毛白杨基因PtomiR390a及其应用

摘要

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及毛白杨基因PtomiR390a及其应用。本发明公开了一种毛白杨基因PtomiR390a，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，还提供了所述毛白杨基因PtomiR390a的表达载体、表达载体的宿主，以及在在提高白杨生物量和提高白杨耐盐能力方面的应用。本发明提供的毛白杨基因PtomiR390a在转录后水平调控毛白杨生物量，通过毛白杨基因PtomiR390a超量表达提高了毛白杨的生物量，并提高了毛白杨抵御自然环境中受盐碱胁迫的能力。本发明提供的培育方法，培育了高生物量和高耐盐能力的优质杨树品种。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及毛白杨基因PtomiR390a及其应用。

背景技术

我国约有15亿亩的各种盐渍土地，占世界盐渍土面积的26.3％，且次生盐碱化面积仍在不断增加(杨劲松，2008)。土壤盐渍化成为我国农林业生产可持续发展的重要限制因素。因此，迫切需要开展耐盐林木新品种选育工作。虽然利用传统育种技术在一定程度上提高了林木的耐盐性，但选育周期长、很难在短时间内聚合多个优良耐盐碱基因(罗子敬等，2017)。而利用基因工程技术提高林木耐盐能力具有广阔前景。

杨树(Populus spp.)是世界范围内种植最为广泛的一种速生树木。目前，我国的杨树人工林面积约700万亩，居世界第一位(王颖等，2007)。在理想条件下，杨树大约4年即可成材，具有适应性强、繁殖速度快、容易杂交、容易改良遗传性、容易无性繁殖等特点，是重要的建筑用材和造纸原料，同时还可作为可再生能源的原料。自从1986年Parsons等证实了杨树可以进行遗传转化以来，杨树基因工程得到了迅速发展。毛果杨(Populustrichocarpa) 的基因组测序已经于2006年完成(Tuskan et al.,2006)，这是首个被测出基因组序列的林木物种，因此杨树被看作是木本植物遗传和分子育种研究的模式物种。毛白杨(Populus tomentosa) 是我国特有的杨树树种，以黄河流域中下游为中心分布区(张勇等，2006)。

随着对耐盐机制研究的逐步深入和相关耐盐基因的克隆，如何利用这些基因对林木进行改良，从而提高其盐渍土环境的适应能力成为热点。目前，杨树耐盐转基因研究主要集中在离子通道和钠离子转运体、渗透调节物质基因、保护酶基因、转录因子基因和胚胎发育晚期丰富蛋白基因等方面(罗子敬等，2017)。刘凤华等(2000)将抗盐碱基因mtl-D转入八里庄杨，并筛选获得一批较高耐盐性的转化植株；孙仲序等(2002)、尹建道等(2004)对转mtl-D 基因的八里庄杨进行了大田释放造林试验，结果表明在中度盐碱地上造林成活率明显提高。 Du等(2012)对白杨杂种进行了转AhDREB1基因研究，并获得了转基因株系；刘欣(2007) 对转AhDREB1基因毛白杨的耐盐性、魏冰等(2009)和Lu等(2014)对田间种植的转AhDREB1 基因毛白杨的安全性进行了评价。然而，这些耐盐转基因研究均为将在其它物种中鉴定的耐盐基因转入杨树中，而且无法达到同时提高林木产量和耐盐能力的双重效果。

miRNA是一种非编码RNA，长度约为21个核苷酸，主要来自于基因间隔区，由单链的前体在细胞中形成独特的发夹结构。它们最初是在秀丽隐杆线虫中发现的，后来发现广泛存在于动植物细胞中。miRNA在植物生长发育和对外界胁迫刺激响应相关的过程中扮演着重要的调控角色，如发育调控和环境应激反应等(Chen，2012)。

发明内容

本发明提供了一种毛白杨基因PtomiR390a，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了所述毛白杨基因PtomiR390a的表达载体。

具体的，所述表达载体为超量表达基因的植物表达载体。

具体的，所述植物表达载体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了所述表达载体的宿主。

具体的，所述宿主为农杆菌。

本发明还提供了所述毛白杨基因PtomiR390a在提高白杨生物量或提高白杨耐盐能力方面的应用。

本发明还提供了所述表达载体在提高白杨生物量和提高白杨耐盐能力方面的应用。

本发明还提供了所述宿主在提高白杨生物量和提高白杨耐盐能力方面的应用。

本发明还提供了一种应用所述毛白杨基因PtomiR390a提高毛白杨生物量和耐盐能力的培育方法，包括如下步骤：

(1)构建植物表达载体：扩增毛白杨基因PtomiR390a，将其与pCXSN载体相连接，然后转化农杆菌菌株GV3101；

(2)毛白杨的遗传转化：转化材料为野生型毛白杨叶片，采用农杆菌介导的叶盘法；

(3)转基因植株分子检测：以转基因植株的基因组DNA为模板，通过扩增潮霉素抗性标记基因Hyg进行阳性植株筛选，筛选出高生物量和耐盐能力的白杨。

具体的，扩增毛白杨基因PtomiR390a的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物的核苷酸序列如核苷酸序列如SEQ ID No.4。

本发明的有益效果：本发明提供的毛白杨基因PtomiR390a在转录水平调控毛白杨生物量，通过毛白杨基因PtomiR390a超量表达提高了毛白杨的生物量，并提高了毛白杨抵御自然环境中受盐碱胁迫的能力。本发明提供的一种应用所述毛白杨基因PtomiR390a提高毛白杨生物量和耐盐能力的培育方法，培育了高生物量和高耐盐能力的优质杨树品种。

附图说明

图1：转基因植株PCR分子检测

以野生型株系和转基因株系35S:PtomiR390a的DNA为模板，用测序引物Hyg-F和Hyg-R进行PCR检测；其中M代表Marker DL5000；-为非转基因野生型植株。

图2：转基因植株表达量分析

WT为野生型毛白杨，PtomiR390a-OXL1，PtomiR390a-OXL2，PtomiR390a-OXL4，PtomiR390a-OXL7分别代表PtomiR390a转基因植株的不同株系。

图3：超表达植株生物量分析

A是野生型毛白杨(WT)和超表达植株(miR390-OE)地上部分表型；B是野生型毛白杨和超表达植株地下部分表型；C是野生型毛白杨和超表达植株株高；D是野生型毛白杨和超表达植株茎干直径；E是野生型植株和超表达植株地上部分干重和鲜重测定；F是野生型植株和超表达植株地下部分干重和鲜重测定。

图4：转基因植株抗盐实验

A是200mM盐胁迫处理野生型毛白杨和超表达植株六周后地上部分表型；B是200mM盐胁迫处理野生型毛白杨和超表达植株六周后地下部分表型；C是200mM盐胁迫处理野生型和超表达株系毛白杨六周后地上部分生物量统计；D是200mM盐胁迫处理野生型和超表达株系毛白杨六周后地下部分生物量统计。

具体实施方式

实施例1 杨树总RNA提取和反转录合成cDNA

1、杨树总RNA提取

以杨树幼叶为材料，将RNA提取中所用的药勺、杵、研钵等均用95％酒精灼烧至冷却后使用。取石英砂一勺于加热器中加热10min冷却后使用。1.5mL离心管、塑料制品等均使用经RNase处理(RNase Free)的AXYGEN产品。

总RNA提取按照华舜Server-SPIN DNA-free Plant RNA Isolation Kit操作步骤进行：

1)在1.5mL离心管中加入裂解液(500μL RL+100μL 10％PVP+10μL 2-ME)；

2)在液氮冷冻条件下将杨树幼叶(100mg)和石英砂混合快速研成粉末，在液氮完全挥发之前，将粉末全部转移到事先配制好的裂解液中，移液枪快速吹打混匀样品；

3)室温放置5min后，全部移入过滤柱中，13400rpm离心5min，将上清全部移入另一个离心管中；

4)加入上清液一半体积的W3，混匀后，全部移入吸附柱，12000rpm离心30s，倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中，若总体积超过750μL，则分多次上柱；

5)加入400μL RP，室温静置1min后，离心1min，倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中；

6)加入400μL W3液，室温静置1min后，离心1min，倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中；

7)向吸附膜中央加入40μL DNaseΙ工作液。室温静置15min后，加入200μL RP液。离心1min。倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中；

8)加入600μL W3液，离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管中；

9)加入250μL W3液，静置1min，离心2min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管中；

10)将吸附柱移入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜正中央加入50μL纯水，静置 1min，离心2min。将RNA轻微混匀后，保存于-70℃备用。

2、杨树总RNA反转录合成cDNA

用TaKaRa One-step RT PCR Kit试剂盒进行反转录，反转录的反应体系：

表1 反转录的反应体系

RNase Free dH₂O5μL5×PrimescriptTM Buffer2μLOligo DT Primer0.5μLTotal RNA2μLPrimescript RT Enzyme2μLTotal10μL

反转录的反应程序：37℃，15min；85℃，5s。终止反应后，将反应产物于-20℃储存备用。

实施例2 PCR引物的设计和PCR扩增获得目的片段

1、PCR引物设计

登陆miRBase(http://www.miRBase.com)，查询到杨树PtomiR390a基因的前体序列。设计了PtomiR390a前体序列的特异性引物，PtomiR390a片段的上游引物PtomiR39a0-F序列为：5'-AGAATCTGTTAAGCTCAGGAG-3'(SEQ ID No.3)，下游引物PtomiR390a-R序列： 5'-AACCCATAGAACTCAGGATAG-3'(SEQ ID No.4)；目的片段119bp。

引物由华大基因(北京)代为合成。PCR所用反应试剂均为TaKaRa公司产品：dNTPMixture(各2.5mM)，Taq DNA聚合酶(5U/μL)，附10×PCR Buffer(0.1M Tris-HCl[pH8.3])， 0.5M KCl)和MgCl₂(25mM)。

2、PCR扩增目的片段

以杨树gDNA为模板扩增PtomiR390a基因片段，扩增PtomiR390a基因片段的体系：

表2 PCR反应的体系

加完样后，短暂离心混匀，并保证液体聚于管底。外源基因和内源基因各加样10管。快速置于PCR仪中，设置以下循环参数：94℃3min，1个循环；94℃30s，55℃30s，72℃1min，33个循环。

扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，若目的条带清晰，大小正确，可按照AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒如下操作步骤，对目的条带进行回收。在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量(提前记录1.5mL离心管重量)，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μL体积)。按如下操作进行回收：

1)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后与75℃加热，间断混合(每2-3min)，直至凝胶块完全熔化。

2)加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA片段小于400 bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇(加Buffer DE-B后混合物颜色变为黄色)。

3)吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管中，12000rpm离心1min，弃滤液。

4)将制备管置回2mL离心管，加500μLBuffer W1，12000rpm离心30s，弃滤液。

5)将制备管置回2mL离心管，加700μLBuffer W2，12000rpm离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μLBuffer W2洗涤一次12000rpm离心1min。

6)将制备管置回2mL离心管，12000rpm离心1min。

7)将制备管置与1.5mL离心管中，在制备膜中央加入25-30μLEluent，室温静置1min。 12000rpm离心1min洗脱DNA。

实施例3 PtomiR390a-pcxSN载体构建和转化农杆菌GV3101

将扩增片段胶回收之后，载体pcxSN用XcmI酶切后与回收片段连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过PCR扩增目的基因片段和酶切验证，得到转化子，并保存菌种。

分别提取从阳性转化子大肠杆菌中提取PtomiR390a-pcxSN质粒，步骤按照Plasmid Mini Kit试剂盒提取步骤，具体操作如下：

1)取培养至对数期的菌液于EP管中，13400rpm离心1min收集菌体，弃上清。

2)加入预冷的已加入RNase A的SolutionI 250μL涡旋重悬菌体混匀。

3)加入250μL SolutionII动作轻柔上下颠倒5-6次，混匀后静置2min。

4)加入350μL SolutionIII，上下颠倒5-6次至沉淀出现，13400rpm离心10min。

5)取上清加入吸附柱(约700μL上清)，吸附柱放置于2mL的收集管中，10000rpm 室温离心1min，弃液。

6)加入500μL HB Buffer，10000rpm室温离心1min，弃液。

7)加入700μL DNA Wash Buffer，10000rpm室温离心1min，弃液。

8)重复第7步，加入700μL DNA Wash Buffer，10000rpm室温离心1min，弃液。

9)将吸附柱放于收集管中，空管13400rpm离心2min。

10)将吸附柱放于另外一支新的离心管中，加入30-50μL Elution Buffer，静置2min， 13400rpm离心1min。于-20℃保存备用。

转化农杆菌的操作如下：

1)取5μL PtomiR390-pcxSN质粒分别于200μL的农杆菌GV3101感受态细胞中，混匀。

2)立即在冰上放置30min，迅速放入液氮2min，37℃水浴5min。

3)加入800μL空的YEP液体培养基，混匀后置28℃、200rpm培养4-6h。

4)5000rpm离心8min，弃900μL上清液，将剩余100μL菌液混合，用消毒冷却的涂布棒将100μL菌液均匀涂于YEP+40mg/L Rif+50mg/L Kan+50mg/L Gen固体培养基上，28℃条件下倒置培养2d。

5)将工程菌命名为GV3101-PtomiR390-pcxSN(SEQ ID No.2)，加15％甘油保存于-80℃，用于后续遗传转化实验。

实施例4 毛白杨遗传转化

转化材料为野生型的毛白杨叶片，采用根癌农杆菌介导的遗传转化方法。

1)农杆菌的活化

将含有重组质粒的农杆菌GV3101接种到YEP固体培养基(含50mg/L Kan+40mg/LRif)上，28℃培养1～2d；挑取单菌落接种于含有50mg/L Kan、40mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.8～1.0；取200μL一活菌液转到新鲜的YEP培养基中， 28℃振荡培养6～8h，当OD600达到0.6～0.8时离心收集菌体，用添加了AS的WPM液体培养基30ml重悬后放入28℃摇床中振荡培养1～2h即可用于转化。

2)农杆菌的转化

选取无菌苗顶上的幼嫩叶片，在超净工作台上将其切成0.5×0.5cm²的小块，放入重悬好的菌液中浸染10～15min，期间不断摇晃菌液。

3)毛白杨的共培养

将浸染过的材料用镊子小心夹出放在含有无菌滤纸的平板上吸干菌液，将叶片背面向下平铺在WPM1固体培养基上，于25℃培养箱中暗培养2d。

4)毛白杨的选择培养

2d之后将转化过的外植体移到WPM2选择培养基上，在25℃、光照为2000～10000Lux 条件下的光照培养箱中选择培养3～4周，其间每10d更换一次培养基。

5)毛白杨的生芽培养

当叶片周围出现白色疏松愈伤时，将其移入生芽培养基WPM3上，在25℃，光照为2000～10000Lux条件下的光照培养箱中诱导生芽，时间约4～5周，每10d更换一次培养基。

6)毛白杨的生根培养

当不定芽长至约2cm时，切下并转入生根培养基WPM4中，10d左右即生根。

7)转基因毛白杨的移栽

当生根的幼苗长至约8cm且根系比较发达时，取出幼苗，洗净根部的琼脂，移栽到温室中培养。

实施例5 转基因植株PCR分子检测

分别选取10～15株转基因的抗性再生植株，提取毛白杨基因组DNA。方法如下：

1)准备若干已灭菌的10ml离心管。取其一支，加入3ml CTAB和90ulβ–巯基乙醇，65℃水浴锅预热。

2)取约0.3g的毛状根，吸干其表面水分，于液氮中磨成粉末，转入上述预热的CTAB抽提液中，涡旋混匀。

3)于65℃水浴45min，中途间隔(轻柔)振荡三次混匀。

4)冰上冷至室温后加入等体积氯仿︰异戊醇(24︰1)，轻柔颠倒混匀后平放乳化10min。18℃，10000转/分，离心10min。

5)取上清(约2ml)于另一干净的10mL离心管中，加入等体积氯仿︰异戊醇(24︰1)，轻柔颠倒混匀后平放乳化10min。18℃，10000转/分，离心10min。

6)吸取上清于另一10mL离心管中，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀能见白色絮状沉淀，量少可短暂离心。

7)枪头吸出絮状沉淀，用500ml 75％(V/V)乙醇漂洗两次，500ml无水乙醇再漂洗一次，吸干乙醇。沉淀于37℃恒温箱中干燥至出现半透明。

8)用25μL无菌水溶解沉淀，得毛状根DNA粗提物。

9)向DNA粗提物中加入约1ul RNase，于37℃酶解RNA 1h。

10)DNA样品，-20℃保存备用。

11)模板DNA为毛状根的基因组DNA，通过扩增潮霉素标记基因Hyg(562bp)进行筛选。设计Hyg基因的特异性引物，序列如下：

Hyg-F：5′-ATCGGACGATTGCGTCGCATC-3′(SEQ ID No.5)；

Hyg-R：5′-GTGTCACGTTGCAAGACCTG-3′(SEQ ID No.6)。

PCR反应体系同表2，反应程序：94℃预变性3min，1个循环；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，共31个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

实施例6 转基因植株表达量分析

将野生型毛白杨和获得的15株转基因阳性植株分别提取RNA后反转录成cDNA，方法同实施例1，设计内参基因PtoU6引物：

PtomiR390a stem loop RT：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGCGCT-3'(SEQ ID No.7)；

PtoU6stem loop RT：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTTTTGGACCATTTCT CGAT-3’(SEQ IDNo.7)。

将野生型和1-15号转基因株系的cDNA进行PCR扩增,反应体系同表2

反应程序：94℃预变性3min，1个循环；94℃变性30s，退火30s，Tm＝55℃，72℃延伸1min，依次进行25、26、27、28、29、30循环数扩增；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。选择循环次数在线性范围内，可以看见不同株系cDNA浓度差异的循环数，并将不同浓度差异的cDNA稀释至同一浓度，进而将同一浓度的野生型和超表达株系的cDNA通过PCR扩增目的基因，分析PtomiR390a在不同转基因植株中表达量高低，PCR 反应体系同表2。参见图2可知，筛选得到PtomiR390a–OXL1号株系表达量较高，统计超表达植株生物量。

实施例7 转基因植株抗盐实验

以野生型和超表达植株为对象，在温室中培养一个月后进行浓度为0(对照)，200mmol/L 的盐胁迫处理，按间隔3d分别加浓度为0(对照)、200mmol/L的盐处理。按间隔7d测量植株株高和直径,处理六周后测量植株地上地下部分鲜重。

参见图3A可知，相较于野生型毛白杨植株，超表达植株的叶片更大，植株更高；参见图3B可知，超量表达植株株的根系更加发达。进一步的，图3C中，超量表达植株的株高约为野生型毛白杨植株的1.25倍；图3D中，超量表达植株的株茎也更加粗壮；图3E和图 3F表明超表达植株地上和地上下部分的鲜重、干重均大于野生型毛白杨植株。由此可见，与野生型毛白杨植株相比较，无论是超量表达植株地上部分还是地下部分的生物量都更高。

参见图4A可知，经过200mM盐胁迫处理野生型毛白杨和超表达植株的地上部分表型差别较大，野生型毛白杨植株大部分叶片已经萎蔫、枯黄，而超表达植株的仅部分叶片的叶尖出现枯黄，图3C中，超表达植株地上部分的鲜重约为野生型毛白杨植株的3倍，干重约为2倍，更进一步表明，超表达植株具有更高的生物量和耐盐能力；参见图3B和图3D中,显著可见，超表达植株的根系更为发达、生物量更高。由此可见，在200mM盐浓度处理6周的情况下，超量表达植株叶片未出现明显的萎蔫，地上部分和根系生物量显著高于野生型，植株耐盐能力显著增强。

本发明提供的毛白杨基因PtomiR390a在转录后水平调控毛白杨生物量，通过毛白杨基因 PtomiR390a超量表达不仅提高了毛白杨的生物量，还加强了毛白杨抵御自然环境中受盐碱胁迫的能力。采用本发明提供的培育方法，培育了高生物量和高耐盐能力的优质杨树品种。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南大学

<120> 毛白杨基因PtomiR390a及其应用

<130> 8

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 119

<212> DNA

<213> 杨树（Populus spp.）

<400> 1

agaatctgtt aagctcagga gggatagcgc catgagcatg acaaagtcta tgtttgagtt 60

aatctcaaca aaatcaatcc agtcatcagt ggcgctatct atcctgagtt ctatgggtt 119

<210> 2

<211> 10232

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PtomiR390a-pcxSN

<400> 2

gaattccgat ctagtaacat agatgacacc gcgcgcgata atttatccta gtttgcgcgc 60

tatattttgt tttctatcgc gtattaaatg tataattgcg ggactctaat cataaaaacc 120

catctcataa ataacgtcat gcattacatg ttaattatta catgcttaac gtaattcaac 180

agaaattata tgataatcat cgcaagaccg gcaacaggat tcaatcttaa gaaactttat 240

tgccaaatgt ttgaacgatc ggggaaattc gctagtggat ccccaatact aacccataga 300

actcaggata gatagcgcca ctgatgactg gattgatttt gttgagatta actcaaacat 360

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tccccctcga gtatcgttcg taaatggtga aaattttcag aaaattgctt ttgctttaaa 480

agaaatgatt taaattgctg caatagaagt agaatgcttg attgcttgag attcgtttgt 540

tttgtatatg ttgtgttgag gtcgaggtcc tctccaaatg aaatgaactt ccttatatag 600

aggaagggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc ccttacgtca gtggagatat 660

cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc ttctttttcc acgatgctcc 720

tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga ggcatcttca acgatggcct 780

ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg agccaccttc cttttccact atcttcacaa 840

taaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tccggatatt accctttgtt 900

gaaaagtctc aattgccctt tggtcttctg agactgtatc tttgatattt ttggagtaga 960

caagtgtgtc gtgctccacc atgttatcac atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg 1020

gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt 1080

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ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 1440

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gcttgagctt ggatcagatt gtcgtttccc gccttcagtt taaactatca gtgtttgaca 1560

ggatatattg gcgggtaaac ctaagagaaa agagcgttta ttagaataac ggatatttaa 1620

aagggcgtga aaaggtttat ccgttcgtcc atttgtatgt gcatgccaac cacagggttc 1680

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acgttcagtg cagccgtctt ctgaaaacga catgtcgcac aagtcctaag ttacgcgaca 1800

ggctgccgcc ctgccctttt cctggcgttt tcttgtcgcg tgttttagtc gcataaagta 1860

gaatacttgc gactagaacc ggagacatta cgccatgaac aagagcgccg ccgctggcct 1920

gctgggctat gcccgcgtca gcaccgacga ccaggacttg accaaccaac gggccgaact 1980

gcacgcggcc ggctgcacca agctgttttc cgagaagatc accggcacca ggcgcgaccg 2040

cccggagctg gccaggatgc ttgaccacct agccctggcg acgttgtgac agtgaccagg 2100

ctagaccgcc tggcccgcag cacccgcgac ctactggaca ttgccgagcg catccaggag 2160

gccggcgcgg gcctgcgtag cctggcagag ccgtgggccg acaccaccac gccggccggc 2220

cgcatggtgt tgaccgtgtt cgccggcatt gccgagttcg agcgttccct aatcatcgac 2280

cgcacccgga gcgggcgcga ggccgccaag gcccgaggcg tgaagtttgg cccccgccct 2340

accctcaccc cggcacagat cgcgcacgcc cgcgagctga tcgaccagga aggccgcacc 2400

gtgaaagagg cggctgcact gcttggcgtg catcgctcga ccctgtaccg cgcacttgag 2460

cgcagcgagg aagtgacgcc caccgaggcc aggcggcgcg gtgccttccg tgaggacgca 2520

ttgaccgagg ccgacgccct ggcggccgcc gagaatgaac gccaagagga acaagcatga 2580

aaccgcacca ggacggccag gacgaaccgt ttttcattac cgaagagatc gaggcggaga 2640

tgatcgcggc cgggtacgtg ttcgagccgc ccgcgcacgt ctcaaccgtg cggctgcatg 2700

aaatcctggc cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg gccggccagc ttggccgctg 2760

aagaaaccga gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt tgagtaaaac agcttgcgtc 2820

atgcggtcgc tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca aatacgcaag gggaacgcat 2880

gaaggttatc gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc aagacgacca tcgcaaccca 2940

tctagcccgc gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg ttagtcgatt ccgatcccca 3000

gggcagtgcc cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa ccgctaaccg ttgtcggcat 3060

cgaccgcccg acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc cggcgcgact tcgtagtgat 3120

cgacggagcg ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg atcaaggcag ccgacttcgt 3180

gctgattccg gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc accgccgacc tggtggagct 3240

ggttaagcag cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa gcggcctttg tcgtgtcgcg 3300

ggcgatcaaa ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag gcgctggccg ggtacgagct 3360

gcccattctt gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac ccaggcactg ccgccgccgg 3420

cacaaccgtt cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc cgcgaggtcc aggcgctggc 3480

cgctgaaatt aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta aagagaaaat gagcaaaagc 3540

acaaacacgc taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca gcaaggctgc aacgttggcc 3600

agcctggcag acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc agttgccggc ggaggatcac 3660

accaagctga agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca ttaccgagct gctatctgaa 3720

tacatcgcgc agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa atgagtagat gaattttagc 3780

ggctaaagga ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc accgacgccg tggaatgccc 3840

catgtgtgga ggaacgggcg gttggccagg cgtaagcggc tgggttgtct gccggccctg 3900

caatggcact ggaaccccca agcccgagga atcggcgtga cggtcgcaaa ccatccggcc 3960

cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag gccgcgcagg 4020

ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg caagcggccg 4080

ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg tcgattagga 4140

agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat gacgtgggca 4200

cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag cgtgaccgac 4260

gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt tccgcagggc 4320

cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt tcccatctaa 4380

ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc gtgttccgtc 4440

cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag cagaaagacg 4500

acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag cgtacgaaga 4560

aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt agccgctaca 4620

agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta gctgattgga 4680

tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac cccgattact 4740

ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc gccgcaggca 4800

aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc gccggagagt 4860

tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg ccggagtacg 4920

atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac cgcaacctga 4980

tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg caaattgccc 5040

tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga tagcacgtac attgggaacc 5100

caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg tacattggga 5160

accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt tccgcctaaa 5220

actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa ctgtctggcc 5280

agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc tccctacgcc 5340

ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct ggcctacggc 5400

caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc cggcgcccac 5460

atcaaggcac cctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag 5520

ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag 5580

ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc acgtagcgat 5640

agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc 5700

atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt 5760

ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 5820

ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 5880

tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 5940

tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 6000

gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 6060

ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 6120

tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 6180

agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 6240

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acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 6360

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tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt 6480

tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga 6540

tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca 6600

tgcattctag gtactaaaac aattcatcca gtaaaatata atattttatt ttctcccaat 6660

caggcttgat ccccagtaag tcaaaaaata gctcgacata ctgttcttcc ccgatatcct 6720

ccctgatcga ccggacgcag aaggcaatgt cataccactt gtccgccctg ccgcttctcc 6780

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cgccgtggga aaagacaagt tcctcttcgg gcttttccgt ctttaaaaaa tcatacagct 6900

cgcgcggatc tttaaatgga gtgtcttctt cccagttttc gcaatccaca tcggccagat 6960

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aatccgatat gtcgatggag tgaaagagcc tgatgcactc cgcatacagc tcgataatct 7080

tttcagggct ttgttcatct tcatactctt ccgagcaaag gacgccatcg gcctcactca 7140

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ttccttccag ccatagcatc atgtcctttt cccgttccac atcataggtg gtccctttat 7260

accggctgtc cgtcattttt aaatataggt tttcattttc tcccaccagc ttatatacct 7320

tagcaggaga cattccttcc gtatctttta cgcagcggta tttttcgatc agttttttca 7380

attccggtga tattctcatt ttagccattt attatttcct tcctcttttc tacagtattt 7440

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ctaaaacctt aaataccaga aaacagcttt ttcaaagttg ttttcaaagt tggcgtataa 7560

catagtatcg acggagccga ttttgaaacc gcggtgatca caggcagcaa cgctctgtca 7620

tcgttacaat caacatgcta ccctccgcga gatcatccgt gtttcaaacc cggcagctta 7680

gttgccgttc ttccgaatag catcggtaac atgagcaaag tctgccgcct tacaacggct 7740

ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg ctgcctgtat cgagtggtga ttttgtgccg 7800

agctgccggt cggggagctg ttggctggct ggtggcagga tatattgtgg tgtaaacaaa 7860

ttgacgctta gacaacttaa taacacattg cggacgtttt taatgtactg aattaacgcc 7920

gaattaattc gggggatctg gattttagta ctggattttg gttttaggaa ttagaaattt 7980

tattgataga agtattttac aaatacaaat acatactaag ggtttcttat atgctcaaca 8040

catgagcgaa accctatagg aaccctaatt cccttatctg ggaactactc acacattatt 8100

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gtagaaacca tcggcgcagc tatttacccg caggacatat ccacgccctc ctacatcgaa 9060

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caatggaatc cgaggaggtt tcccgatatt accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt 9600

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gagtagacga gagtgtcgtg ctccaccatg ttggcaagct gctctagcca atacgcaaac 10020

cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact 10080

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aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat 10200

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Hyg-R

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gtgtcacgtt gcaagacctg 20

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PtoU6 stem loop RT

<400> 8

gtgcagggtc cgaggttttg gaccatttct cgat 34