包载葡聚糖‑g‑聚(L‑赖氨酸)‑VAPG/核酸复合物的聚丙交酯纤维膜及制备方法

摘要

本发明涉及一种包载葡聚糖‑g‑聚(L‑赖氨酸)‑VAPG/核酸复合物的聚丙交酯纤维膜及制备方法。纤维膜由直径600～1200nm的纤维和直径50～100nm的葡聚糖‑g‑聚(L‑赖氨酸)‑VAPG/核酸复合物纳米粒子组成，纤维膜厚度为60～150μm。通过将葡聚糖‑g‑聚(L‑赖氨酸)‑VAPG聚合物包载核酸的复合物溶液作为水相，将PELCL或PLGA溶液作为油相，采用乳液电纺方式制备包载核酸复合物的电纺纤维膜，实现了对核酸的完善包覆，保护了其生物活性，减缓了其突释，突释率均在20％以下，使得核酸持续可控释放至血管平滑肌细胞中，具有良好的生物相容性和生物可降解性，用于组织工程和基因治疗领域。

说明书

技术领域

本发明涉及一种包载葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG/核酸复合物的聚丙交酯共聚物纤维膜及制备方法，属于组织工程和基因治疗领域。

背景技术

电纺纤维膜具有较高的比表面积和孔隙率，通过调节电纺参数可以使得制备的电纺纤维膜更好地模拟细胞外基质环境(ECM)，有利于细胞的粘附、增长和营养传递，在组织工程支架领域有广阔的应用前景(Rayatpisheh S,Heath DE,Shakouri A,RujitanarojPO,Chew SY,Chan-Park MB.Combining cell sheet technology and electrospunscaffolding for engineered tubular,aligned,and contractile bloodvessels.Biomaterials,2014,35:2713-9)。聚乙二醇-聚(丙交酯-co-己内酯)和聚(乙交酯-co-丙交酯)是具有良好的生物相容性和生物可降解性的电纺材料，乙二醇的修饰改善了聚丙交酯聚合物的亲水性，而乙交酯和丙交酯的比例调节可以优化降解时间，力学性能优异，通过静电纺丝制备成纤维膜，可以作为组织工程的支架材料(Zhao W,Li J,Jin K,Liu W,Qiu X,Li C.Fabrication of functional PLGA-based electrospun scaffoldsand their applications in biomedical engineering.Mater.Sci.Eng.,C,2016,59:1181-94)。

小分子核糖核酸(miRNA)作为基因表达的重要调控者，在心血管疾病领域也发挥着积极的作用。据报道，miR-145可以通过抑制KLF4/5靶基因的表达，提高其下游基因促血管平滑肌细胞分化因子myocardin的表达，以及收缩型平滑肌细胞标志基因SM-α-actin、SM-22α和SM-MHC的表达上调，调节血管平滑肌细胞的表现型、增殖和迁移，防止血管重建过程中的内膜增生和再狭窄。因此，在组织工程支架材料中引入miR-145有利于长期调控小口径血管的通畅性(Cordes KR,Sheehy NT,White MP,Berry EC,Morton SU,Muth AN,LeeAN,Miano JM,Srivastava D.miR-145and miR-143regulate smooth muscle cell fateand plasticity.Nature,2009,460:705-10)。miRNA等核酸易受到核酸酶的降解，裸露的miRNA在体内循环周期短，而且非特异性摄入易造成生物毒性，鉴于此，本课题组研制了一种具有靶向平滑肌细胞的低毒和高转染的核酸载体葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG，结构式如下：

式中，k＝18～24,r＝13～19,n＝1～8,l＝7～22，该载体的优势在于将多糖与多肽结合，生物相容性好，毒性低，而且由于平滑肌细胞粘附肽VAPG的存在，可以引导核酸药物靶向进入平滑肌细胞，提高了转染效率，降低了与非特异性细胞接触的副作用，尤其是血管内皮细胞。然而，将载体包载的miRNA复合物注射进入体内，不能有效地控制miRNA的给药量，易造成一次给药过多产生的生物副作用或者多次手术给药的创伤。而且，miRNA不能准确到达病灶位点也会对其他的组织产生毒性作用。已有文献报道，将ssPEI包载的miR-145涂覆在透明质酸包裹的洗脱支架上用于调控血管平滑肌细胞的增殖和表现型(Che HL,BaeIH,Lim KS,Uthaman S.,Song IT,Lee H,Lee D,Kim WJ,Ahn Y,Park IK,Jeong MH.Novelfabrication of microrna nanoparticle-coated coronary stent for prevention ofpost-angioplasty restenosis.Korean Circulation Journal,2016,46(1):23-32)。然而，将miR-145复合物负载进入电纺纤维膜中延长其循环周期和持续缓慢释放，进而长期调节血管平滑肌细胞的增殖和表现型，防止血管重建过程中的内膜增生和再狭窄，目前文献中未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种包载葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG/核酸复合物的聚丙交酯共聚物纤维膜及制备方法。基于乳液静电纺丝技术，利用葡聚糖-g-聚赖氨酸-VAPG为基因载体，保护核酸的活性，通过纤维膜实现核酸逐级释放到血管平滑肌细胞中，使其在较长的时间内保持有效的作用浓度，调节平滑肌细胞的生物活动。无需频繁给药，同时避免了药物“突释”现象的产生。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案加以实现：

一种包载葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG/核酸复合物的聚丙交酯共聚物纤维膜，纤维膜是由直径为600～1200nm的电纺纤维和直径为50～100nm的葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG/核酸复合物纳米粒子组成的，纤维膜的厚度为60～150μm。每毫克电纺纤维膜中含有50～200纳克的核酸。

所述葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG，结构式如下：

k＝18～24,r＝13～19,n＝1～8,l＝7～22。

所述的核酸为miRNA，所述的聚丙交酯共聚物包括聚乙二醇-b-聚(丙交酯-co-己内酯)(PELCL)或聚(丙交酯-co-乙交酯)(PLGA)，其中丙交酯和己内酯的摩尔比为3:1。

本发明的包载葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG/核酸复合物的聚丙交酯共聚物纤维膜的制备方法，包括以下步骤：

(1)将PELCL或PLGA溶于氯仿/N,N’-二甲基甲酰胺混合溶剂中，加入10～12mg/mL的F127作为乳化剂，配制成浓度为100～300mg/mL的溶液作为油相；

(2)室温下，将葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG聚合物和核酸分别溶解在焦炭酸二乙酯(DEPC)水中，并按照葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG聚合物与miRNA质量比为(2～4)：1室温下复合15～45min，加入52～292μL的TE缓冲液形成均一的水相溶液；

(3)按照水相/油相的体积比1:10～1:25，将水相溶液加入到油相中，涡旋振荡0.5～2小时制得分散液，采用单注射泵装置，进行电纺，得到厚度为60～150μm的包载葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG/核酸复合物的聚丙交酯共聚物纤维膜。

所述PELCL的重均分子量为(5～10)×10⁴，PLGA的重均分子量为(5～10)×10⁴，葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG的重均分子量为(1.5～3.6)×10⁴。

采用单注射泵装置，以电压为10～16kV，接收距离为12～16cm，分散液流量为0.3～0.6mL/h进行电纺。

所述氯仿/N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂体积比8:1～4:1。

本发明的优点在于，通过将葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG聚合物包载核酸的复合物溶液作为水相，将PELCL或PLGA溶液作为油相，采用乳液电纺的方式制备包载核酸复合物的电纺纤维膜，实现了对核酸的完善包覆，保护了其生物活性，减缓了其突释，突释率均在20％以下，并且使得核酸持续可控释放至血管平滑肌细胞中，调节其表现型和增殖活动。本发明制备过程简单易行，制得的纤维膜具有良好的生物相容性和生物可降解性，可用于组织工程和基因治疗领域。

附图说明

图1为实施例1所制得的负载葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG/核酸复合物的PLGA纤维膜扫描电子显微镜照片；

图2为实施例1所制得的负载葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG/核酸复合物的PLGA纤维膜激光共聚焦照片。

图3为实施例1所制得的负载葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG/核酸复合物的PLGA纤维膜释放曲线。

具体实施方式

下面通过实施案例对本发明的技术方案作进一步阐释，以下实施案例是对本发明的进一步说明，并不限制本发明的适用范围。

实施例1

(1)称取重均分子量为1×10⁵的PLGA(丙交酯：乙交酯＝3:1)400mg溶于4mL体积比为4:1的氯仿和N,N’-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，同时加入48mg的F127作为乳化剂，室温搅拌过夜获得均匀的油相溶液(O)。

(2)称取重均分子量为3.6×10⁴葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG聚合物的10mg，溶于2mL的DEPC水中；在1OD的miRNA中加入25μL的DEPC水配制浓度为1.32mg/mL的miRNA溶液；按照聚合物/miRNA为2:1的质量比，取60μL的miRNA溶液与32μL的聚合物溶液室温复合15～45min并补加68μL的TE缓冲液形成均一的水相溶液(W)。

(3)按照水油比1:25，将4mL的油相溶液与上述160μL的水相溶液搅拌混合0.5～2h形成W/O分散液。将分散液推进入5mL的注射器中，采用单注射泵电纺装置，以电压为16kV，分散液流量为0.6mL/h，接收距离为12cm进行电纺，经过10h后收集到纤维直径为900nm～1200nm，厚度为100～150μm的纤维膜。图1为所制得的负载miRNA复合物的PLGA纤维膜扫描电子显微镜照片，图2为所制得的负载miRNA复合物的PLGA纤维膜激光共聚焦照片。图3为所制得的负载miRNA复合物的PLGA纤维膜释放曲线。从图中可以看出，此样品中miRNA的理论包载量为200ng/mg(miRNA/PLGA)，实际包载量达到165ng/mg(miRNA/PLGA)，包封率达到80％以上，突释率在20％以下，两个月内的总释放量达到90％，可达到持续释放给药的效果。

实施例2

(1)称取重均分子量为7.5×10⁴的PLGA(丙交酯：乙交酯＝3:1)800mg溶于4mL体积比为6:1的氯仿和N,N’二甲基甲酰胺的混合溶剂中，同时加入44mg的F127作为乳化剂，室温搅拌过夜获得均匀的油相溶液(O)。

(2)称取重均分子量为2.1×10⁴葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG聚合物的10mg，溶于2mL的DEPC水中；在1OD的miRNA中加入25μL的DEPC水配制浓度为1.32mg/mL的miRNA溶液，并按照聚合物/miRNA为3:1的质量比，取60μL的miRNA溶液与48μL的聚合物溶液室温复合15～45min并补加52μL的TE缓冲液形成均匀的水相溶液(W)。

(3)按照水油比1:25，将4mL的油相溶液与上述160μL的水相溶液搅拌混合0.5～2h形成W/O分散液。将上述分散液推进入5mL的注射器中，采用单注射泵电纺装置，以电压为13kV，分散液流量为0.4mL/h，接收距离为14cm进行电纺，经过10h后收集到纤维直径为700nm～1000nm，厚度为100～150μm的纤维膜。此样品中miRNA的理论包载量为100ng/mg(miRNA/PLGA)，实际包载量达到76ng/mg(miRNA/PLGA)，包封率达到70％以上，突释率在20％以下。

实施例3

(1)称取重均分子量为5×10⁴的PLGA(丙交酯：乙交酯＝3:1)1200mg溶于4mL体积比为8:1的氯仿和N,N’二甲基甲酰胺的混合溶剂中，同时加入40mg的F127作为乳化剂，室温搅拌过夜获得均匀的油相溶液(O)。

(2)称取重均分子量为1.5×10⁴葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG聚合物的10mg，溶于2mL的DEPC水中；在1OD的miRNA中加入25μL的DEPC水配制浓度为1.32mg/mL的miRNA溶液，并按照聚合物/miRNA为4:1的质量比，取45μL的miRNA溶液与48μL的聚合物溶液室温复合15～45min并补加107μL的TE缓冲液形成均匀的水相溶液(W)。

(3)按照水油比1:20，将4mL的油相溶液与上述200μL的水相溶液搅拌混合0.5～2h形成W/O分散液。将上述分散液推进入5mL的注射器中，采用单注射泵电纺装置，以电压为10kV，分散液流量为0.3mL/h，接收距离为16cm进行电纺，经过10h后收集到纤维直径为800nm～1000nm，厚度为100～150μm的纤维膜。此样品中miRNA的理论包载量为50ng/mg(miRNA/PLGA)，实际包载量达到35ng/mg(miRNA/PLGA)，包封率达到70％，突释率在20％以下。

实施例4

(1)称取重均分子量为1×10⁵的PELCL>

(2)称取重均分子量为3.6×10⁴葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG聚合物的10mg，溶于2mL的DEPC水中；在1OD的miRNA中加入25μL的DEPC水配制浓度为1.32mg/mL的miRNA溶液，并按照聚合物/miRNA为2:1的质量比，取60μL的miRNA溶液与32μL的聚合物溶液室温复合15～45min并补加158μL的TE缓冲液形成均匀的水相溶液(W)。

(3)按照水油比1:16，将4mL的油相溶液与上述250μL的水相溶液搅拌混合0.5～2h形成W/O分散液。将上述分散液推进入5mL的注射器中，采用单注射泵电纺装置，以电压为13kV，分散液流量为0.4mL/h，接收距离为14cm进行电纺，经过10h后收集到纤维直径为900nm～1100nm，厚度为100～150μm的纤维膜。此样品中miRNA的理论包载量为200ng/mg(miRNA/PELCL)，实际包载量达到150ng/mg(miRNA/PELCL)，包封率达到75％，突释率在20％以下。

实施例5

(1)称取重均分子量为6.5×10⁴的PELCL>

(2)称取重均分子量为2.1×10⁴葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG聚合物的10mg，溶于2mL的DEPC水中；在1OD的miRNA中加入25μL的DEPC水配制浓度为1.32mg/mL的miRNA溶液，并按照聚合物/miRNA为3:1的质量比，取45μL的miRNA溶液与48μL的聚合物溶液室温复合15～45min，并补加292μL的TE缓冲液形成均匀的水相溶液(W)。

(3)按照水油比1:10，将4mL的油相溶液与上述400μL的水相溶液搅拌混合0.5～2h形成W/O分散液。将上述分散液推进入5mL的注射器中，采用单注射泵电纺装置，以电压为16kV，分散液流量为0.6mL/h，接收距离为12cm进行电纺，经过10h后收集到纤维直径为800nm～1000nm，厚度为100～150μm的纤维膜。此样品中miRNA的理论包载量为100ng/mg(miRNA/PELCL)，实际包载量达到70ng/mg(miRNA/PELCL)，包封率达到70％，突释率在20％以下。

实施例6

(1)称取重均分子量为5×10⁴的PELCL>

(2)称取重均分子量为1.5×10⁴葡聚糖-g-聚(_L-赖氨酸)-VAPG聚合物的10mg，溶于2mL的DEPC水中；在1OD的miRNA中加入25μL的DEPC水配制浓度为1.32mg/mL的miRNA溶液，并按照聚合物/miRNA为4:1的质量比，取45μL的miRNA溶液与48μL的聚合物溶液室温复合15～45min并补加107μL的TE缓冲液形成均匀的水相溶液(W)。

(3)按照水油比1:20，将4mL的油相溶液与上述200μL的水相溶液搅拌混合0.5～2h形成W/O分散液。将上述分散液推进入5mL的注射器中，采用单注射泵电纺装置，以电压为10kV，分散液流量为0.3mL/h，接收距离为16cm进行电纺，经过10h后收集到纤维直径为600nm～800nm，厚度为100～150μm的纤维膜。此样品中miRNA的理论包载量为50ng/mg(miRNA/PELCL)，实际包载量达到30ng/mg(miRNA/PELCL)，包封率达到60％，突释率在20％以下。