一种防治十字花科作物根肿病的生物制剂及其应用

摘要

本发明公开了一种防治十字花科作物根肿病的生物制剂及其应用，属于应用微生物领域。生物制剂的生产菌株为解淀粉芽孢杆菌菌株Bacillus amyloliquefaciens KM 68，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017228。本发明方法为土壤太阳热处理结合解淀粉芽孢杆菌菌株Bacillus amyloliquefaciens KM 68的菌液灌根处理法，该方法能够有效的防治十字花科作物根肿病，有利于十字花科作物增产，并且该防治方法操作简单，费用低，生物制剂易于工厂生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种防治十字花科作物根肿病的生物制剂及其应用，属于应用微生物领域。

背景技术

十字花科作物蔬菜根肿病是由芸薹属根肿菌（PLasmodiophora>Woron）浸染引起的一种世界性土传疾病。目前大部分国家和地区均有发生。由于该病原菌传染性强，传播速度快，防治困难，近年来，十字花科作物根肿病在我国大部分地区迅速蔓延，严重威胁着十字花科农作物的生产。

目前，防治十字花科作物根肿病的方法主要包括：药剂防治、抗病育种，生物防治。由于芸薹属根肿菌属于专性寄生菌，理论上抗病育种是防治十字花科作物根肿病最有效的方式，然而，芸薹属根肿菌生理小种众多，变异快，很难培育出长期有效的抗病品种，目前化学药剂防治仍是防治十字花科作物根肿病的主要途径，然而药剂防治不仅费时费力，且长期使用化学农药，势必导致土壤中化学农药残留大量积累，化学农药残留一旦进入农产品中，将直接危害人们的健康。近年来有研究者将生防菌应用到十字花科作物根肿病的防治中，并发现了一些对根肿病有良好效果防治的细菌、真菌，如解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，链霉菌，木霉菌，枝顶孢属内生真菌等。但单独使用生防菌防治根肿病，往往防治效果不佳，不能提高农作物的产量，且长期的使用生防菌，势必导致土壤中的微生物多样性发生改变，对土壤微生物产生不良的影响。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种防治十字花科作物根肿病的生物制剂，能够高效、无毒、安全、无残留，对环境友好的防治十字花科根肿病。

本发明采用的微生物菌株为解淀粉芽孢杆菌Bacillus>KM68菌株，该菌株已于2017年5月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2017228。

本发明的解淀粉芽孢杆菌Bacillus>KM 68菌株，从云南省昆明市嵩明县土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得，经形态学、培养性状及DNA自动鉴定系统测定，该菌株为解淀粉芽孢杆菌的一个新菌株Bacillus>KM68。

本发明另一目的是将解淀粉芽孢杆菌Bacillus> KM 68菌株制成生物制剂应用在防治十字花科作物根肿病中。

所述的防治十字花科作物根肿病的生物制剂的应用方法，具体步骤如下：

（1）土壤太阳热处理：深耕土壤、灌水，密封，然后进行太阳热处理30天以上；

（2）温室栽培：采集步骤（1）所得太阳热处理的土壤样品置于温室内的穴盘中，在穴盘中播种十字花科作物的植物种子，取太阳热处理的土壤样品覆盖，浇水，十字花科作物的植物种子出苗至长出3~4片叶子时，剪去多余的幼苗，每穴保留一株健康的幼苗，使用生物制剂对十字花科作物植物幼苗进行灌根处理1次；

所述生物制剂为解淀粉芽孢杆菌Bacillus>KM 68菌株的菌液，菌液的芽孢量为4×10⁵~>7cfu/mL；

本发明提供的防治十字花科作物根肿病的生物制剂具有如下优点：

（1）本发明采用土壤太阳热处理法结合解淀粉芽孢杆菌Bacillus>KM 68的生物制剂处理法，不仅可有效防治十字花科作物根肿病，并且可明显提高作物的产量；

（2）本发明在生物制剂处理过程中菌液的施用浓度低，菌液施用剂量少，并且仅需灌根一次；操作简单，费用低，对环境无危害，且通过太阳热处理能够对恶化的土壤环境有一定的修复作用。

附图说明

图1为本发明解淀粉芽孢杆菌株Bacillus> KM 68的菌落图；

图2为本发明解淀粉芽孢杆菌株Bacillus> KM 68的电子显微镜扫描图片；

图3为本发明解淀粉芽孢杆菌株Bacillus> KM 68的生长曲线。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明进一步的详细说明，但是本发明的保护范围并不仅限于所述内容。

解淀粉芽孢杆菌株Bacillus> KM 68是从云南省嵩明县土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离筛选获得，于2017年5月2日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2017228。

实施例1：解淀粉芽孢杆菌株Bacillus> KM 68的筛选分离

LB培养基配方：胰蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，氯化钠 5 g/L，琼脂糖 15 g/L；pH 值为7.4±0.1；称量后加蒸馏水搅拌溶解，分装入三角瓶中，在121℃高温高压灭菌，倒平板；

称取1 g云南省嵩明县采集的土壤样品，放入盛有50 mL无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中，震荡摇匀30 min，然后使用移液枪从三角瓶中吸取1 mL上清液，加入另一支盛有9 mL无菌水的试管中，混合，按此方法，分别制成稀释浓度为原溶液浓度的10^-3、10^-4、10^-5倍的土壤溶液，取100>Bacillus>>

实施例2：解淀粉芽孢杆菌株Bacillus> KM 68的形态学

采用梯度稀释法制备解淀粉芽孢杆菌株Bacillus> KM 68的菌悬液，分别吸取10 uL不同稀释度的菌悬液涂布于LB培养基平板上进行培养，8~15 h后对长出的单菌落大小，形状，表面，边缘，颜色及透明度等特性进行观察；

在LB培养基上分别培养不同稀释度的解淀粉芽孢杆菌株Bacillus>amyloliquefaciens>Bacillus>>

通过培养和观察菌体具有如下特征：菌落呈圆形或椭圆形，有褶皱，稍隆起，不透明，呈白色，革兰氏染色呈阳性，显微镜下呈短杆状（菌落图形见图1，电子显微镜扫描图片见图2）。

实施例3：解淀粉芽孢杆菌株Bacillus> KM 68的16s rDNA基因序列鉴定

将单菌落接种于LB培养基培养经过24 h后，取1 uL进行菌落PCR验证。用于菌液PCR的引物如下：正向引物27F： 5^，-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3^，；>，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3^，。PCR反应体系：10xTaq>Bacillus>>Bacillus>amyloliquefaciens>Bacillus>>Bacillus>amyloliquefaciens>Bacillus>>

。

实施例4：解淀粉芽孢杆菌菌株Bacillus> KM 68的培养生长

LB培养基配方为：蛋白胨10 g，氯化钠5 g，酵母膏10 g，蒸馏水1 L，pH值为7.4；

使用LB液体培养基测定解淀粉芽孢杆菌Bacillus>KM 68生长曲线：称量胰蛋白胨1 g，酵母膏0.5 g，氯化钠 0.5 g，琼脂糖 1.5，加水溶解定容至100 mL；使用11mol/L的氢氧化钠溶液将7.0±0.1，随后将配置的LB培养基，分装入10个试管中，在121℃条件下高温高压灭菌，随后冷却至室温，在无菌环境下，每个试管中接入10uL的解淀粉芽孢杆菌Bacillus>KM 68菌液，在37℃，150 r/min 条件下，摇床培养24小时，每2小时测一次菌液的OD值，以时间（小时）为横坐标，以OD值为纵坐标，做解淀粉芽孢杆菌Bacillus>KM 68生长曲线图（见图3），结果表明，解淀粉芽孢杆菌Bacillus>KM 68在0-10小时繁殖速度最快，随后菌落趋于稳定；

以质量百分数计，液体发酵培养基配方：黄豆粉3%，玉米粉3%，氯化钠0.5%，碳酸钙0.5%，其余为水；

将解淀粉芽孢杆菌株Bacillus> KM 68的孢子移植到LB培养基中，在温度为37℃条件下培养10 h，得到种子液，按照种子液与水的体积比为1:100的比例，将种子液接种到液体发酵培养基中，在培养温度为37 ℃条件下培养10 h，培养完成后，发酵液中解淀粉芽孢杆菌菌液浓度可达（1.6~3.2）×10⁸>

液体发酵制剂（防治十字花科作物根肿病的生物制剂）：经平板计数测定含菌量，含菌量达（1.6~3.2）×10⁸>

实施例5：液体发酵制剂（防治十字花科作物根肿病的生物制剂）对十字花科作物（小白菜）根肿病的防治效果实验和增产实验

实验对象：小白菜

制备生物制剂：按照实施例4的培养生长方法制备试验用生物制剂，经平板计数测定含菌量，解淀粉芽孢杆菌的含菌量达（1.6~3.2）×10⁸>

将生物制剂稀释20倍得到制剂A，将生物制剂稀释100倍得到制剂B，将生物制剂稀释500倍得到制剂C；

供药制剂及处理：

（1）土壤太阳热处理：对深耕的土壤灌水30min，使土壤中的水分充分饱和，覆盖一层塑料薄膜进行密封，然后进行太阳热处理30天，采集太阳热处理土壤样品；

（2）温室栽培：采用72孔培养穴盘，将步骤（1）太阳热处理的土壤样品置于温室内的穴盘中，在穴盘的每穴中播种3~4粒十字花科作物（小白菜）植物种子，取步骤（1）的太阳热处理土壤样品覆盖，浇水，十字花科作物植物（小白菜）种子出苗至长出3~4片叶子，剪去多余的幼苗，每穴保留一株健康的幼苗，使用生物制剂的稀释液对十字花科作物（小白菜）幼苗进行灌根处理1次，每株植物根部加入的生物制剂的稀释液为10mL；

A：生物制剂的稀释液为生物制剂稀释20倍的制剂A；

B：生物制剂的稀释液为生物制剂稀释100倍的制剂B；

C：生物制剂的稀释液为生物制剂稀释500倍的制剂C；

D：空白对照，采用清水对十字花科作物植物（小白菜）幼苗进行灌根处理1次，每株植物根部加入的清水量为10mL；

试验方法：试验共设4个处理，每个处理3次重复，共12个区，各区之间互不影响，收获时每个区分开测产；

调查方法：调查每个处理3个区的共108株幼苗，待幼苗生长至40天，将幼苗取出，测幼苗的地上部鲜重；

根肿病调查均以根部肿瘤的大小为依据，参照司军（2009）鉴定每株植物根肿病的发病等级：

0级：根部无肿瘤，根系发育正常；

1级：主根不发病或不明显，直径≤2倍茎基部；

2级：主根明显肿大。直径≤2-3倍茎基；

3级：主根明显肿大，直径≤3-倍茎基，无须根；

发病率=感病植株/统计的总株数

发病指数=∑（各级病株数×该株病情指数）/(调查总株树×最高级值)

相对防效=（对照病情指数-处理病情指数）×100/对照病情指数

实验结果如表1所示。

对比例1：仅土壤太阳热处理的防治方法

实验对象：小白菜

（1）土壤太阳热处理：深耕土壤，灌水30min，使土壤中的水分充分饱和，覆盖一层塑料薄膜进行密封，然后进行太阳热处理30天，采集太阳热处理的土壤样品；

（2）温室栽培：采用72孔培养穴盘，将步骤（1）的太阳热处理土壤样品置于温室内的穴盘中，在穴盘的每穴中播种3~4粒十字花科作物植物（小白菜）种子，取步骤（1）的太阳热处理土壤样品覆盖，浇水，十字花科作物植物（小白菜）种子出苗至长出3~4片叶子，剪去多余的幼苗，每穴保留一株健康的幼苗；

试验方法：田间管理同常规生产；试验设1个处理，3次重复，共3个区，收获时每个区分开测产；

调查方法与实施例5相同；实验结果如表1所示。

对比例2：仅采用液体发酵制剂的防治方法

实验对象：小白菜

采用72孔培养穴盘，温室内的穴盘中加入土壤样品，在穴盘的每穴中播种3~4粒十字花科作物植物（小白菜）种子，取土壤样品覆盖，浇水，十字花科作物植物（小白菜）种子出苗至长出3~4片叶子，剪去多余的幼苗，每穴保留一株健康的幼苗；使用生物制剂的稀释液对十字花科作物植物（小白菜）幼苗进行灌根处理1次，每株植物根部加入的生物制剂的稀释液为10mL；

E：生物制剂的稀释液为生物制剂稀释20倍的制剂A；

F：生物制剂的稀释液为生物制剂稀释100倍的制剂B；

G：生物制剂的稀释液为生物制剂稀释500倍的制剂C；

试验方法：除施药设置不同水平外，其他田间管理同常规生产；试验设3个处理，共9个区，收获时每区分开测产；

调查方法与实施例5相同；实验结果如表1所示；

实验结果：

表1.对小白菜根肿病的防治效果

结果表明：单独采用太阳热处理土壤明显提高了小白菜幼苗的产量（P<0.05），但对根肿病的防治效果仅为46.9%，单独使用液体发酵制剂（防治十字花科作物根肿病的生物制剂）也能抑制根肿病的发生，但单独使用液体发酵制剂（防治十字花科作物根肿病的生物制剂）并不能增加白菜产量（P>0.05），且不同浓度的液体发酵制剂（防治十字花科作物根肿病的生物制剂）对根肿病的防治效果有明显差异，当液体发酵制剂（防治十字花科作物根肿病的生物制剂）中解淀粉芽孢杆菌Bacillus> KM 68的含菌量分别为4×10⁵>6>7>Bacillus>amyloliquefaciens>Bacillus>>6cfu/mL时，对小白菜根肿病的防治效果达到81.7%，继续提高生防菌浓度，对小白菜根肿病的防治效果提高并不明显。

实施例6：液体发酵制剂（防治十字花科作物根肿病的生物制剂）对十字花科作物（茎芥菜）根肿病的防治实验

实验对象：茎芥菜

制备生物制剂：按照实施例4的培养生长方法制备试验用生物制剂，经平板计数测定含菌量，解淀粉芽孢杆菌的含菌量达（1.6~3.2）×10⁸>

将生物制剂稀释20倍得到制剂A，将生物制剂稀释100倍得到制剂B，将生物制剂稀释500倍得到制剂C；

供药制剂及处理：

（1）土壤太阳热处理：对深耕土壤的土壤灌水30min，使土壤中的水分充分饱和，覆盖一层塑料薄膜进行密封，然后进行太阳热处理35天，采集太阳热处理土壤样品；

（2）温室栽培：采用72孔培养穴盘，将步骤（1）的太阳热处理土壤样品置于温室内的穴盘中，在穴盘的每穴中播种3~4粒十字花科作物（茎芥菜）植物种子，取步骤（1）的太阳热处理土壤样品覆盖，浇水，十字花科作物植物（茎芥菜）种子出苗至长出3~4片叶子，剪去多余的幼苗，每穴保留一株健康的幼苗，使用生物制剂的稀释液对十字花科作物植物（茎芥菜）幼苗进行灌根处理1次，每株植物根部加入的生物制剂的稀释液为10mL；

A：生物制剂的稀释液为生物制剂稀释20倍的制剂A；

B：生物制剂的稀释液为生物制剂稀释100倍的制剂B；

C：生物制剂的稀释液为生物制剂稀释500倍的制剂C；

D：空白对照，采用清水对十字花科作物植物（茎芥菜）幼苗进行灌根处理1次，每株植物根部加入的清水量为10mL；

试验方法：除施药设置不同水平外，其他田间管理同常规生产；试验设4个处理，3次重复，共12个区，收获时每区分开测产；

调查方法：在茎芥菜收获期调查病情地上部生物学产量；

实验结果

表2.对茎芥菜根肿病的防治效果

太阳热处理土壤结合生防菌灌根处理，在液体发酵制剂（防治十字花科作物根肿病的生物制剂）的解淀粉芽孢杆菌Bacillus> KM 68的含菌量较低时也能够对茎芥菜根肿病达到很好的防治效果，当解淀粉芽孢杆菌Bacillus>KM 68的含菌量达到2×10⁶cfu/mL时，对茎芥菜根肿病的防治效果达到76%，继续提高生防菌浓度，对茎芥菜根肿病的防治效果提高并不明显。

实施例7：液体发酵制剂（防治十字花科作物根肿病的生物制剂）对十字花科作物（结球甘蓝）根肿病的防治实验

实验对象：结球甘蓝

制备生物制剂：按照实施例4的培养生长方法制备试验用生物制剂，经平板计数测定含菌量，解淀粉芽孢杆菌的含菌量达（1.6~3.2）×10⁸>

将生物制剂稀释20倍得到制剂A，将生物制剂稀释100倍得到制剂B，将生物制剂稀释500倍得到制剂C；

供药制剂及处理：

（1）土壤太阳热处理：对深耕土壤的土壤灌水30min，使土壤中的水分充分饱和，覆盖一层塑料薄膜进行密封，然后进行太阳热处理35天，采集太阳热处理土壤样品；

（2）温室栽培：采用72孔培养穴盘，将步骤（1）的太阳热处理土壤样品置于温室内的穴盘中，在穴盘的每穴中播种3~4粒十字花科作物（结球甘蓝）植物种子，取步骤（1）的太阳热处理土壤样品覆盖，浇水，十字花科作物植物（结球甘蓝）种子出苗至长出3~4片叶子，剪去多余的幼苗，每穴保留一株健康的幼苗，使用生物制剂的稀释液对十字花科作物植物（茎芥菜）幼苗进行灌根处理1次，每株植物根部加入的生物制剂的稀释液为10mL；

A：生物制剂的稀释液为生物制剂稀释20倍的制剂A；

B：生物制剂的稀释液为生物制剂稀释100倍的制剂B；

C：生物制剂的稀释液为生物制剂稀释500倍的制剂C；

D：空白对照，采用清水对十字花科作物植物（结球甘蓝）幼苗进行灌根处理1次，每株植物根部加入的清水量为10mL；

试验方法：除施药设置不同水平外，其他田间管理同常规生产；试验设4个处理，3次重复，共12个区，收获时每区分开测产；

调查方法：在结球甘蓝收获期调查病情地上部生物学产量；

实验结果

表3.对结球甘蓝根肿病的防治效果

太阳热处理土壤结合生防菌灌根处理，在液体发酵制剂（防治十字花科作物根肿病的生物制剂）的解淀粉芽孢杆菌Bacillus> KM 68的含菌量较低时也能够对结球甘蓝根肿病达到很好的防治效果，当解淀粉芽孢杆菌Bacillus>KM 68的含菌量达到2×10⁶cfu/mL时，对结球甘蓝根肿病的防治效果达到75.36%，继续提高生防菌浓度，对结球甘蓝根肿病的防治效果提高并不明显。

综上，太阳热处理结合生防菌解淀粉芽孢杆菌对十字花科根肿病有明显的防治作用，且能够增加了植物的产量，当生防菌的浓度达到2×10⁶cfu/mL时，即能够对根肿病达到很好的防治效果，因此太阳处理结合解淀粉芽孢杆菌Bacillus> KM 68对十字花科根肿病的防治及增产具有良好的应用前景。

<110> 昆明理工大学

<120> 一种防治十字花科作物根肿病的生物制剂及其应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1427

<212> DNA

<213> Bacillus amyloliquefaciens KM68

<400> 1

tctataatgc aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg 60

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