一种链球菌新种HTS20及其应用

摘要

本发明提供了一种链球菌，其为链球菌属里的一个新种，命名为：Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20，在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏编号为CGMCC 15343。本发明的Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20在多种发酵培养基中进行培养，均可产生较强的抑菌活性物质，且对金黄色葡萄球菌和白假丝酵母菌都有较明显的抑菌作用，在对金黄色葡萄球菌和白假丝酵母菌等所致疾病的防治中具有广阔的发展空间，在抗菌药物方面具有很好的开发应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种链球菌新种HTS20及其应用。

背景技术

抗生素和合成抗菌药物的发明和应用是20世纪医药领域最伟大的成就之一。人类应用抗生素和合成抗菌药物有效地治愈了各类严重的细菌感染性疾病，卓有成效地降低了各种严重细菌感染性传染病的死亡率，进而掀起了抗菌药物的研发和广泛应用的高潮。

20世纪中叶，已上市的的抗生素原料药已达500余种，其在临床常用品种亦高达数百余种。人类在抗菌药物开发应用所获巨大成就面前，开始藐视感染性疾病的危险，对抗生素及合成抗菌药物的应用也变得为所欲为。

20世纪70年代后期，一个超级大国的医学总署曾声称对“传染病的研究总算告一段落。现在最重要的事就是研究癌症和心血管病”。但这种自信很快就被严酷的事实所打碎，人们发现一些原本容易治疗的细菌感染性疾病现在有了新的变化，原本有效的抗生素或合成抗菌药物已经不再能有效控制感染了。致病细菌对抗生素产生耐药的事实，很快就被证实，而且一些致病菌耐药性发生和传播的势头令人瞠目。因此，控制抗生素滥用的同时，需要不断地寻求新的抗菌途径。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种链球菌，具有较强的抑菌活性，在抗菌药物方面具有良好的开发应用前景。

本发明的第一个方面是提供一种链球菌，其为链球菌属里的一个新种，命名为：Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20，在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏编号为CGMCC 15343。

本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的链球菌在拮抗金黄色葡萄球菌中的应用。

本发明的第三个方面是提供本发明第一个方面所述的链球菌在制备防治金黄色葡萄球菌所致病症药物中的应用。

本发明的第四个方面是提供本发明第一个方面所述的链球菌在拮抗白假丝酵母菌中的应用。

本发明的第五个方面是提供本发明第一个方面所述的链球菌在制备防治白假丝酵母菌所致病症药物中的应用。

本发明的第六个方面是提供本发明第一个方面所述的链球菌的发酵液或发酵液的过滤液。

本发明的第七个方面是提供本发明第六个方面所述的链球菌的发酵液或发酵液的过滤液在拮抗金黄色葡萄球菌中的应用。

本发明的第八个方面是提供本发明第六个方面所述的链球菌的发酵液或发酵液的过滤液在制备防治金黄色葡萄球菌所致病症药物中的应用。

本发明的第九个方面是提供本发明第六个方面所述的链球菌的发酵液或发酵液的过滤液在拮抗白假丝酵母菌中的应用。

本发明的第十个方面是提供本发明第六个方面所述的链球菌的发酵液或发酵液的过滤液在制备防治白假丝酵母菌所致病症药物中的应用。

本发明的链球菌Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20为革兰阳性，过氧化氢酶阴性，排列成链状的球形菌，初步代表链球菌的新成员。16S rRNA基因序列的研究表明，Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20与S.cuniculi,S. acidominimus和S.marmotae的相似性分别为98.1％，97.5％和97.2％。保守序列sodA基因序列分析表明，Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20与S. marmotae的相似性最近，为94.7％；rpoB基因序列分析表明，Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20与S.cuniculi的相似性最近，为94.6％；groEL序列分析表明，Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20和S.himalayensis的相似度最高，为85.5％。通过对Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20进行Pacbio全基因组测序分析，DNA-DNA分子杂交实验表明Streptococcus zengyii sp.nov. HTS20与其他已知链球菌的杂交比值介于19.9％～29.3％之间，均低于70％。对其表型特征和系统发育研究的基础上，提出了该菌株被归类为链球菌属的一个新种，Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20基因组大小为1,941,976bp，包含 1865个基因，GC含量为42.9mol％。

本发明的链球菌Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20在多种发酵培养基中进行培养，均可产生较强的抑菌活性物质，且对金黄色葡萄球菌和白假丝酵母菌都有较明显的抑菌作用，在对金黄色葡萄球菌和白假丝酵母菌等所致疾病的防治中具有广阔的发展空间，在抗菌药物方面具有很好的开发应用前景。

附图说明

图1为Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20在哥伦比亚血平板菌落形态图(37℃,36h)。

图2为Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20在哥伦比亚血平板出现α溶血现象(37℃,48h)。

图3为Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20革兰染色图。

图4为Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20扫描电镜图。

图5为基于16SrDNA基因序列构建的Streptococcus zengyii sp.nov. HTS20和链球菌属主要群模式株系统发生关系图。

图6为基于保守基因序列构建的Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20的进化树。

图7为Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20的发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌试验结果图。

图8为Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20的发酵液对白假丝酵母菌的抑菌试验结果图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。

本发明提供了一种链球菌，其为链球菌属里的一个新种，命名为： Streptococcus zengyii，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.15343，保藏日期为2018-02-06，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明的链球菌Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20从喜马拉雅旱獭呼吸道标本中分离、筛选得到。

1链球菌新种形态学观察

1.1菌株来源

喜马拉雅旱獭呼吸道标本。取健康成年旱獭气管粘膜标本，采用无菌操作剪取旱獭气管内壁组织置入研磨器中进行研磨(约20mg)，研磨后的粘膜匀浆用 300μL脑心浸液(BHI)稀释，然后转移已装有1.5 mL PBS的2mL无菌离心管内高速涡旋，之后低速离心，小心吸取约两百微升上清液，用涂布棒均匀涂布于 BHI羊血平板上，置于5％CO₂培养箱37℃培养，一式三份，用于筛选需氧菌。>

将经分离纯化的链球菌新种转接到哥伦比亚血平板上，置5％CO₂培养箱>

1.3 Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20氯化钠耐受实验(表1)

表1 Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20氯化钠耐受

2.5g/L 3.5g/L 4.5g/L 6.5g/L HTS20 + － － －

Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20在含2.5％NaCl的BHI培养基上生长，在超过2.5％NaCl的BHI上不生长。

1.4 Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20温度耐受实验(表2)

表2 Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20温度耐受

Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20在22、30、37、42℃培养时生长， 4、15℃时不生长。

2生化实验鉴定

2.1 API Rapid ID 32Strep生化反应鉴定

将分纯的菌体接种到哥伦比亚血平板，置于CO₂培养箱37℃培养18-24h。首先记录溶血类型(α或β)和产色素情况(作为补充实验)。然后用棉拭子或接种环挑取足够的菌落到2mL的API悬浮培养基安瓿瓶里，采用比浊计测定，得到4.0麦氏浊度菌悬液，然后将该悬液转加入到反应孔中，每孔分别加入55μL，轻微震荡混匀，盖上反应盖，置于CO₂培养箱37℃培养4-4.5h之后观察结果，见表3。

2.2 API 50CH生化反应鉴定

将分纯的菌体接种到哥伦比亚血平板，置于CO2培养箱37℃培养18-24h。然后用棉拭子或接种环挑取足够的菌落到1mL蒸馏水中，得到4.0麦氏浊度，然后将该悬液转移到API50CHB培养基安瓿瓶中，混匀，然后将该悬液转加入到反应孔中，每孔分别加入100μL，最后每孔滴加甘油保湿，盖上反应盖，置于 CO2培养箱37℃培养24h之后观察结果，见表3。

2.3 API ZYM生化反应鉴定

将分纯的菌体接种到哥伦比亚血平板，置于CO2培养箱37℃培养18-24h。然后用棉拭子或接种环挑取足够的菌落到2mL的API悬浮培养基安瓿瓶里，制备浊度为6.0麦氏浊度，然后将该悬液移API 50CHB培养基安瓿瓶中，混匀，然后取65μL菌悬液加入到各反应杯中，混匀，盖上生化鉴定试剂条上的反应盖，置于CO2培养箱37℃培养4-4.5h之后观察结果，见表3。

表3 Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20与其他近源链球菌生化反应结果比较

3链球菌新种16SrRNA分类鉴定

基因组DNA提取，16S rRNA序列PCR扩增，PCR扩增产物直接送北京擎科生物科技有限公司，经公司纯化后进行序列测定。

数据统计分析：首先采用SeqMan软件、DNAstar软件对所得序列进行拼接，正反向检测，并去除载体和引物序列。之后使用MAGA 6.0软件，采用邻近-连接法和最大似然法构建系统进化发生树，最后对所生成的进化树运用 Bootstrap进行检验。以肠球菌属Enterococcus faecalis ATCC 19433^T作为外群。结果如图5所示，可以看出Streptococcus>

4链球菌新种保守基因分类鉴定

为了进一步鉴定链球菌新种的分类地位，研究它们与已知链球菌的亲缘关系远近，本课题针对其保守基因sodA、rpoB和groEL开展了分类鉴定研究。

Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20的sodA、rpoB和groEL扩增序列与 Genbank中序列进行Blast比对分析，结果显示与其identity值高的近源种均属于链球菌属的“Suis group”。其中sodA基因Blast比对分析，Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20与S.marmotae的相似性最近，为94.7％；rpoB基因 Blast比对分析，Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20与S.cuniculi的相似性最近，为94.6％。由图6可以看出Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20作为一个单独分支聚在一起，与S.cuniculi和S.acidominimus的亲缘关系相对较近，研究表明从三个保守基因(sodA、rpoB和groEL)分类水平支持Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20属于链球菌属里一个新种，该菌与S.cuniculi和S. acidominimus有较近的亲缘关系。该结果与其16SrRNA序列构建的进化树结果相吻合。

5链球菌新种基因组学分析

本课题在获得Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20的纯培养后，进行了全基因组测序，对其基因组基本特征进行了预测分析，并对模式株与链球菌属其他已知种进行了遗传进化分析。

5.1全基因组测序及组装

Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20的全基因组测序工作由北京诺和生物有限公司完成。采用三代测序平台Pacific Biosciences的单分子实时测序技术对Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20全基因组进行测定，采用SMRT Analysis 2.3.0软件包对测序数据进行质控过滤，拼接组装成完整的环状基因组序列。

5.2基因组基本特征分析

运用GeneMarkS(http://topaz.gatech.edu/)软件进行编码基因CDS预测，运用tRNAscan-SE和rRNAmmer软件预测基因组中tRNAs和rRNA。运用 IslandPath-DIOMB软件进行基因岛预测。本研究通过三代测序平台Pacific Biosciences(PacBio)对从喜马拉雅旱獭呼吸道分离到的Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20进行全基因组测序。Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20基因组全长1,941,976bp，G+C含量为42.9mol％，编码1,865个基因。

6基因组DNA-DNA杂交

使用DNA-DNA杂交在线软件(genome and genome distance calculator， GGDC)对Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20的全基因组序列与目前 GenBank库中能检索到的65个链球菌不同种的代表序列进行在线基因组杂交， DNA-DNA杂交相似性大于70％被划分为同一个种。结果见表4。

本研究将Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20全基因组序列与DDH数据库中收录的链球菌属已知种的代表性基因组序列进行DNA-DNA在线杂交，从表 4可以看出，Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20与其他已知链球菌的杂交比值介于19.9％～29.3％之间，均低于70％的阈值，说明Streptococcus zengyii sp. nov.HTS20不属于任何已知种，是链球菌属的一个新种。

表4.Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20链球菌与已知链球菌不同种基因组杂交结果

7抑菌活性

采用不同的发酵培养基对Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20进行发酵培养获得相应的抗菌活性物质，以滤纸片琼脂扩散法测定发酵液的抑菌作用，具体操作步骤如下，结果见图7和图8，具体分析结果见表5。

7.1 Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20发酵提取物的制备：

用接种环分别在血琼脂平板上挑取形态相似的Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20单菌落10～15个，分别接种于发酵培养液Ⅰ，发酵培养液Ⅱ和发酵培养液Ⅲ中，每种发酵培养液各1500mL，37℃，180转摇床培养36h。

将发酵培养液13,000rpm离心20min后取发酵上清液(若离心后，除菌效果不佳，可用微孔滤膜再次过滤除菌)。

采用乙酸乙酯萃取法进行萃取，分别得到81.3mg(发酵培养液Ⅰ)，74mg (发酵培养液Ⅱ)和65.4mg(发酵培养液Ⅲ)发酵提取物。

用甲醇将分别将3种发酵提取物稀释至浓度为5mg/50μL备用。

7.2测试菌株(金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌)MH平板的制备：

用接种环分别在血琼脂平板上挑取形态相似的金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌5～10个，分别移种于肉汤管中。

37℃温箱培养4～6h，与标准比浊管(0.5麦氏浊度)比较，若菌液浓度太浓时，可用肉汤或生理盐水稀释至与标准比浊管浊度相同。

分别用无菌棉签沾取金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌菌液，并在管壁上挤去多余的菌液后，分别涂布于MH平板上(注意：涂布要均匀、致密)，待干。

7.3测试方法(滤纸片琼脂扩散法)：

分别在每张直径0.8cm的无菌滤纸片上加入25μL浓度为5mg/50μL的 Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20发酵提取物，待发酵提取物中的有机溶剂挥发干净后，用无菌镊子分别夹取纸片，贴到已经涂布测试菌株菌液的MH平板上，每个平皿贴3个样品滤纸片(分别是发酵培养液Ⅰ，发酵培养液Ⅱ和发酵培养液Ⅲ的提取物)。完成上述操作后，将培养皿于37℃培养12h后观察测试结果及记录数据，用游标卡尺测量抑菌圈大小。每个样本做3个，计算取其平均值。

表5 Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20的抑菌结果

指示菌培养基 金黄色葡萄球菌 白假丝酵母菌 发酵培养基Ⅰ(LB) 8-10mm 11-13mm 发酵培养基Ⅱ(营养肉汤) 8-10mm 9-11mm 发酵培养基Ⅲ(BHI) 5-7mm 9-10mm

上表中的发酵培养基Ⅰ包括以下成分的重量配比：胰蛋白胨10.0g/L；酵母提取物5.0g/L；NaCl10.0g/L；pH7.0。发酵培养基Ⅱ包括以下成分的重量配比：蛋白胨10.0g/L；牛肉粉3.0g/L；氯化钠5.0g/L；pH7.0。发酵培养基Ⅲ包括以下成分的重量配比：蛋白胨10.0g/L；脱水小牛脑浸粉12.5g/L；脱水牛心浸粉 5.0g/L；氯化钠5.0g/L；葡萄糖2.0g/L；磷酸氢二钠2.5g/L；pH7.4。

从表5的抑菌活性分析结果可以看出，本发明的Streptococcus zengyii sp.nov.HTS20菌株在不同的发酵培养基中进行培养，均可产生较强的抑菌活性物质，且对金黄色葡萄球菌和白假丝酵母菌都有较明显的抑菌作用。因此，本发明的菌株在抗菌药物方面具有潜在的应用前景。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。