HER2过表达的人癌细胞(MCF10A-HER2或ZR75.1)或HER2扩增的(SKBR3)(图8D和图7E)的3D腺泡培养物显示，用媒介物或LY4(2μM)处理10天显著提升了这些类器官中的细胞凋亡水平(裂解的caspase-3)，特别是在被剥夺了与ECM接触的内部细胞团中更是如此(图8D)。与体内相似，未观察到通过磷酸化组蛋白H3水平检测到的增殖水平的显著变化(图7F)。结论是，早期的MMTV-HER2

实施例5–最佳的HER2磷酸化、定位以及AKT和ERK的激活需要PERK信号传导

由于HER2

表8.LY4对HER家族信号通路的直接抑制活性

实施例6-CDK抑制剂与PERK抑制的顺序组合增强了LY4的抗转移效应

建立了PERK药理学抑制对原发病变的效应，并且最重要的是，还确定了LY4可以通过根除休眠的DCC来抑制转移。有了这些信息，就可以评估能够模仿休眠的临床可用药物是否可用于使休眠诱导的癌细胞呈UPR

实施例7-实施例2-6的讨论

在HER2

本文的实施例证实，PERK抑制剂LY4可以选择性地靶向DCC和原发灶中的HER2依赖性。一个有待讨论的重要发现是LY4对转移的抑制效应。就像在患者中一样，在MMTV-HER2模型中转移可能与原发肿瘤不同步，有时甚至发展出隐匿性原发性病变，其中某些转移开始于明显的肿瘤探及之前(Husemann等,“Systemic Spread Is an Early Step in BreastCancer,”Cancer Cell 13:58-68(2008)；Pavlidis等,“Cancer of Unknown Primary(CUP),”Crit.Rev.Oncol.Hematol.54:243-250(2005)；Harper等,“Mechanism of EarlyDissemination and Metastasis in Her2

发现可以消除休眠DCC的靶标和药物非常重要，因为已知休眠DCC可通过主动和被动机制逃避抗增殖疗法(Aguirre-Ghiso等,“Metastasis Awakening:Targeting DormantCancer,”Nat.Med.19:276-277(2013)；Naumov等,“Ineffectiveness of DoxorubicinTreatment on Solitary Dormant Mammary Carcinoma Cells or Late-DevelopingMetastases,”Breast Cancer Res.Treat.82(3):199-206(2003)；Oshimori等,“TGF-BetaPromotes Heterogeneity and Drug Resistance in Squamous Cell Carcinoma,”Cell160:963-976(2015)；and Fluegen等,“Phenotypic Heterogeneity of DisseminatedTumour Cells is Preset by Primary Tumour Hypoxic Microenvironments,”Nat.CellBiol.19(2):120-132(2017),所述文献中的每一个通过引用整体并入本文)。骨髓中DCC的根除(其中这些细胞通常也处于休眠状态)，(Bragado等,“TGF-Beta2 DictatesDisseminated Tumour Cell Fate in Target Organs Through TGF-Beta-RIII andP38Alpha/Beta Signalling,”Nat.Cell.Biol.15:1351-1361(2013)；Chéry等,“Characterization of Single Disseminated Prostate Cancer Cells Reveals TumorCell Heterogeneity and Identifies Dormancy Associated Pathways,”Oncotarget 5(20):9939-51(2014)；Ghajar等,“The Perivascular Niche Regulates Breast TumourDormancy,”Nat.Cell Biol.15:807-817(2013)；and Husemann等,“Systemic Spread Isan Early Step in Breast Cancer,”Cancer Cell 13:58-68(2008),所述文献中的每一个通过引用整体并入本文)，进一步强调了这样的概念：PERK抑制是一种抗休眠DCC的疗法(Aguirre-Ghiso等,“Metastasis Awakening:Targeting Dormant Cancer,”Nat.Med.19:276-277(2013),其全部内容通过引用并入本文)，其可用于辅助剂设置中以消除休眠的最小残留疾病(Aguirre-Ghiso等,“Metastasis Awakening:Targeting Dormant Cancer,”Nat.Med.19:276-277(2013),其全部内容通过引用并入本文)。

PERK激酶抑制阻断肿瘤生长的确切机制尚不清楚。对由蛋白毒性施加的应激的适应性降低(Singh等,“HER2-mTOR Signaling-Driven Breast Cancer Cells Require ER-Associated Degradation to Survive,”Sci.Signal.8:ra52(2015),其全部内容通过引用并入本文)可能是一个机制。本文所述的结果证明，LY4降低了体内磷酸化HER2的水平，并且LY4通过增强的内吞作用降低了膜中活性受体的丰度。没有观察到HER2蛋白降解的变化。关于PERK如何精确地控制HER2的膜定位或内吞作用，可能是受体的内化能够更好地或更快地使受体去磷酸化或者减少受体被激活的机会，从而导致下游信号传导减少。已经显示，受体的内吞作用可以通过物理上降低细胞表面受体的浓度来减少许多质膜定位受体的信号输出(Sorkin and Zastrow,“Endocytosis and Signaling:Intertwining MolecularNetworks,”Nat.Rev.Mol.Cell Biol.10:609-22(2009),其全部内容通过引用并入本文)。

本文的结果进一步证明，在早期病变中，LY4诱导出分化表型。但是，在已建立的肿瘤中，当LY4作为单一药物时能将肿瘤推入停滞或消退状态。这表明，在早期，HER2

本文所述的结果还指出了将标准的抗增殖疗法与LY4结合使用的价值，其可消除残留的静息细胞。通过先后使用CDK4/6抑制剂阿贝西尼和LY4的组合对这种方法进行了测试，结果表明抗转移效果有所提高。令人鼓舞的是，所使用的LY4剂量并未显著影响非肿瘤或荷瘤小鼠的葡萄糖水平，骨髓或外周血细胞计数，饮水和饲喂行为。这表明所使用的剂量虽然能通过根除休眠的DCC而严重阻碍肿瘤的生长和转移，但并未影响宿主的正常器官功能。由于还发现休眠/UPR

实施例8–黑色素瘤细胞系中CDK4/6抑制剂阿贝西尼和PERK抑制剂LY4的联用

由于已经显示CDK4/6抑制剂能诱导细胞周期停滞以及LY4在休眠的细胞周期停滞的DTC中诱导细胞死亡(图12A)，因此接下来研究了CDK4/6抑制剂和LY4的组合是否会降低体外细胞系中的细胞活力。在2D和3D体外细胞培养中，已经显示CDK 4/6抑制剂阿贝西尼能抑制WM35黑色素瘤细胞的生长。与仅用2μM LY4处理细胞相比，在50nM阿贝西尼预处理(2D)1周后使用2μM的LY4体外紧急处理(48小时)降低了Braf突变的黑色素瘤WM35细胞的活力(图12B)。在体外3D培养物中，阿贝西尼预处理1周后添加2μM LY4对降低细胞活力具有累加作用(图12C)。图12C所示结果表明阿贝西尼的预处理可能会在3D细胞培养物中诱导生长停滞和一些细胞死亡。随后LY4的添加似乎增强了对细胞死亡的效应。这与如下观念相一致，即被阿贝西尼阻滞的细胞可能会上调ER应激反应，如显示为GADD34的上调(图12G)，随后对LY4敏感。

在黑色素瘤细胞中，在连续治疗4-5周后出现阿贝西尼抗性表型。用LY4和阿贝西尼共同处理细胞会减少2D细胞培养物中存活的阿贝西尼抗性细胞的数量，但未显示出在2D培养物中进行这些实验所期望的增强。然而，在阿贝西尼抗性细胞中，在用阿贝西尼持续处理后，LY4在降低3D细胞培养物的活力方面具有累加效应(图12D-12E)。这些数据表明，对黑色素瘤CDK4/6抑制剂具有抗性的细胞仍然依赖于PERK介导的ER应激反应才能存活。在体外3D培养物中，在阿贝西尼预处理5周后添加LY4对降低细胞活力具有累加效应(图12F)，这可以通过摄取DAPI的细胞的凋亡来确定。虽然抗性细胞在2D培养物中生长得和对照细胞一样好，但是阿贝西尼的预处理似乎能在3D培养物中诱导细胞死亡(图12F)。

实施例9–BMP7-F9诱导并维持DTC的休眠(HNSCC)

BMP7-F9降低了ERK/p38活性比，并在诱导了休眠特征中的各种mRNA(图13A-13C)。图13A显示与对照相比，用2ng/ml、5ng/ml和10ng/ml的BMP7-F9处理(分别是第二、第三和第四灰色柱；对照是第一黑色柱)降低了ERK/p38活性比，这通过在HEp3 HNSCC细胞中的Western印迹法确定。在2-6和24小时(第二至第四的柱组)后观察到了对ERK/p38活性比的效应。在最初的30分钟内，BMP7刺激了ERK活性(第一柱集)。图13B显示BMP7-F9的处理诱导了编码休眠特征基因的DEC2、p53和p27 mRNA(10ng/ml BMP7-F9，24小时)。图13C显示，通过免疫荧光法(10ng/ml，24小时)测得，BMP7-F9对相同细胞的处理诱导了NR2F1的核积累，NR2F1是一种强休眠诱导转录因子。图13A和图13B中的差异，使用学生t检验计算得出p<0.05。

体外和体内的BMP7-F9诱导了T-HEp3细胞的生长停滞(图14A-14E)。图14A显示BMP7-F9对T-HEp3细胞的处理将其体外增殖抑制了48小时，这通过细胞滴度蓝测定法(RFU，相对荧光单位)确定。图14B是图14C-14D中使用的体内实验程序的示意图。将T-HEp3细胞在体外用BMP7-F9预处理24小时，然后接种在鸡胚绒膜尿囊膜(CAM)上(图14C)，在所述膜上每天用媒介物或BMP7-F9(50ng/ml)对其进行体内处理，随后收集肿瘤并量化HEp3 HNSCC细胞/肿瘤的数量(图14D)和P-H3的水平(图14E)。

按照图15A中的方法治疗NSG小鼠，持续3和6周。在这些时间点上对局部复发和DTC发生百分比进行评分。对应于图15B的列表结果显示，BMP7限制了肿瘤手术后局部复发的发生率(表9)以及肺中DTC的发生率(表10)，并且如下所示(表11)。

表9.辅助剂设置中的BMP7-F9对手术边缘局部复发的效应

表10.BMP7-F9对肺DCC发病率的效应

表11.在图15A-15B和表9和10所示的相同实验中，GFP

HEp3-GFP HNSCC肿瘤生长直至大约300mm

新辅助剂+辅助剂的设置下，BMP7-F9对手术边缘局部复发(表12)和肺中DCC发生率(表13)的效应如下所示。结果列自图15C中的结果，其中小鼠的治疗除辅助治疗持续了4周之外，其他治疗与图15A相同。治疗后对分离的肺中GFP阳性细胞的数目进行了评分。结果表明，肿瘤手术后用新辅助剂和辅助剂治疗，BMP7限制了局部复发的发生率(表12)和肺中DCC发生率(表13)。表14显示了肺中DCC负荷的量度，其通过BMP7-F9治疗可显著降低。请注意，DCC负荷的中位数下降了一个对数，而BMP-7明显治愈了来自7只动物中3只的DCC。

表12.新辅助剂+辅助剂设置下BMP7-F9对手术边缘局部复发的效应

表13.肺中DCC发生率

表14.表12和13中报道的小鼠GFP

尽管在本文中已经详细描绘和描述了优选的实施方案，但是对于相关领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神的前提下，可以进行各种修改、添加、替换等，因此，这些被认为在所附权利要求书所限定的本发明的范围内。

序列表

<110> 西奈山伊坎医学院

<120> 治疗微小残留癌的方法

<130> 147535.00711 (170912)

<150> 62/648,166

<151> 2018-03-26

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Asn Arg Ser Lys Thr Pro Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn

275 280 285

Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His

290 295 300

Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile

305 310 315 320

Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Gly Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe

325 330 335

Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Leu Val Gln Thr

340 345 350

Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala

355 360 365

Pro Thr Gln Leu Gly Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser

370 375 380

Asn Val Ile Leu Lys Lys Phe Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly

385 390 395 400

Cys His

<210> 15

<211> 402

<212> PRT

<213> 智人

<400> 15

Asp Phe Ser Leu Asp Asn Glu Val His Ser Ser Phe Ile His Arg Arg

1 5 10 15

Leu Arg Ser Gln Glu Arg Arg Glu Met Gln Arg Glu Ile Leu Ser Ile

20 25 30

Leu Gly Leu Pro His Arg Pro Arg Pro His Leu Gln Gly Lys His Asn

35 40 45

Ser Ala Pro Met Phe Met Leu Asp Leu Tyr Asn Ala Met Ala Val Glu

50 55 60

Glu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Gln Gly Phe Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala

65 70 75 80

Val Phe Ser Thr Gln Gly Pro Pro Leu Ala Ser Leu Gln Asp Ser His

85 90 95

Phe Leu Thr Asp Ala Asp Met Val Met Ser Phe Val Asn Leu Val Glu

100 105 110

His Asp Lys Glu Phe Phe His Pro Arg Tyr His His Arg Glu Phe Arg

115 120 125

Phe Asp Leu Ser Lys Ile Pro Glu Gly Glu Ala Val Thr Ala Ala Glu

130 135 140

Phe Arg Ile Tyr Lys Asp Tyr Ile Arg Glu Arg Phe Asp Asn Glu Thr

145 150 155 160

Phe Arg Ile Ser Val Tyr Gln Val Leu Gln Glu His Leu Gly Arg Glu

165 170 175

Ser Asp Leu Phe Leu Leu Asp Ser Arg Thr Leu Trp Ala Ser Glu Glu

180 185 190

Gly Trp Leu Val Phe Asp Ile Thr Ala Thr Ser Asn His Trp Val Val

195 200 205

Asn Pro Arg His Asn Leu Gly Leu Gln Leu Ser Val Glu Thr Leu Asp

210 215 220

Gly Gln Ser Ile Asn Pro Lys Leu Ala Gly Leu Ile Gly Arg His Gly

225 230 235 240

Pro Gln Asn Lys Gln Pro Phe Met Val Ala Phe Phe Lys Ala Thr Glu

245 250 255

Val His Phe Arg Ser Ile Arg Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln

260 265 270

Asn Arg Ser Lys Thr Pro Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn

275 280 285

Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His

290 295 300

Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile

305 310 315 320

Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Gly Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe

325 330 335

Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Leu Val Gln Thr

340 345 350

Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala

355 360 365

Pro Thr Gln Leu Gly Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser

370 375 380

Asn Val Ile Leu Lys Lys Trp Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly

385 390 395 400

Cys His

<210> 16

<211> 402

<212> PRT

<213> 智人

<400> 16

Asp Phe Ser Leu Asp Asn Glu Val His Ser Ser Phe Ile His Arg Arg

1 5 10 15

Leu Arg Ser Gln Glu Arg Arg Glu Met Gln Arg Glu Ile Leu Ser Ile

20 25 30

Leu Gly Leu Pro His Arg Pro Arg Pro His Leu Gln Gly Lys His Asn

35 40 45

Ser Ala Pro Met Phe Met Leu Asp Leu Tyr Asn Ala Met Ala Val Glu

50 55 60

Glu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Gln Gly Phe Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala

65 70 75 80

Val Phe Ser Thr Gln Gly Pro Pro Leu Ala Ser Leu Gln Asp Ser His

85 90 95

Phe Leu Thr Asp Ala Asp Met Val Met Ser Phe Val Asn Leu Val Glu

100 105 110

His Asp Lys Glu Phe Phe His Pro Arg Tyr His His Arg Glu Phe Arg

115 120 125

Phe Asp Leu Ser Lys Ile Pro Glu Gly Glu Ala Val Thr Ala Ala Glu

130 135 140

Phe Arg Ile Tyr Lys Asp Tyr Ile Arg Glu Arg Phe Asp Asn Glu Thr

145 150 155 160

Phe Arg Ile Ser Val Tyr Gln Val Leu Gln Glu His Leu Gly Arg Glu

165 170 175

Ser Asp Leu Phe Leu Leu Asp Ser Arg Thr Leu Trp Ala Ser Glu Glu

180 185 190

Gly Trp Leu Val Phe Asp Ile Thr Ala Thr Ser Asn His Trp Val Val

195 200 205

Asn Pro Arg His Asn Leu Gly Leu Gln Leu Ser Val Glu Thr Leu Asp

210 215 220

Gly Gln Ser Ile Asn Pro Lys Leu Ala Gly Leu Ile Gly Arg His Gly

225 230 235 240

Pro Gln Asn Lys Gln Pro Phe Met Val Ala Phe Phe Lys Ala Thr Glu

245 250 255

Val His Phe Arg Ser Ile Arg Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln

260 265 270

Asn Arg Ser Lys Thr Pro Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn

275 280 285

Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His

290 295 300

Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile

305 310 315 320

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325 330 335

Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Leu Val Gln Thr

340 345 350

Leu Val His Val Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala

355 360 365

Pro Thr Gln Leu Gly Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser

370 375 380

Asn Val Ile Leu Lys Lys Trp Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly

385 390 395 400

Cys His

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种治疗受试者中微小残留癌的方法，所述方法包括：

使受试者中的扩散癌细胞(DCC)与骨形态发生蛋白7(“BMP7”)衍生蛋白接触，其中所述接触在所述受试者的所述被接触的DCC中诱导或维持休眠，以治疗所述受试者中的微小残留癌。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者已被诊断出患有乳腺癌、多发性骨髓瘤、肺癌、非小细胞肺癌、脑癌、宫颈癌、套细胞淋巴瘤、白血病、肝细胞癌、前列腺癌、黑素瘤、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤或结直肠癌。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述癌症为选自以下的乳腺癌：浸润性乳腺癌、导管原位癌(DCIS)、小叶原位癌(LCIS)和炎性乳腺癌。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述乳腺癌为HER2

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述受试者已被诊断出具有扩散肿瘤细胞和/或非转移性癌症。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述BMP7衍生物为BMP7-F9。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其还包括：

向所述受试者施用化学治疗剂、免疫治疗剂、表观遗传剂或电离辐射。

8.根据权利要求7所述的方法，其中向所述受试者施用化学治疗剂，并且其中所述化学治疗剂是选自曲妥珠单抗

9.根据权利要求7所述的方法，其中向所述受试者施用化学治疗剂，并且其中所述化学治疗剂选自蒽环类、紫杉烷、激酶抑制剂、抗体、氟嘧啶和铂类药物。

10.根据权利要求7所述的方法，其中向所述受试者施用免疫治疗剂，并且其中所述免疫治疗剂选自免疫检查点抑制剂、干扰素或肿瘤疫苗。

11.根据权利要求7所述的方法，其中向所述受试者施用表观遗传剂，并且其中所述表观遗传剂选自组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂、5-氮杂胞苷、视黄酸、三氧化二砷、Zeste 2多梳抑制复合物2亚单位增强子(EZH2)抑制剂、溴结构域(BRD)抑制剂，及其衍生物。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述接触通过向所述受试者施用所述BMP7衍生蛋白进行。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其还包括：

在所述接触之前检测所述受试者中DCC的存在。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述DCC为NR2F1

15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述DCC为骨形态发生蛋白受体阳性(“BMPR

16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述DCC是磷酸化PERK(phospho-PERK)活性的。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其还包括：

使所述受试者中的DCC与蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)抑制剂、MEK抑制剂、CDK4/6抑制剂、或其任意组合接触。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述接触通过向所述受试者施用PERK抑制剂来进行。

19.根据权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述接触用选自LY2、LY3、LY4及其组合的PERK抑制剂来进行。

20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述接触用不抑制EIF2AK1、EIF2AK2或EIF2AK4的PERK抑制剂来进行。

21.根据权利要求17所述的方法，其中所述接触通过向所述受试者施用MEK抑制剂来进行。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述MEK抑制剂选自PD184352、PD318088、PD98059、PD334581、RDEA119/BAY 869766。

23.根据权利要求17所述的方法，其中所述接触通过向所述受试者施用CDK4/6抑制剂来进行。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述CDK4/6抑制剂选自阿贝西尼(abemaciclib)(LY2835219)、帕博西尼(palbociclib)(PD0332991)和瑞博西尼(ribociclib)(LEE011)。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其还包括：

在所述接触之前选择癌症缓解期的受试者。

27.一种治疗受试者中微小残留癌的方法，所述方法包括：

使受试者中的扩散癌细胞(DCC)与选自LY2、LY3和LY4的蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)抑制剂接触，其中所述接触根除受试者中的DCC，以治疗所述受试者中的微小残留癌。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述受试者已被诊断出患有乳腺癌、多发性骨髓瘤、肺癌、非小细胞肺癌、脑癌、宫颈癌、套细胞淋巴瘤、白血病、肝细胞癌、前列腺癌、黑素瘤、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤或结直肠癌。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述癌症为选自以下的乳腺癌：浸润性乳腺癌、导管原位癌(DCIS)、小叶原位癌(LCIS)和炎性乳腺癌。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述乳腺癌为HER2

31.根据权利要求27所述的方法，其中所述受试者已被诊断出具有扩散肿瘤细胞和/或非转移性癌症。

32.根据权利要求27-31中任一项所述的方法，其还包括：

向所述受试者施用化学治疗剂、免疫治疗剂、表观遗传剂或电离辐射。

33.根据权利要求32所述的方法，其中向所述受试者施用化学治疗剂，并且其中所述化学治疗剂是选自曲妥珠单抗

34.根据权利要求32所述的方法，其中向所述受试者施用化学治疗剂，并且其中所述化学治疗剂选自蒽环类、紫杉烷、激酶抑制剂、抗体、氟嘧啶和铂类药物。

35.根据权利要求32所述的方法，其中向所述受试者施用免疫治疗剂，并且其中所述免疫治疗剂选自免疫检查点抑制剂、干扰素或肿瘤疫苗。

36.根据权利要求32所述的方法，其中向所述受试者施用表观遗传剂，并且其中所述表观遗传剂选自组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂、5-氮杂胞苷、视黄酸、三氧化二砷、Zeste 2多梳抑制复合物2亚单位增强子(EZH2)抑制剂、溴结构域(“BRD”)抑制剂，及其衍生物。

37.根据权利要求27-36中任一项所述的方法，其中所述接触通过向所述受试者施用所述PERK抑制剂进行。

38.根据权利要求27-37中任一项所述的方法，其还包括：

在所述接触之前检测所述受试者中DCC的存在。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述DCC为NR2F1

40.根据权利要求38或权利要求39所述的方法，其中所述DCC是磷酸化PERK(phospho-PERK)活性的。

41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述DCC为骨形态发生蛋白受体阳性(“BMPR

42.根据权利要求41所述的方法，其还包括：

使所述受试者中的DCC与骨形态发生蛋白7(BMP7)衍生蛋白接触。

43.根据权利要求42所述的方法，其中使所述受试者中的DCC与BMP7衍生蛋白接触是通过向所述受试者施用所述BMP7衍生蛋白来进行的。

44.根据权利要求42或权利要求43所述的方法，其中所述BMP7衍生蛋白为BMP7-F9。

45.根据权利要求27-44中任一项所述的方法，其中所述PERK抑制剂不抑制EIF2AK1、EIF2AK2或EIF2AK4。

46.根据权利要求27-45中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

47.根据权利要求27-46中任一项所述的方法，其还包括：

在所述接触之前选择癌症缓解期的受试者。