减压低氧环境下肝外药物代谢酶动态变化评价体系

摘要

本发明提供了建立减压低氧环境下肝外药物代谢酶动态变化评价体系，用于指导高原药物的合理应用，所述方法包括以下步骤：1)将大鼠暴露于模拟减压低氧环境中8h～8w，构建减压低氧模型大鼠，以暴露于正常氧环境中相同时间的大鼠为对照组；2)选取3～5个不同暴露时间点的减压低氧模型大鼠处死后，收集肝外代谢器官进行组织匀浆获得组织液，利用所述组织液制备微粒体；3)检测所述微粒体中药物代谢酶的表达量和活性；4)总结减压低氧暴露对肝外药物代谢酶影响规律，指导高原药物应用。本发明所述的肝外药物代谢酶动态变化检测方法获得的肝外药物代谢酶动态变化情况，直观地阐明了高原缺氧环境对高原病发生及药物代谢酶变化过程的动态影响；本发明提供的药物代谢酶动态变化评价体系为高原药物应用提供科学参考。

说明书

技术领域

本发明属于药物代谢酶技术领域，尤其涉及减压低氧环境下肝外药物代谢酶动态变化的检测方法。

背景技术

国际上普遍认为海拔超过1500米以上，由于氧分压降低会对机体生理造成影响。我国高原面积辽阔，随着社会发展，平原人进入高原活动日益增多，由于人们涉足高原的活动日益频繁，高原病发病率逐年升高。高原环境具有低氧、低气压、强辐射、寒冷、干燥等基本特点，其中低氧是影响人类生命活动的主要因素。根据海拔高度高原缺氧分为轻度缺氧(1500～2500m)、中度缺氧(2500～4500m)和重度缺氧(＞4500m)，海拔越高，大气压越低，氧分压也越低。而平原人进入高原后机体将发生一系列生理功能紊乱-适应-再紊乱等复杂过程，导致高原病发生，严重的可致死。减压低氧对机体的血液系统、循环系统、神经系统、内分泌系统和物质代谢等有显著影响，导致机体脏器功能、代谢和结构发生改变，形成高原特有疾病(高原病)，如急性缺氧引起高原反应、高原肺水肿和脑水肿，慢性缺氧引起红细胞增多症和心血管疾病。

针对高原病主要的医疗救治手段就是应用抗高原病药物。药物进入体内后，影响机体产生药理作用，同时也被机体代谢清除，大多数药物通过代谢转化而丧失活性，成为水溶性高的物质排出体外。负责药物代谢转化的酶主要包括I相和II相药物代谢酶。I相代谢酶主要包括细胞色素氧化酶P450酶超家族(CYP1A1/2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1、3A4/5/7)、乙醛脱氢酶、乙醇脱氢酶等。II相代谢酶主要包括尿苷三磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)、磺酸转移酶(SULT)、N-乙酰基转移酶(NAT1/2)等，其中P450酶是最主要的药物代谢酶，参与大多数内源物及外源物的代谢解毒以及前致癌物的激活，在药物体内处置过程中发挥重要作用。大量研究发现由于减压低氧对药物代谢酶系统会造成影响，在高原病救治过程中一些常用药物如茶碱具有一定的安全治疗窗，如果不考虑药物代谢酶的变化适当调整药物用量，可能会导致医源性药物毒副作用，影响临床疗效。

现在已有大量的研究关注于减压低氧对药物代谢酶的影响，并取得了一定进展，但目前的相关研究主要集中在长期高原缺氧对肝脏药物代谢酶产生变化的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于建立减压低氧环境下肝外药物代谢酶动态变化的技术体系，能够有效的针对减压低氧对肝外药物代谢酶变化过程的动态影响进行研究。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：减压低氧环境下肝外药物代谢酶动态变化的检测方法，包括以下步骤：1)将大鼠暴露于模拟减压低氧环境中8h～8w，构建减压低氧模型大鼠，以暴露于正常氧环境中相同时间的大鼠为对照组；2)选取3～5个不同暴露时间点的减压低氧模型大鼠处死后，收集肝外代谢器官进行组织匀浆获得组织液，利用所述组织液制备微粒体；3)检测所述微粒体中药物代谢酶的表达量和活性。

优选的，步骤1)中所述人工模拟的减压低氧环境为模拟5000～6000米海拔的高原环境。

优选的，所述减压低氧模型大鼠的红细胞数、红细胞积压和血红蛋白含量显著高于对照组。

优选的，步骤2)中所述的肝外代谢组织器官包括肺脏、肾脏和小肠。

优选的，步骤2)中所述制备微粒体的方法为差速离心法。

优选的，所述药物代谢酶的表达量通过Westernblot方法进行检测。

优选的，所述药物代谢酶的活性通过代谢酶探针底物进行检测。

优选的，所述药物代谢酶包括细胞色素P450超家族酶。

优选的，所述细胞色素P450超家族酶包括大鼠cyp1a1/2酶、cyp2b6酶、cyp2c8酶、cyp2c6酶，cyp2d1酶和cyp3a1酶。

本发明的有益效果：本发明提供的减压低氧环境下肝外药物代谢酶动态变化的评价体系，通过构建减压低氧大鼠模型，大鼠模型连续2周暴露于模拟减压低氧环境中，致血红蛋白含量增加，并处于稳态水平；连续4周暴露于模拟减压低氧环境后导致大鼠出现心肺功能改变等高原病症候。高原红细胞增多症大鼠与常氧组大鼠相比，红细胞计数、红细胞压积、血液粘滞度等显著增高(P<0.05)，高原慢性低氧导致血液系统心肺功能明显改变。本发明还测定不同暴露时间点减压大鼠模型中肝外药物代谢酶的表达量和活性，发现高原低氧暴露过程对大鼠肺脏代谢酶的影响呈现动态变化过程：cyp1a1/2酶活性及表达均下降，cyp2b6酶活性在慢性低氧暴露时出现下降，cyp2c8和cyp2c6慢性低氧暴露时出现活性升高，cyp3a1慢性低氧暴露时出现活性和表达增加。本发明直观的阐明了高原缺氧环境对高原病发生及药物代谢酶变化过程的动态影响。

进一步的本发明同时涵盖了肝脏以外其他器官如肺脏、肾脏和小肠代谢酶变化对药物代谢的贡献；本发明提供的肝外药物代谢酶动态变化检测方法获得的结果可为高原药物应用提供科学参考。

附图说明

图1为减压低氧暴露对大鼠血红蛋白的动态影响；

图2为减压低氧暴露4、8周大鼠血常规红细胞相关指标变化；

图3为减压低氧暴露4、8周对大鼠血黏度的影响；

图4为减压低氧暴露4、8周对大鼠心肺功能的影响；

图5为不同时间减压低氧暴露后大鼠肺脏中Cyp1a1/2活性变化；

图6为不同时间减压低氧暴露后大鼠肺脏中Cyp2b6活性变化；

图7为不同时间减压低氧暴露后大鼠肺脏中Cyp2c8活性变化；

图8为不同时间减压低氧暴露后大鼠肺脏中Cyp2d1活性变化；

图9为不同时间减压低氧暴露后大鼠肺脏中Cyp3a1活性变化；

图10为不同时间减压低氧暴露后大鼠肺脏中Cyp2c6活性变化；

图11为减压低氧暴露4w后大鼠肺脏中Cyp1a1蛋白含量变化；

图12为减压低氧暴露8w后大鼠肺脏中Cyp1a2蛋白含量变化；

图13为减压低氧暴露4w后大鼠肺脏中Cyp3a1蛋白含量变化；

图14为减压低氧暴露8w后大鼠肺脏中Cyp3a1蛋白含量变化。

具体实施方式

本发明提供了减压低氧环境下肝外药物代谢酶动态变化检测方法，包括以下步骤：减压低氧环境下肝外药物代谢酶动态变化的评价体系，包括以下步骤：1)将大鼠暴露于模拟减压低氧环境中8h～8w，构建减压低氧模型大鼠，以暴露于正常氧环境中相同时间的大鼠为对照组；2)选取3～5个不同暴露时间点的减压低氧模型大鼠处死后，收集肝外代谢器官进行组织匀浆获得组织液，利用所述组织液制备微粒体；3)检测所述微粒体中药物代谢酶的表达量和活性。

在本发明中，选用大鼠作为模型动物，所述大鼠优选的为市售大鼠，更优选的为Wistar雄性大鼠。

本发明为了获得减压低氧引发高原病动态发展变化，将所述大鼠暴露于人工模拟的减压低氧环境中8h～8w构建减压低氧模型大鼠；在本发明中所述人工模拟的减压低氧环境优选的为模拟5000～6000米海拔的高原环境，更优选的为5500米海拔的高原环境；在本发明中所述减压低氧环境优选的由低压氧仓来提供。

本发明中所述减压低氧模型大鼠的的红细胞数、红细胞积压和血红蛋白含量显著(p<0.05)高于对照组，说明本发明所述的减压低氧模型大鼠构建成功。在本发明中所述红细胞数、红细胞积压和血红蛋白含量优选的通过检测减压低氧大鼠模型的血液获得，在本发明中所述红细胞数、红细胞积压和血红蛋白含量的检测采用本领域常规的血常规检测方法即可，无其他特殊限定。在本发明具体实施过程中，所述血常规检测采用血常规检测仪进行。

在本发明中，选择3～5个不同暴露时间点的减压低氧模型大鼠的肝外代谢器官进行组织匀浆获得组织液，利用所述组织液制备微粒体。在本发明中，优选选择5个不同暴露时间点获得减压低氧模型大鼠；所述暴露时间点优选的为8h、3d、28d、56d。在本发明中，所述肝外代谢组织器官包括肺脏、肾脏和小肠。所述肝外代谢器官的获取优选的为：将减压低氧模型大鼠处死；立即采集肝外代谢组织器官。在本发明中所述肺脏和肾脏的采集方法为剖开所述处死的减压低氧模型大鼠胸腔和腹腔，取出完整的肺脏和肾脏；然后用-2～0℃的生理盐水清洗；在本发明中，所述小肠的采集方法为采集空肠至回盲部，冲洗干净；优选的剪断肠系膜，剖开所述小肠的肠腔，将肠内容物冲洗干净。本发明在采集获得所述肝外代谢器官后，优选的用滤纸吸干肝外代谢器官的水分，至于-80℃保存。

本发明在采集获得所述肝外代谢器官后，对所述肝外代谢器官进行组织匀浆获得组织液，利用所述组织液制备微粒体。在本发明中所述组织匀浆优选的在将所述肝外代谢器官与蔗糖溶液混合后进行；在本发明中所述肝外代谢器官与蔗糖溶液的质量体积比优选的为1g：(2～4)ml，更优选的为1g:3ml。在本发明中所述蔗糖溶液的浓度优选的为0.2～0.3mol/l，更优选的为0.25mol/l，所述蔗糖溶液的温度优选的为-4～0℃。在本发明中所述匀浆采用本领域常规的匀浆方法即可，在本发明具体实施过程中，所述匀浆采用电动组织匀浆机进行，所述电动组织匀浆机优选为IKAT10basic，所述匀浆时间优选为20～40s，更优选的为30s，本发明所述匀浆后无肉眼可见组织块。

本发明在所述匀浆后利用所述组织液制备微粒体。在本发明中，优选的采用差速离心法制备微粒体。在本发明中，所述差速离心包括以下步骤：将所述组织液进行低温高速离心收集上清液；低温超速离心所述上清液，收集固相组分重悬获得微粒体。

在本发明中所述低温高速离心的温度优选的为2～6℃，更优选的为4℃；所述低温高速离心的转速优选的为(8500～9500)×g，更优选的为9000×g；所述低温高速离心的时间优选的为15～25min，更优选的为20min。本发明在获得上清液后，进行超速离心。在本发明中，所述低温超速离心的温度优选的为2～6℃，更优选的为4℃；所述低温超速离心的转速优选的为(99000～101000)×g，更优选的为100000×g；所述低温超速离心的时间优选为50～70min，更优选为60min。

本发明在所述低温超速离心后，将收集到的固相组分重悬，获得微粒体。在本发明中所述重悬用的缓冲液优选的为Tris-HCl缓冲液；所述Tris-HCl缓冲液的pH值优选的为7.0～7.8；更优选的为7.4；所述Tris-HCl缓冲液优选的含有20％(体积分数)的甘油。本发明在制备获得所述微粒体后优选的将所述微粒体置于-80℃冻存备用。

本发明在获得微粒体后，检测所述微粒体中药物代谢酶的表达量和活性。在本发明中，所述药物代谢酶包括细胞色素P450超家族酶；所述细胞色素P450超家族酶优选的包括大鼠cyp1a1/2酶、cyp2b6酶、cyp2c8酶、cyp2c6酶，cyp2d1酶和cyp3a1酶。

在本发明中，所述药物代谢酶的表达量通过Westernblot方法进行检测，在本发明中所述Westernblot方法采用本领域常规的Westernblot方法步骤即可，无其他特殊要求；在本发明具体实施过程中，所述药物代谢酶表达量的检测优选的包括以下步骤：定量微粒体蛋白浓度、SDS聚丙烯酰胺电泳所述微粒体蛋白、转膜、封闭、加入药物代谢酶特异抗体进行I抗-抗原免疫反应；所述免疫反应过夜后加入II抗进行杂交反应，再加入化学发光试剂，用Bio-Rad凝胶成像系统ChemiDoc^TMXRS成像，获得微粒体中药物代谢酶的表达量。本发明在制备微粒体后，对所述微粒体蛋白浓度进行定量，在本发明中所述微粒体蛋白的浓度采用BCA方法测定浓度，以标准BSA溶液做工作曲线，采用外标法得到待测蛋白的浓度。本发明在所述微粒体蛋白浓度定量后，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳所述微粒体蛋白，所述电泳的浓缩胶电压为80V，分离胶电压为120V；本发明在所述SDS电泳结束后，进行转膜，所述转膜条件为按照正极-滤纸-PVDF膜-胶-滤纸-负极的顺序，固定在转印槽中，160mA恒流转膜；本发明在所述转膜结束后进行封闭，所述封闭的封闭液优选的为5wt％脱脂奶粉，所述封闭具体为室温下缓慢摇荡2h；本发明在所述封闭结束后进行免疫反应，所述免疫反应包括一抗-抗原免疫反应和一抗二抗杂交反应。本发明中所述一抗-抗原免疫反应条件为加入特异性一抗(Anti-Cytochrome>TM>

在本发明中，所述药物代谢酶的活性优选的通过代谢酶探针底物进行检测。在本发明中代谢酶探针底物检测具体的为：将所述药物代谢酶探针底物与微粒体混合预孵育后加入NADPH后孵育反应25～35min检测产物的生成量。在本发明中所述微粒体中蛋白质的浓度优选的为0.3～0.7mg/ml，更优选的为0.5mg/ml。

在本发明中，所述药物代谢酶探针底物相对于药物代谢酶为过量的，在本发明中所述代谢酶探针底物优选为包括非那西丁(50μM)、安非他酮(100μM)、阿莫地喹(2.5μM)、双氯芬酸(10μM)、S-美芬妥因(100μM)、右美沙芬(10μM)和咪达唑仑(5μM)的混合物。在本发明中所述预孵育的温度优选的为37℃，所述预孵育的时间优选的为3～7min，更优选的为5min。在本发明中所述NADPH的浓度优选的为0.8～1.2mM，更优选的为1.0mM；在本发明中所述孵育的时间优选的为30min。

本发明在检测产物生成量前优选的向所述微粒体中加入2倍体积的含内标(普萘洛尔)的冰乙腈溶液终止反应。在本发明中，所述产物生成量的检测优选的采用LC-MS/MS方法。在本发明中，所述LC-MS/MS方法的具体步骤和采用采用本领域常规步骤和参数即可。

发明中获得的不同暴露时间点的减压低氧模型大鼠的肝外药物代谢酶的表达量和活性能够动态反映出减压低氧暴露不同时间对肝外器官代谢酶功能和表达的影响，高原低氧暴露过程对大鼠肺脏代谢酶的影响呈现动态变化过程：cyp1a1/2酶活性及表达均下降，cyp2b6酶活性在慢性低氧暴露时出现下降，cyp2c8和cyp2c6慢性低氧暴露时出现活性升高，cyp3a1慢性低氧暴露时出现活性和表达增加；进而总结药物代谢酶在急进高原、高原习服、高原病发展等过程的规律，为不同阶段药物合理应用提供依据。

下面结合实施例对本发明提供的减压低氧环境下肝外药物代谢酶动态变化的检测方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

减压低氧模型大鼠肺脏药物代谢酶动态变化特征

实验设计及分组：64只Wistar雄性大鼠随机分为8组(n＝8)，分为常氧饲养8h，3天，4周和8周组，以及低压氧仓模拟5500高原，每天减压低氧暴露8小时，分为8h、3天、4周和8周暴露组。实验流程及方法：常氧对照组，常规饲养；模型对照组将大鼠放入低压氧仓中模拟5500米高原环境，暴露不同时间点(如8h、3天、4周、8周)取出终止实验。实验结束后测定血常规相关指标判断减压低氧致高原病模型的建立验证。

具体结果如图1～4所示，图1为减压低氧暴露对大鼠血红蛋白的动态影响，可以看出低氧模型组的血红蛋白含量显著高于对照组，图1中与常氧对照组相比*为P<0.05，**为P<0.01，可以看出减压低氧暴露2周后可导致大鼠血红蛋白升高。图2为减压低氧暴露4、8周大鼠血常规红细胞相关指标变化，其中与常氧对照组相比*为P<0.05，**为P<0.01，#为P<0.05,##为P<0.01vs.低氧模型组，结果表明，间断性低氧能导致大鼠红细胞计数、血红蛋白含量及红细胞压积的升高。图3为减压低氧暴露4、8周对大鼠血黏度的影响，其中，与常氧对照组相比*为P<0.05，**为P<0.01；结果表明减压缺氧模型组与正常组相比，血液粘滞度显著升高。图4为减压低氧暴露4、8周对大鼠心肺功能的影响，其中与常氧对照组相比*为P<0.05，**为P<0.01。

以上结果显示，大鼠模拟海拔5500米，连续2周可致大鼠血红蛋白含量增加，并处于稳态水平；减压低氧4周后可导致大鼠出现心肺功能改变等高原病症候。高原红细胞增多症大鼠与常氧组大鼠相比，红细胞计数、红细胞压积、血液粘滞度等显著增高(P<0.05)，高原慢性低氧导致血液系统心肺功能明显改变。

将所述大鼠处死后，剖开所述处死的减压低氧模型大鼠胸腔，取出完整的肺脏用滤纸吸干肺脏水分，至于-80℃保存。

将肺脏按1:3(3ml/g组织)加入0.25mol/L的冰蔗糖溶液后，用电动组织匀浆机(IKAT10basic)进行组织匀浆，将制备好的组织匀浆置低温高速离心机中4℃，9000×g，离心20min，取离心上清液，置超速离心管中，4℃，100,000×g，离心1h，弃上清。微粒体板用pH7.4含20％甘油的Tris-HCl缓冲液中重悬，得到肺微粒体溶液，-80℃冻存备用。

应用Westernblot方法进行药物代谢酶蛋白表达测定：提取定量微粒体蛋白并定量蛋白浓度、SDS聚丙烯酰胺电泳结束后转膜、封闭、加入药物代谢酶特异抗体进行I抗-抗原免疫反应过夜后加入II抗进行杂交反应，加入化学发光试剂，用Bio-Rad凝胶成像系统ChemiDoc^TMXRS成像。

在蛋白浓度为0.5mg/ml的微粒体孵育液中加入7个主要代谢酶同工酶混合特异探针底物，包括非那西丁(50μM)、安非他酮(100μM)、阿莫地喹(2.5μM)、双氯芬酸(10μM)、S-美芬妥因(100μM)、右美沙芬(10μM)、咪达唑仑(5μM)，37℃预孵育5分钟后加入1mM的NADPH启动反应，孵育30min后加入2倍体积的含内标(普萘洛尔)的冰乙腈溶液终止反应，离心取上清，LC-MS/MS测定孵育液中各底物对应产物的生成量。

减压低氧对大鼠肺脏药物代谢酶活性及蛋白表达的影响具体结果见图5～11，并分别与对照组比较。

图5为不同时间减压低氧暴露后大鼠肺脏中Cyp1a2活性变化(与常氧组比较：*为P<0.05，**为P<0.01)该图结果显示大鼠肺脏微粒体中cyp1a酶活性随低氧暴露时间逐渐降低；

图6为不同时间减压低氧暴露后大鼠肺脏中Cyp2b6活性变化(与常氧组比较：*为P<0.05，**为P<0.01)该图结果显示大鼠肺脏微粒体中cyp2b6酶活性在长期低氧暴露后降低；

图7为不同时间减压低氧暴露后大鼠肺脏中Cyp2c8活性变化(与常氧组比较：*为P<0.05，**为P<0.01)该图结果显示大鼠肺脏微粒体中cyp2c8酶活性在长期低氧暴露后逐渐升高；

图8为不同时间减压低氧暴露后大鼠肺脏中Cyp2d1活性变化(与常氧组比较：*为P<0.05，**为P<0.01)该图结果显示大鼠肺脏微粒体中cyp2d1酶活性对低氧暴露无明显影响；

图9为不同时间减压低氧暴露后大鼠肺脏中Cyp3a1活性变化(与常氧组比较：*为P<0.05，**为P<0.01)该图结果显示大鼠肺脏微粒体中cyp3a1酶活性在长期低氧暴露后逐渐升高；

图10为不同时间减压低氧暴露后大鼠肺脏中Cyp2c6活性变化(与常氧组比较：*为P<0.05，**为P<0.01)该图结果显示大鼠肺脏微粒体中cyp2c6酶活性在长期低氧暴露后逐渐升高；

图11为减压低氧暴露4w后大鼠肺脏中Cyp1a1蛋白含量变化；图12为减压低氧暴露8w后大鼠肺脏中Cyp1a2蛋白含量变化；图13为减压低氧暴露4w后大鼠肺脏中Cyp3a1蛋白含量变化；图14为减压低氧暴露8w后大鼠肺脏中Cyp3a1蛋白含量变化。

以上结果初步表明，高原低氧暴露过程对大鼠肺脏代谢酶的影响呈现动态变化过程，包括cyp1a酶活性及表达均下降，cyp2b6酶活性在慢性低氧暴露时出现下降，cyp2c8和cyp2c6慢性低氧暴露时出现活性升高，cyp2d1没有明显变化，cyp3a1慢性低氧暴露时出现活性和表达增加等变化，结合代谢酶变化指导高原用药将会增加临床给药的安全性和有效性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。