一种北美红枫十月光辉品种组培快繁方法

摘要

本发明公开了一种北美红枫十月光辉组培快繁方法，本发明以茎段或叶片为外植体，经过（1）外植体消毒；（2）愈伤诱导培养；（3）愈伤增殖培养；（4）胚性细胞诱导；（5）不定芽诱导；（6）不定根诱导；（7）炼苗移栽等多步骤成功地获得了该北美红枫十月光辉品种组织培养再生植株，建立了北美红枫十月光辉组织培养植株再生体系，为实现该品种规模化工厂育苗提供了参考。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术中植物组织培养领域，特别涉及一种北美红枫十月光辉品种组培快繁方法。

背景技术

北美红枫十月光辉是红叶槭的一种，属于大型落叶乔木。春季红叶红花，夏季叶片为绿色，秋季因温度变化叶色呈现红色，冬季落叶。原产于美国东部，十月光辉红枫是中国引进的北美红枫中表现最稳定、变色最红艳的品种之一。

据报道播种、扦插可获得幼苗，但播种成苗在经过性状杂交后发生变异，其品种优良特性不易保留，而扦插苗出圃量低，也难达到市场需求。因而通过组培快繁获得大量具母本优良特性苗木成为解决该问题有效方案。目前北美红枫快繁体系尚在完善之中，仅有少数品种有所突破，其它品种研究多见于愈伤诱导阶段，尤其是关于“十月光辉”不定器官形成的报道未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种北美红枫十月光辉组培快繁方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种北美红枫十月光辉品种组培快繁方法，包括以下步骤：

（1）外植体消毒：以北美红枫十月光辉叶片或茎段为外植体，先对其进行消毒处理；

（2）愈伤诱导培养：将步骤（1）准备好的外植体接种到愈伤诱导培养基进行培养，将接种后的材料置于湿度75%，温度（25±2）℃，光照14h、光照强度1500lx、黑暗10h条件的人工气候箱中进行培养；

（3）愈伤增殖培养：将步骤（2）得到的愈伤组织每隔30d分割继代于愈伤增殖培养基，在步骤（2）的相同培养条件下继续培养；

（4）胚性细胞诱导：在上述愈伤基础上选择浅黄色、白色疏松愈伤组织接种于体胚诱导培养基培养15d，后将培养愈伤转移到不含生长调节剂的培养基进行培养直到体胚细胞形成；

（5）不定芽诱导：将步骤（4）得到的胚性愈伤组织置于不定芽诱导培养基中培养，培养条件为湿度85%，温度（25±2）℃，光照18h、光照强度3000lx、2h黑暗；

（6）不定根诱导：将步骤（5）得到的胚性愈伤组织继代于不定根诱导培养基中培养，培养条件为湿度85%，温度（25±2）℃，光照6h、光照强度1500lx、18h黑暗；

（7）炼苗移栽：将已长出完整器官的幼苗培养基瓶盖打开，在光照强度3000lx的光照下炼苗5～7d，之后将组培苗从培养基中取出，洗掉根部培养基后栽至配置的营养土中进行培养15d，培养条件为湿度35%，温度（25±2）℃，光照14h、光照强度2500lx、黑暗10h，幼苗表面喷施水，后连同营养土一起栽植大田。

进一步地，所述步骤（1）中外植体的消毒处理方法是：采集无任何部位损伤的叶片外植体，用流量为80mL/s的自来水清洗15～20min，之后将其移至超净工作台用75%医用酒精消毒30s，后用无菌水清洗5次，再用0.1%的升汞溶液消毒2～4min，再用无菌水清洗5次，后用无菌滤纸吸去叶片表面水分，备用；

或者，采集所留叶柄不能太短的茎段外植体，将茎段剪成2～3cm长，用流量为120mL/s的自来水清洗15～20min，之后将其移至超净工作台用75%医用酒精消毒30s，用含有效氯3%的次氯酸钠消毒6～8min，后用无菌水清洗5次，再用0.1%的升汞溶液消毒8～10min，再用无菌水清洗5次，后用无菌滤纸吸去叶片表面水分，备用。

进一步地，所述步骤（2）中愈伤诱导培养基为MS+0.8～1.0mg/LTDZ+1.0～1.2mg/L6-BA+0.5～0.8mg/LNAA+35～40g/L蔗糖+7.5～10g/L琼脂的半固定培养基。

进一步地，所述步骤（3）中愈伤增殖培养基为MS+2.0～2.5mg/LTDZ+0.8～1.0mg/L6-BA+0.2～0.5mg/LNAA+35～40g/L蔗糖+7.5-10g/L琼脂的半固定培养基。

进一步地，所述步骤（4）中体胚细胞诱导培养基为MS+1.6～2.0mg/LTDZ+0.4～0.5mg/LNAA+35～40g/L蔗糖+7.5～10g/L琼脂的半固定培养基，所述的不含生长调节剂的培养基为MS+35～40g/L蔗糖+7.5～10g/L琼脂的半固定培养基。

进一步地，所述步骤（5）中不定芽诱导培养基为MS+1.2～1.6mg/LTDZ+0～0.5mg/LNAA+35～40g/L蔗糖+7.5～10g/L琼脂半固定培养基。

进一步地，所述步骤（6）中不定根诱导培养基为MS+3.0～4.0mg/LTDZ+0.8～1.0mg/L6-BA+3.0～4.0mg/LNAA+35～40g/L蔗糖+7.5～10g/L琼脂的半固定培养基。

进一步地，所述步骤（7）中营养土的配方是腐殖质土、蛭石和石英砂，按体积比为3~4:1:1。

本发明的有益效果在于：

本发明以北美红枫“十月光辉”茎段或叶片为试验材料经消毒处理，通过不同培养基和激素筛选得到适合各阶段生长繁殖培养基，再通过外植体愈伤诱导、胚性细胞诱导以及特定器官诱导三个阶段建立外植体繁殖体系，以获得大量高质量北美红枫“十月光辉”组培苗，建立了系统的北美红枫“十月光辉”组织培养植株再生体系，为实现该品种规模化工厂育苗提供了参考。

附图说明

图1为不同外植体诱导形成愈伤组织照片，其中a: 茎段外植体培养15d，在切口处繁殖大量愈伤细胞；b: 茎段外植体培养30d，愈伤颜色加深；c: 叶片外植体培养15d，叶片边缘处形成愈伤，叶片发生严重形变； d: 叶片外植体培养30d，叶片形状基本不存在，完全被愈伤覆盖。

图2为胚性愈伤组织形成照片，其中a：继代3次培养100d后愈伤组织体内含大量胚性细胞；b：继代5次培养150d愈伤组织分化出白色胚性愈伤群细胞；c：初代培养45d时胚性愈伤组织；d：胚性愈伤不定器官形成。

图3为生根培养得到的照片，其中a：茎段外植体培养15d直接生根及愈伤生根；b：继代培养后带芽茎段外植体生根发芽；c：茎段外植体初代培养30d，在白色胚性愈伤组织上形成大量不定根；d：继代3次后愈伤组织诱导形成的完整植株。

图4为外植体芽诱导照片，其中a：初代培养30d，绿色胚性愈伤诱导形成茎枝；b：初代培养45d，在外植体切口处诱导形成不定芽；c，d：茎段直接诱导腋芽发育形成单个植株。

图5为炼苗移栽得到的北美红枫照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

（1）外植体消毒：采集无任何部位损伤的北美红枫十月光辉叶片外植体，用流量为80mL/s的自来水清洗15min，之后将其移至超净工作台用75%医用酒精消毒30s，后用无菌水清洗5次，再用0.1%的升汞溶液消毒2min，再用无菌水清洗5次，后用无菌滤纸吸去叶片表面水分，备用；

（2）愈伤诱导培养：将步骤（1）准备好的外植体接种到愈伤诱导培养基进行培养，将接种后的材料置于湿度75%，温度（25±2）℃，光照14h、光照强度1500lx、黑暗10h条件的人工气候箱中进行培养，所述愈伤诱导培养基为MS+0.8mg/LTDZ+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+35g/L蔗糖+7.5g/L琼脂的半固定培养基；

（3）愈伤增殖培养：将步骤（2）得到的愈伤组织每隔30d分割继代置于愈伤增殖培养基，在步骤（2）的相同培养条件下继续培养，所述愈伤增殖培养基为MS+2.0mg/LTDZ+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+35g/L蔗糖+7.5g/L琼脂的半固定培养基。叶片外植体诱导形成愈伤组织照片如图1 c和d所示，其中图1 c为叶片外植体培养15d的照片，叶片边缘处形成愈伤，叶片发生严重形变；图1 d为叶片外植体培养30d，叶片形状基本不存在，完全被愈伤覆盖；

（4）胚性细胞诱导：在上述愈伤基础上选择浅黄色、白色疏松愈伤组织接种于体胚诱导培养基培养15d，后将培养愈伤转移到不含生长调节剂的培养基进行培养直到体胚细胞形成，所述体胚诱导培养基为MS+1.6mg/LTDZ+0.5mg/LNAA+35g/L蔗糖+7.5g/L琼脂的半固定培养基，所述的不含生长调节剂的培养基为MS+35g/L蔗糖+7.5g/L琼脂的半固定培养基；胚性愈伤组织形成照片如图2所示，其中a：继代3次培养100d后愈伤组织体内含大量胚性细胞；b：继代5次培养150d愈伤组织分化出白色胚性愈伤群细胞；c：初代培养45d时胚性愈伤组织；d：胚性愈伤不定器官形成；

（5）不定芽诱导：将步骤（4）得到的胚性愈伤组织置于不定芽诱导培养基中培养，培养条件为湿度85%，温度（25±2）℃，光照18h、光照强度3000lx、2h黑暗, 所述不定芽诱导培养基为MS+1.2mg/LTDZ+0.5mg/LNAA+35g/L蔗糖+7.5g/L琼脂半固定培养基；

（6）不定根诱导：将步骤（5）得到的胚性愈伤组织继代置于不定根诱导培养基中培养，培养条件为湿度85%，温度（25±2）℃，光照6h、光照强度1500lx、18h黑暗，所述不定根诱导培养基为MS+4.0mg/LTDZ+1.0mg/L6-BA+3.0mg/LNAA+35g/L蔗糖+7.5g/L琼脂的半固定培养基；外植体芽诱导照片如图4所示，其中a：初代培养30d，绿色胚性愈伤诱导形成茎枝；b：初代培养45d，在外植体切口处诱导形成不定芽；c，d：茎段直接诱导腋芽发育形成单个植株；

（7）炼苗移栽：将已长出完整器官的幼苗培养基瓶盖打开，在光照强度3000lx的光照下炼苗5d，之后将组培苗从培养基中取出，洗掉根部培养基后栽至配置的营养土中进行培养15d，所述营养土的配方是腐殖质土、蛭石和石英砂，按重量比为3:1:1，培养条件为湿度35%，温度（25±2）℃，光照14h、光照强度1500lx、黑暗10h，幼苗表面喷施水，后连同营养土一起栽植大田。炼苗移栽得到的北美红枫照片如图5所示。

实施例2

（1）外植体消毒：采集所留叶柄不能太短的北美红枫十月光辉茎段外植体，将茎段剪成2～3cm长，用流量为120mL/s的自来水清洗15～20min，之后将其移至超净工作台用75%医用酒精消毒30s，用含有效氯3%的次氯酸钠消毒6～8min，后用无菌水清洗5次，再用0.1%的升汞溶液消毒8～10min，再用无菌水清洗5次，后用无菌滤纸吸去叶片表面水分，备用；

（2）愈伤诱导培养：将步骤（1）准备好的外植体接种到愈伤诱导培养基进行培养，将接种后的材料置于湿度75%，温度（25±2）℃，光照14h、光照强度1500lx、黑暗10h条件的人工气候箱中进行培养，所述愈伤诱导培养基为MS+1.0mg/LTDZ+1.2mg/L6-BA+0.8mg/LNAA+40g/L蔗糖+10g/L琼脂的半固定培养基；

（3）愈伤增殖培养：将步骤（2）得到的愈伤组织每隔30d分割继代置于愈伤增殖培养基，在步骤（2）的相同培养条件下继续培养，所述愈伤增殖培养基为MS+2.5mg/LTDZ+0.8mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+40g/L蔗糖+10g/L琼脂的半固定培养基；茎段外植体诱导形成愈伤组织如图1所示，其中a: 茎段外植体培养15d，在切口处繁殖大量愈伤细胞；b: 茎段外植体培养30d，愈伤颜色加深；

（4）胚性细胞诱导：在上述愈伤基础上选择浅黄色、白色疏松愈伤组织接种于体胚诱导培养基培养15d，后将培养愈伤转移到不含生长调节剂的培养基进行培养直到体胚细胞形成，所述体胚诱导培养基为MS+2.0mg/LTDZ+0.4mg/LNAA+40g/L蔗糖+10g/L琼脂的半固定培养基，所述的不含生长调节剂的培养基为MS+35g/L蔗糖+7.5g/L琼脂的半固定培养基；

（5）不定芽诱导：将步骤（4）得到的胚性愈伤组织置于不定芽诱导培养基中培养，培养条件为湿度85%，温度（25±2）℃，光照18h、光照强度3000lx、2h黑暗, 所述不定芽诱导培养基为MS+1.6mg/LTDZ+0.1mg/LNAA+40g/L蔗糖+10g/L琼脂半固定培养基；生根培养得到的照片如图3所示，其中a：茎段外植体培养15d直接生根及愈伤生根；b：继代培养后带芽茎段外植体生根发芽；c：茎段外植体初代培养30d，在白色胚性愈伤组织上形成大量不定根；d：继代3次后愈伤组织诱导形成的完整植株；

（6）不定根诱导：将步骤（5）得到的胚性愈伤组织继代置于不定根诱导培养基中培养，培养条件为湿度85%，温度（25±2）℃，光照6h、光照强度1500lx、18h黑暗，所述不定根诱导培养基为MS+3.0mg/LTDZ+0.8mg/L6-BA+4.0mg/LNAA+35g/L蔗糖+8.0g/L琼脂的半固定培养基；外植体芽诱导照片如图4所示，其中a：初代培养30d，绿色胚性愈伤诱导形成茎枝；b：初代培养45d，在外植体切口处诱导形成不定芽；c，d：茎段直接诱导腋芽发育形成单个植株；

（7）炼苗移栽：将已长出完整器官的幼苗培养基瓶盖打开，在光照强度3000lx的光照下炼苗7d，之后将组培苗从培养基中取出，洗掉根部培养基后栽至配置的营养土中进行培养15d，所述营养土的配方是腐殖质土、蛭石和石英砂，按重量比为4:1:1，培养条件为湿度35%，温度（25±2）℃，光照14h、光照强度1500lx、黑暗10h，幼苗表面喷施水，后连同营养土一起栽植大田。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。