一种花生油脂合成相关基因及其应用

摘要

本发明公开了一种花生油脂合成相关基因及其应用，属于生物技术领域。本发明的花生油脂合成相关基因序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.1经取代、缺失或添加一个或几个碱基且编码相同功能蛋白的序列。将本发明的花生油脂合成相关基因构建植物表达载体，转化植株，能够提高植物的油脂合成和抗逆性。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种花生油脂合成相关基因及其应用。

背景技术

花生是我国食用植物油的主要来源，提高含油量已成为我国花生品质育种最重要的目标之一。我国近20年来推广种植的全国30多个主要花生品种的平均含油量仅为51.4％，北方主产区种植的一些大花生品种含油量还不到50％。且我国花生约50％作为榨油用，含油率每提高1个百分点，可增加纯收入7％。

目前，通常采用常规杂交方法选育生物新品种。当前发展迅速的基因工程技术为生物遗传改良提供了新的途径，利用在油脂合成中起重要作用的基因进行遗传转化是获得高油新种质的重要手段。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种花生油脂合成相关基因及其应用。

为了到达上述目的，本发明的技术方案为：

一种花生油脂合成相关基因，其序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.1经取代、缺失或添加一个或几个碱基且编码相同功能蛋白的序列。

在上述方案的基础上，克隆该基因的引物序列为：

P1：5′-GGAGCTTCCTGCAACCATCA-3′；

P2：5′-TGCGTATCACCATCAAAACCC-3′。

扩增所述油脂合成相关基因任一片段的引物也属于本发明的保护范围。

在上述方案的基础上，该基因没有内含子，编码蛋白有保守序列脯氨酸结(-PX5SPX3P-)。

含有上述花生油脂合成相关基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

上述花生油脂合成相关基因编码的蛋白。

在上述方案的基础上，所述花生油脂合成相关基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQID No.3或SEQ ID No.3经一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白。

在上述方案的基础上，所述花生油脂合成相关基因或其编码的蛋白在提高生物油脂含量和提高生物抗逆性中的应用。

在上述方案的基础上，在提高花生含油量中的应用。

在上述方案的基础上，在提高拟南芥抗逆性中的应用。

在上述方案的基础上，所述的抗逆性为耐盐性。

一种提高植物含油量和耐盐性的方法，将上述花生油脂合成相关基因构建到植物表达载体，导入植物细胞中，使其在植物中表达，获得含油量提高和高耐盐性植株。

本发明的有益效果：

1、本发明从花生中克隆了一条油脂合成相关基因，将其命名为Oleosin1，测序结果表明该基因没有内含子，其编码区如SEQ ID No.2所示，其编码的蛋白序列如SEQ IDNo.3所示，编码蛋白有保守序列脯氨酸结(-PX5SPX3P-)。

2、构建Oleosin1的植物表达载体，并转化花生，结果表明：转入Oleosin1基因的花生种子含油量提高约5％。

3、构建Oleosin1的植物表达载体，并转化拟南芥，结果表明：转入Oleosin1基因的拟南芥植株形态发育正常，转基因拟南芥苗抗100mM NaCl的胁迫；Oleosin1基因在拟南芥中表达可显著提高其耐盐性。

附图说明

图1Oleosin1在花生盐胁迫处理后的表达情况；

图2转Oleosin1基因拟南芥耐盐性分析(A为对照组，B为转基因组)。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

花生品种及来源：经平阳霉素离体诱变产生的花育22号耐盐突变体；

1、花生抗逆性相关基因的克隆

以花育22号(经平阳霉素离体诱变产生的耐盐突变体)的基因组DNA为模板，以引物对：

P1：5′-GGAGCTTCCTGCAACCATCA-3′(SEQ ID No.4)；

P2：5′-TGCGTATCACCATCAAAACCC-3′(SEQ ID No.5)；

扩增花生抗逆性相关基因，其基因序列如SEQ ID No.1所示；测序结果表明该基因没有内含子，编码蛋白有保守序列脯氨酸结(-PX5SPX3P-)，将其命名为Oleosin1。

2、Oleosin1在花生盐胁迫处理后的表达情况

(1)用0.7％NaCl处理“花育23号”的幼苗，在不同时间段取幼苗叶片，立即在液氮中冷冻处理后备用。分别取不同时间段胁迫处理的花生幼叶0.05g，液氮速冻并研磨成粉末状，用RNA提取试剂盒提取RNA。抽提后的总RNA用DNase I处理，并进行纯化。

(2)样品在ABI 7500FAST型荧光定量PCR仪上进行反应。20μL反应体系包括：10μL2×SybrGreen qPCR Master Mix，20μmol/L正反向引物各0.25μL，20ng反转录产物。扩增程序为：先94℃预变性2min；接着进入40个循环反应，每个循环中94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s；循环结束后，缓慢升至94℃，制备熔解曲线。每个反应设3个复孔。

(3)Oleosin1基因定量PCR的引物序列为：

正向引物序列为5'-ATGACTGACCGTACCCAACC-3'(SEQ ID No.6)；

反向引物序列为5'-CAAGCCCCGCGAACAATA-3'(SEQ ID No.7)。

内标基因Actin引物序列为：

正向引物序列为5'-GTGGCCGTACAACTGGTATCGT-3'(SEQ ID No.8)；

反向引物序列为5'-ATGGATGGCTGGAAGAGAACT-3'(SEQ ID No.9)。

结果表明：Oleosin1基因在盐胁迫处理前后表达量变化明显，表明其基因表达受盐胁迫影响(图1)。

实施例2

大肠杆菌DH5α由青岛农业大学遗传研究室实验室保存；

根癌农杆菌菌株GV3101购自北京天恩泽基因科技有限公司；

转基因的受体材料为拟南芥野生型品种由青岛农业大学遗传研究室实验室提供。

1、Oleosin1基因植物表达载体的构建

以花育22号(经平阳霉素离体诱变产生的耐盐突变体)的基因组DNA为模板，在扩增时分别在上下游引物中加入KpnI和SacI酶切位点。

其中上下游引物序列为：

P3：5′-GGTACCGGAGCTTCCTGCAACCATCA-3(KpnI)(SEQ>

P4：5′-GAGCTCTGCGTATCACCATCAAAACCC-3′(SacI)(SEQ>

回收PCR产物，并在T4DNA连接酶作用下与克隆载体pMD18-T(购买于TaKaRa)进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α获得了抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒，用KpnI和SacI进行双酶切，回收含Oleosin1基因的酶切片段，并克隆到植物表达载体Super1300的对应酶切位点中，获得该基因的植物表达载体。

2、表达载体转化拟南芥，

(1)农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备：将重组质粒利用液氮冻融法转化农杆菌菌株GV3101感受态细胞，筛选出含有重组质粒的重组菌株。挑取重组菌株单菌落，接种到YEB(利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)液体培养基中，28℃、180rpm培养至OD600＝0.5～0.8时，取2mL菌液转移到50mLYEB(利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)培养基中，培养到OD600＝0.6～0.8。将菌液于5000rpm离心15min后，用相同体积的液体1/2MS B₅悬浮备用。

(2)拟南芥的种植：选取合适的的拟南芥种子，在1％NaClO中浸泡5min，无菌水冲洗4-6次。点种到基质土上。

(3)农杆菌介导的遗传转化：选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约20-30s，注意叶片尽量不与浸染液接触。将盆钵取下，横放于暗箱中约24h。注意保持一定的湿度。24h后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条件下使其正常生长。大约3w后收取成熟种子。

(4)转基因拟南芥的筛选

将转基因拟南芥种子接种到20mL MS(潮霉素30mg/L)培养基中，22℃培养一周左右，选取鲜绿健壮的拟南芥幼苗，移植于基质土。

4、转基因植株的PCR检测

提取转基因植株的基因组DNA，利用上述载体序列和Oleosin1基因序列设计引物进行PCR扩增。PCR反应程序为：95℃、5min；95℃、50s，56℃、50s，72℃、1min，30个循环；72℃、10min。

P5：5′-GCTCCTACAAATGCCATCA-3′(SEQ ID No.12)；

P6：5′-TGCGTATCACCATCAAAACCC-3′(SEQ ID No.13)。

5、植株转基因拟南芥的耐盐性鉴定

为进一步分析转基因植株的耐盐性，将自交纯合后的的转基因拟南芥与未转基因拟南芥种子接种于MS(含100mM NaCl)培养基上。22℃培养2w左右，观察结果。结果发现转Oleosin1基因拟南芥幼苗生长正常，而未转基因拟南芥幼苗黄化，生长受到严重影响(图2)。所以转基因拟南芥幼苗的抗盐浓度为100mM或以上。

实施例3

1、Oleosin1基因花生表达载体的构建

以花生(花育22号经平阳霉素离体诱变产生的耐盐突变体)的基因组DNA为模板，在扩增时分别在上下游引物中加入KpnI和SacI酶切位点。

其中上下游引物序列为：

P3：5′-GGTACCGGAGCTTCCTGCAACCATCA-3(KpnI)(SEQ>

P4：5′-GAGCTCTGCGTATCACCATCAAAACCC-3′(SacI)(SEQ>

回收PCR产物，并在T4DNA连接酶作用下与克隆载体pMD18-T(购买于TaKaRa)进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α获得了抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒，用KpnI和SacI进行双酶切，回收含Oleosin1基因的酶切片段，并克隆到植物表达载体Super1300的对应酶切位点中，获得该基因的植物表达载体。

2、表达载体转化花生

(1)农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备：将重组质粒利用液氮冻融法转化农杆菌菌株EHA105感受态细胞，筛选出含有重组质粒的重组菌株。挑取重组菌株单菌落，接种到YEB(利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)液体培养基中，28℃、180rpm培养至OD600＝0.5～0.8时，取2mL菌液转移到50mLYEB(利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)培养基中，培养到OD600＝0.6～0.8。将菌液于5000rpm离心15min后，用相同体积的液体MS B5悬浮备用。

(2)花生子叶外植体的分离：选取饱满的花育23号花生种子，在70％酒精中浸泡1min，0.1％升汞浸泡20min，无菌水冲洗4-6次。去种皮和胚轴，将每片子叶纵向切成2半。

(3)农杆菌介导的遗传转化：切好的外植体浸于已备好的农杆菌菌液中，28℃、90rpm温和震荡侵染10min，用无菌滤纸将残留菌液吸干，接入SIM诱导培养基上在暗中共培养3d。转移到添加250mg/L头孢霉素的SIM诱导培养基，将外植体切口端嵌入培养基，培养2w左右，诱导丛生芽，培养条件：光强为1500-2000lx、光照12h、温度为26℃±1℃。

(4)将形成丛生芽的外植体转移外到250mg/L头孢霉素、100mg/L卡那霉素的SEM培养基上筛选抗性芽，培养2w，培养条件：光强为1500-2000lx、光照12h、温度为26℃±1℃。培养2w后，切下不定芽部分转移到250mg/L头孢霉素、150mg/L卡那霉素的SEM培养基上，进行抗性芽的筛选及诱导芽伸长，培养4w左右，期间继代培养2-3次。

3、转基因植株的PCR检测

提取转基因植株的基因组DNA，利用上述载体序列和Oleosin1基因序列设计引物进行PCR扩增。PCR反应程序为：95℃、5min；95℃、50s，56℃、50s，72℃、1min，30个循环；72℃、10min。

P5：5′-GCTCCTACAAATGCCATCA-3′(SEQ ID No.12)；

P6：5′-TGCGTATCACCATCAAAACCC-3′(SEQ ID No.13)。

4、转基因花生种子的含油量测定

利用气相色谱法测定自交纯合后的的转基因花生种子与未转基因花生种子(品种花育23号)。结果发现未转基因对照(花育23号)含油量53.2％，而转基因花生种子的含油量为55.3％-56.4％，平均可提高5％左右。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种花生油脂合成相关基因及其应用

<130> 2018

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 590

<212> DNA

<213> Arachis hypogaea Linn.(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 1

ggagcttcct gcaaccatca atgactgacc gtacccaacc acacactgtc caagtccaca 60

ccacagctgg ccgtttcggc gacaccgctg ccggaactaa ccgctatgcc gacagaggcc 120

cgtcaacatc taaggttatc gccgtcatca ctggactccc tatcggcggc acgttgctat 180

tgttcgcggg gcttgccctt gccggaaccc tgcttgggct ggcggtgacc accccgcttt 240

tcatcctctt cagccctgtc atagttccgg ccatcattgt cgttgggctc tcggtggcgg 300

ggttcttgac gtcaggtgca tgtgggctga cggggctgtc ttcgttctcg tgggtcatga 360

attacatccg gcagacccac ggatcggtgc cggagcagct ggaaatggca aagcaccgca 420

tggctgacgt ggccggttac gttggacaga agacgaagga tgtaggacag aagaccaagg 480

aagttgggca agagatacag accaaggctc aggattcaaa gagaacttga tagaatagtg 540

gtttaagctt aaggatgaaa ggggtctatg ggttttgatg gtgatacgca 590

<210> 2

<211> 510

<212> DNA

<213> Arachis hypogaea Linn.(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 2

atgactgacc gtacccaacc acacactgtc caagtccaca ccacagctgg ccgtttcggc 60

gacaccgctg ccggaactaa ccgctatgcc gacagaggcc cgtcaacatc taaggttatc 120

gccgtcatca ctggactccc tatcggcggc acgttgctat tgttcgcggg gcttgccctt 180

gccggaaccc tgcttgggct ggcggtgacc accccgcttt tcatcctctt cagccctgtc 240

atagttccgg ccatcattgt cgttgggctc tcggtggcgg ggttcttgac gtcaggtgca 300

tgtgggctga cggggctgtc ttcgttctcg tgggtcatga attacatccg gcagacccac 360

ggatcggtgc cggagcagct ggaaatggca aagcaccgca tggctgacgt ggccggttac 420

gttggacaga agacgaagga tgtaggacag aagaccaagg aagttgggca agagatacag 480

accaaggctc aggattcaaa gagaacttga 510

<210> 3

<211> 169

<212> PRT

<213> Arachis hypogaea Linn.(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 3

Met Thr Asp Arg Thr Gln Pro His Thr Val Gln Val His Thr Thr Ala

1 5 1015

Gly Arg Phe Gly Asp Thr Ala Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Pro Asp Arg

202530

Gly Pro Ser Thr Ser Lys Val Ile Ala Val Ile Thr Gly Leu Pro Ile

354045

Gly Gly Thr Leu Leu Leu Phe Ala Gly Leu Ala Leu Ala Gly Thr Leu

505560

Leu Gly Leu Ala Val Thr Thr Pro Leu Phe Ile Leu Phe Ser Pro Val

65707580

Ile Val Pro Ala Ile Ile Val Val Gly Leu Ser Val Ala Gly Phe Leu

859095

Thr Ser Gly Ala Cys Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Phe Ser Trp Val

100 105 110

Met Asn Tyr Ile Arg Gln Thr His Gly Ser Val Pro Glu Gln Leu Glu

115 120 125

Met Ala Lys His Arg Met Ala Asp Val Ala Gly Tyr Val Gly Gln Lys

130 135 140

Thr Lys Asp Val Gly Gln Lys Thr Lys Glu Val Gly Gln Glu Ile Gln

145 150 155 160

Thr Lys Ala Gln Asp Ser Lys Arg Thr

165

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 4

ggagcttcct gcaaccatca 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 5

tgcgtatcac catcaaaacc c 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 6

atgactgacc gtacccaacc 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 7

caagccccgc gaacaata 18

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 8

gtggccgtac aactggtatc gt 22

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 9

atggatggct ggaagagaac t 21

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<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

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ggtaccggag cttcctgcaa ccatca 26

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<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

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gagctctgcg tatcaccatc aaaaccc 27

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<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 12

gctcctacaa atgccatca 19

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 13

tgcgtatcac catcaaaacc c 21