FOXM1抑制剂FDI-6抗肝纤维化的应用

摘要

本发明公开了一种FOXM1抑制剂FDI‑6在抗肝纤维化中的应用，所述衍生物的名称为：3‑氨基‑N‑（4‑氟苯基）‑6‑（噻吩‑2‑基）‑4‑（三氟甲基）噻吩并[2,3‑b]吡啶‑2‑甲酰胺，其作用机制为通过抑制FOXM1的表达，同时下调Collagen I和αSMA的表达从而发挥相应的抗肝纤维化作用。其所述的造成肝纤维化的疾病主要包括但不限于：慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、毒素和药物、自身免疫性肝病、肝淤血、遗传代谢性疾病等。

说明书

技术领域

本发明涉及一种FOXM1抑制剂FDI-6，以及该化合物抗肝纤维化的应用。

背景技术

肝纤维化与肝脏的慢性炎性反应紧密相关，由轻微炎性反应发展为重度炎性反应，最后发展至肝纤维化，乃至肝硬化，这一过程是包括慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、毒素和药物、自身免疫性肝病、肝淤血和遗传代谢性疾病等在内的多数慢性肝病共同遵循的病理过程。目前认为肝纤维化是肝脏中胶原蛋白等细胞外基质（ECM）的增生与降解失衡，进而导致肝脏内纤维结缔组织异常沉积的可逆性病理过程，反映出肝脏修复和瘢痕形成的一个平衡过程。不同病因导致肝细胞分泌各种生长因子、炎性因子、蛋白酶类及纤维化细胞因子，刺激肝星状细胞（HSC）及其他类型的细胞活化、转变为肌成纤维样细胞，从而分泌大量ECM，持续紊乱的损伤修复使得肝脏正常结构被破坏，肝细胞数量减少，肝小叶结构改变，血管结构紊乱，是肝纤维化形成的共同机制。大多数肝纤维化进程缓慢，当发展到肝硬化时，则病变不仅仅只是ECM的大量沉积，此时的肝脏同时伴有假小叶形成，血流动力学改变以及肝功能衰竭风险的显著增加。我国是一个肝炎大国，患有不同类型肝炎的患者高达上亿，随着疾病的发展，这些患者的肝脏都有不同程度的肝纤维化，这些患者在进行抗病毒治疗的同时急需药物进行抗肝纤维化治疗，而目前临床上缺乏有效的治疗肝纤维化药物。现有的治疗肝炎的抗病毒药物比如拉米夫定、干扰素、阿德福韦酯和索非布韦等并不能有效逆转患者肝纤维化。所以开发有效治疗肝纤维化的药物势在必行。从分子水平探究肝纤维化发生发展的机制，可能为其防治提供新的思路。

FDI-6是一种针对人叉头盒M1转录因子（Forkhead Box M1, FOXM1）的特异性抑制剂。FOXM1，又被称为 HFH-11、MPP-2和WIN，属于Forkhead家族转录因子，共享该家族中进化上保守的“翼状螺旋”DNA结合结构域。FOXM1通过其下游的促进细胞周期转化的靶基因和细胞周期调节关键分子的表达，调控细胞有丝分裂和细胞增殖。有文献报道FOXM1转录因子是肝脏修复过程中巨噬细胞浸润的必须因子（Mol Cell Biol. 2010, 30(22):5381-93）。那么，FOXM1与肝纤维化是否存在关联，迄今为止未见报道。通过GEO数据库临床样本分析，申请人发现GSE25097和GSE14323中，FOXM1在肝硬化组织的表达明显高于正常组织。行左、中胆总管结扎术（LMBDL）或者四氯化碳（CCl₄）诱导的肝纤维化小鼠FOXM1的表达也明显上调。提示FOXM1与肝纤维化的发生呈正相关。基于以上认识，本发明决定对FOXM1的特异性抑制剂FDI-6的抗肝纤维化作用进行细胞和动物两个层次的研究，结果表明FDI-6下调FOXM1表达的同时，对行LMBDL或者CCl₄诱导的肝纤维化病理过程以及肝星状细胞的活化均有很好的拮抗作用，从而发现该化合物应用于肝纤维化治疗这一新用途。

发明内容

本发明基于转录因子FOXM1在肝纤维化组织中高表达，其特异性抑制剂FDI-6可以下调FOXM1表达从而发挥抗肝纤维化作用的发现，发明的目的是有针对性的向肝纤维化患者提供一种新的治疗手段。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：给予肝纤维化患者施用FOXM1特异性抑制剂FDI-6，在下调FOXM1表达的同时，下调Ⅰ型胶原（CollagenⅠ, COL-Ⅰ）和α肌动蛋白（αSMA）等肝纤维化标志物的表达从而达到靶向治疗、显著缓解肝纤维化的目的。

上述方案中所述的的FDI-6其全名为：3-氨基-N-（4-氟苯基）-6-（噻吩-2-基）-4-（三氟甲基）噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺，其化学结构式如下：

除本发明直接描述的化合物外，还包括该化合物的结构衍生物、药用型盐类、药用型盐类的给药载体、制成的不同剂型、给药剂量、给药途径等。

上述方案中所述的FDI-6，作用靶标为FOXM1。本发明从细胞和动物两个层次对FOXM1的特异性抑制剂FDI-6的抗肝纤维化作用进行了研究，结果表明：FDI-6在下调FOXM1表达的同时，对行LMBDL或者CCl₄诱导的肝纤维化病理过程以及肝星状细胞的活化均有很好的拮抗作用，可以下调CollagenⅠ和αSMA等肝纤维化标志物的表达从而发挥抗肝纤维化作用。

上述方案中所述的造成肝纤维化的疾病主要包括但不限于：慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、毒素和药物、自身免疫性肝病、肝淤血、遗传代谢性疾病等。这些疾病发展到一定阶段都会导致一定程度的肝纤维化。

根据以上发明内容，具有FDI-6类似结构的衍生物均能通过本发明所述机制（即：下调FOXM1、Collagen 和αSMA的表达）发挥抗肝纤维化作用。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

抗纤维化效果显著，作用机制明确——下调FOXM1。

附图说明

图1 A为实施例1中FOXM1 mRNA在人肝硬化（肝纤维化发展后期） 和正常组织的差异表达 （GSE25097）。

图1 B为实施例1中FOXM1 mRNA在人肝硬化和正常组织的差异表达 （GSE14323）。

图2A显示了实施例2和实施例4中假手术组（Sham组）和胆总管结扎术组（BDL组）小鼠FOXM1 mRNA表达的检测结果。

图2B显示了实施例3和实施例4中对照组（Oil）和给予四氯化碳（CCl₄）小鼠FOXM1mRNA表达的检测结果。

图3A为实施例5中显微镜下观察体外分离的小鼠肝星状细胞（mHSC）第5天活化与静息期第1天的形态差异。

图3B为实施例4和实施例5中体外分离的mHSC第5天活化与静息期第1天的FOXM1mRNA含量的检测结果。

图4A为实施例4和实施例5中mHSC体外培养5天和加入FDI-6组的FOXM1 mRNA含量的检测结果。

图4B为实施例5和实施例6中mHSC体外培养5天和加入FDI-6组的FOXM1蛋白表达的检测结果。

图5A为实施例4对照组和FDI-6组作用于人肝星状细胞系LX-2细胞后FOXM1、Collagen I和αSMA mRNA表达的检测结果。

图5B为实施例6中对照组和FDI-6组作用于人肝星状细胞系LX-2细胞后FOXM1、Collagen I和αSMA蛋白表达的检测结果。

图6A为实施例2中Sham、LMBDL加生理盐水（Saline）和加FDI-6组小鼠肝脏形态的观察结果。

图6B为实施例2和实施例7中Sham、LMBDL加Saline和加FDI-6组小鼠肝脏HE染色和天狼星红染色结果。

图7A为实施例2和实施例8中Sham、LMBDL加Saline和加FDI-6组小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)的检测结果。

图7B为实施例2和实施例8中Sham、LMBDL加Saline和加FDI-6组小鼠血清谷草转氨酶(AST)的检测结果。

图8A为实施例2和实施例9中Sham、LMBDL加Saline和加FDI-6组小鼠肝脏中FOXM1蛋白表达的检测结果。

图8B为实施例2和实施例4中Sham、LMBDL加Saline和加FDI-6组小鼠肝脏中FOXM1mRNA含量的检测结果。

图9A为实施例3中Oil、CCl₄加Saline和加FDI-6组小鼠肝脏形态的观察结果。

图9B为实施例3和实施例4中Oil、CCl₄加Saline和加FDI-6组小鼠FOXM1、CollagenI和αSMA的mRNA表达的检测结果。

图9C为实施例3和实施例8中Oil、CCl₄加Saline和加FDI-6组小鼠血清ALT和AST的检测结果。

图10A 为实施例3和实施例5 中CCl₄加Saline和加FDI-6组mHSC显微镜下观察的结果。

图10B 为实施例3、4和实施例5中 CCl₄加Saline和加FDI-6组mHSC>

具体实施方式

实施例1：通过网上更严重的肝纤维化——肝硬化组织基因表达谱（geneexpression omnibus, GEO ）数据库作临床样本分析。

实验材料：GSE25097和GSE 14323两个肝硬化数据库。

实验方法：网上调研肝硬化GEO数据库GSE25097和GSE 14323筛选FOXM1的差异表达。

实验结果：两个数据库均呈现，FOXM1在肝硬化组织中的表达明显高于正常组织。

实施例2：左中胆总管结扎术(LMBDL)诱导的小鼠肝纤维化。

实验材料：C57L/6小鼠，3%戊巴比妥钠溶液，手术器械。

实验方法：12周龄雄性C57BL/6小鼠选用3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉，切开腹腔皮肤及肌肉层，游离胆总管，行左中胆总管结扎，缝合腹腔。

实验结果：约10天后检测ALT和AST均明显升高，HE和天狼星红染色呈现明显的肝纤维化效果。

实施例3：四氯化碳(CCl₄)诱导的小鼠肝纤维化。

实验材料：C57L/6小鼠、CCl₄溶液、橄榄油、1ml注射器。

实验方法：12周龄雄性C57BL/6小鼠，腹腔注射橄榄油稀释的CCl₄溶液(按体积比，CCl₄:>

实验结果：约4周后检测ALT和AST均明显升高，HE和天狼星红染色呈现明显的肝纤维化效果。

实施例4：逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测小鼠肝组织FOXM1 mRNA的表达。

实验材料：RNA提取试剂盒，RT逆转录试剂盒、FOXM1引物、实时荧光定量PCR仪和qPCR反应试剂Taq酶等。

实验方法：参照RNA提取试剂盒说明书提取RNA，参照RT逆转录试剂盒说明书逆转录为cDNA，应用qPCR反应试剂进行qPCR反应。

实验结果：模型组FOXM1的mRNA表达比假手术组明显增强。

实施例5：小鼠肝星状细胞（mHSC）分离。

实验材料：C57L/6小鼠、3%戊巴比妥钠溶液、75%酒精消毒、D-Hank's液（含肝素 25U/mL）、链霉蛋白酶溶液、含 1% DNaseⅠ的链霉蛋白酶/胶原酶溶液、分离肝细胞的Masterflex蠕动泵、显微镜、离心机、DMEM培养基和胎牛血清等。

实验方法：参照文献（生物技术通讯, 2017; 28(5): 600- 603），小鼠麻醉后备毛、仰卧位固定，腹部打开暴露门静脉及下腔静脉，将输液针插入门静脉结扎固定，用 D-Hank's液（含肝素 25 U/mL）灌注肝脏，当肝脏充盈后反复打开、关闭下腔静脉，充分灌注 3min；更换链霉蛋白酶溶液（0.05%）继续灌注5 min，再换Ⅳ型胶原酶溶液（1%）灌注 7 min；当肝脏表面呈龟背样变时，摘除肝脏置于无菌器皿中，剔除肝脏背膜，剪碎肝脏组织，加入含 1% DNaseⅠ的链霉蛋白酶/胶原酶溶液 5 mL，37℃消化 25 min，用 70μm 孔径的细胞筛滤除未消化组织；将上清细胞悬液低温 40 r/min 离心 3 min，继续低温 580 r/min 离心8 min，取细胞沉淀，加入 8 mL 无血清DMEM培养基重悬混匀；将2 mL细胞悬液按同等比例分别缓慢加到 50%、25% Percoll 分离液中，低 温 900 r/min 离 心 20 min，小 心 吸取 25% 与50% Percoll 之间的细胞层，加入无血清 DMEM 培养基，继续 900 r/min 离心10 min，最终将上清液加入含20%胎牛血清的DMEM培养基培养。以 2~5×10⁵/mL>2、37℃条件下培养，36~48>

实验结果：新分离的HSCs在倒置显微镜下呈球形，折光性强，悬浮于培养液中；4 h后大部分细胞已贴壁，呈扁圆型，内含光亮的脂滴，少量细胞已开始伸突；至 48 h 可见大量细胞伸展生长；培养 7 d 后，HSCs 已充分展开，体积明显增大，细胞呈典型的星形或多边形，细胞内颗粒明显减少，细胞逐渐融合，增殖细胞形态较大，并呈局灶性生长，被完全激活。Ⅰ型胶原蛋白和αSMA是HSCs成熟活化后分泌产生的标志分子。

实施例6：Western blot检测FDI-6对人肝纤维化细胞系LX-2细胞中FOXM1、Collagen I和αSMA表达的影响。

实验材料：LX-2细胞株、FDI-6、细胞裂解液、PMSF、细胞刮匙、PBS液、BCA蛋白定量试剂盒、去离子水、脱脂奶粉、FOXM1、Collagen I、αSMA和β-actin一抗及对应的二抗等。

实验方法：Western blot检测：细胞以预冷的PBS洗涤3-4次之后，用滤纸吸干残余的PBS液体，在50ml培养瓶中加50μlRIPA，以及100mol/L的PMSF0.5μl(100:1)冰上作用30分钟后，以细胞刮匙刮取蛋白，吸出蛋白于EP管中，超声，12000rpm，30分钟，4℃离心；96孔板每孔加蛋白样本3ul,去离子水17μl,BCA液200μl(50:1).并设两个空白对照组。37℃，30分钟。酶联免疫测OD值（570nm），根据OD值计算蛋白浓度；煮蛋白、上样、凝胶电泳、转膜、封闭，依次孵一抗和对应的二抗、显影。

实验结果：FDI-6可显著下调LX-2细胞FOXM1、Collagen I和αSMA的蛋白表达。

实施例7：HE染色和天狼星红染色观察FDI-6对胆总管结扎诱导的小鼠肝纤维化的影响。

实验材料：照相机、组织切片制作、显微镜。

实验方法：多聚甲醛固定小鼠肝组织，经脱水、透明、浸蜡后，用包埋机进行石蜡包埋，蜡块凝固后置4℃冰箱贮存。随后将蜡块制作成石蜡切片用于HE染色和天狼星红染色。

HE染色：经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各10分钟；将切片依次放入100%、95%、85%、75%等各级酒精溶液中各10分钟，自来水冲洗5分钟，1×PBS 5分钟；0.3%H₂O₂>

天狼星红染色（Sirius Red Staining）：脱蜡、水化方法同HE染色，苏木精浸染2分钟，自来水冲洗10分钟，1%盐酸乙醇分化5秒，自来水冲洗10分钟，苦味酸天狼星红染色10分钟，自来水冲洗10分钟；脱水、封片。

实验结果：HE染色结果显示，假手术组正常肝组织肝脏结构清晰，肝小叶结构正常，肝细胞条索清晰，肝细胞完整；BDL组肝组织损伤严重，纤维组织增生明显；给药组肝组织损伤和纤维组织增生程度都显著减轻。天狼星红染色结果显示，BDL组红色胶原纤维逐渐增粗变长，部分甚至可见假小叶的形成，表明小鼠肝纤维化模型的成功建立；药物组胶原纤维明显少于对照组，纤维间隔染色也相对较浅，说明FDI-6可以明显缓解肝纤维化。

实施例8： FDI-6对胆总管结扎诱导的肝纤维化小鼠谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的影响。

实验材料：FDI-6、手术器械、高速离心机和生化检测仪等。

实验方法：胆总管结扎术，眼眶取血、离心（4000rpm, 5min），取上清，送医院检验科应用生化检测仪检测血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）含量。

实验结果：与对照组相比，胆总管结扎诱导的肝纤维化小鼠ALT和AST均明显升高，而FDI-6可缓解.

实施例9： 免疫组化检测Sham、LMBDL加Saline和加FDI-6组小鼠FOXM1的蛋白表达。

实验材料：C57L/6小鼠、显微镜、FDI-6、FOXM1一抗和免疫组化试剂盒和PBS溶液等。

实验方法：取实施例7所述蜡块制作成的切片，按流程操作免疫组化各步骤，100%、90%乙醇浸泡3min后PBS冲洗，微波3min，冷却后PBS洗涤、室温封闭30min、一抗4℃孵育过夜，相应的二抗室温孵育1h，依次加3%H₂O₂、DBA染色、封片，镜下仔细观察、拍照。

实验结果：FDI-6可下调LMBDL诱导的肝纤维化小鼠中FOXM1的表达。