鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物、应用及鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的方法

摘要

本发明提供了鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物、应用及鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的方法，将来自不同株系的雌性蝇蛹金小蜂和雄性蝇蛹金小蜂交配，获得具有鉴别性的寄生蜂卵；对获得的有鉴别性的寄生蜂卵进行DNA提取；以此为模板，利用设计的引物进行PCR扩增，所得产物通过琼脂糖凝胶电泳跑条带，根据条带数来判断卵的雌雄，单条带为未受精的单倍体卵，即雄性；双条带为受精的二倍体卵，即雌性。与现有技术相比，本发明利用微卫星的特点，设计微卫星引物，与寄生蜂的性别决定方式相结合，成功鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别。

说明书

技术领域

本发明属于昆虫进化领域，具体涉及一种鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物、应用及鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的方法。

背景技术

蝇蛹金小蜂(Pachycrepoideus vindemmiae Rondani)属于小蜂总科(Chalcidoidea)金小蜂科(Pteromalidae)金小蜂亚科(Pteromalinae)，是双翅目等许多昆虫蛹期的寄生蜂。它是家蝇蛹期阶段最常见寄生蜂种类之一，蝇蛹金小蜂广泛分布于全国不同地区，是众多寄生蜂当中的优势种群。

蝇蛹金小蜂目前的性别鉴定只可以在成虫期进行外观鉴定。雌性寄生蜂的尾部较为明显的产卵针成为寄生蜂成虫性别鉴定的主要依据。

微卫星DNA又称简单序列重复一般核心序列为2-6个碱基首尾相连组成的串联重复序列，微卫星DNA序列可分为单一型、复合型和间断型三种类型。微卫星序列两侧的DNA序列保守性很强。这种串联重复序列随机均匀分布所有真核生物的基因组中，在基因的间隔区和内含子中。微卫星DNA序列中重复单位数目的改变能够引起相当高的多态性，但突变率很低，在家系中可以稳定地遗传，是一种非常好的遗传标志。微卫星序列比基因组其它大部分区域具有更强的稳定遗传性；由于微卫星DNA大部分存在于非编码序列之间，使得更多的变异得以保留。微卫星DNA序列由高度突变的核心序列和极其保守的侧翼区域组成，两端的保守序列被广泛运用于微卫星引物的设计。因此微卫星标记经常用于相近物种，甚至在更高的分类单元，科和属上都有应用。

发明内容

本发明的目的在于提供鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物、应用及鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的方法，利用微卫星的高保守性、高多态性以及低突变率特点，设计微卫星引物，与寄生蜂的单双倍型性别决定方式相结合，成功鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别。

本发明提供的鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物，核苷酸序列为：

AF1F：ACAGCAACCAAGTCGGCTAT，AF1R：CATGCAGAGTCGATGCAGAT；

或；

AF2F：ACAGCAACCAAGTCGGCTAT，AF2R：ATGCTCATGCAGAGTCGATG。

引物AF1重复基序为(GA)9gc(GA)7a(AG)9，溶解温度Tm为62.5℃，扩增片段大小为175-547；

引物AF2重复基序为(GA)9gc(GA)7a(AG)9，溶解温度Tm为62.5℃，扩增片段大小为188-314。

所述鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物的设计方法为：

饲养并建立家蝇繁殖株系，获得家蝇蛹，然后在不同地理位置诱集寄生蜂，通过形态鉴定，获得蝇蛹金小蜂，构建不同地理品系蝇蛹金小蜂的培养株系；对不同地区株系的蝇蛹金小蜂进行DNA提取，随机片段化，纯化后进行末端修复，加“A”，并连接测序接头，随后用琼脂糖凝胶电泳选取350bp大小的片段，最后进行PCR扩增；对质控合格的文库进行上机测序得到原始数据，原始测序数据再经过质控、基因组组装以及微卫星标记筛选，获得序列位置匹配，SSR重复单元一致，但是重复数不一致SSR标记引物，筛选出多态性丰富的微卫星引物，合成2对引物，序列如下：

AF1F：ACAGCAACCAAGTCGGCTAT，AF1R：CATGCAGAGTCGATGCAGAT；

或

AF2F：ACAGCAACCAAGTCGGCTAT，AF2R：ATGCTCATGCAGAGTCGATG。

本发明提供的鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物的应用，用于鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别。

本发明提供的鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的方法，包括以下步骤：

1)饲养并建立家蝇繁殖株系，获得家蝇蛹，然后在不同地理位置诱集寄生蜂，通过形态鉴定，获得蝇蛹金小蜂，构建不同地理品系蝇蛹金小蜂的培养株系；

2)将来自不同株系的雌性蝇蛹金小蜂和雄性蝇蛹金小蜂交配，获得具有鉴别性的寄生蜂卵；

3)对步骤2)获得的有鉴别性的寄生蜂卵进行DNA提取；

4)以步骤3)提取的DNA为模板，利用鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物进行PCR扩增，所得产物通过琼脂糖凝胶电泳跑条带，根据条带数来判断卵的雌雄，单条带为未受精的单倍体卵，即雄性；双条带为受精的二倍体卵，即雌性。

进一步的，步骤1)中所述不同地理位置要求环境、气候差别大。优选的在安徽芜湖、新疆乌鲁木齐和甘肃敦煌三地构建蝇蛹金小蜂的培养株系。

进一步的，步骤2)具体为：

在寄生蜂寄生家蝇蛹15天后，将每个家蝇蛹隔离起来，确保每只出蜂的寄生蜂是未交配状态，出蜂后的未交配寄生蜂饲养一天，来自不同株系的雌性蝇蛹金小蜂和雄性蝇蛹金小蜂交配，并给寄主家蝇蛹供其寄生产卵，获得具有鉴别性的寄生蜂卵。

步骤2)中交配的雌性蝇蛹金小蜂和雄性蝇蛹金小蜂来自不同的株系。

步骤2)中具体为芜湖株系与新疆株系寄生蜂交配或芜湖株系与敦煌寄生蜂交配。

步骤3)具体包括以下步骤：

A、取寄生蜂卵到离心管中，加入缓冲液GA，室温放置，使离心管温度平衡到室温；

B、加入Proteinase K溶液，涡旋混匀；

C、孵育直到样本充分降解消化；

D、加入缓冲液GB和RNA储存液，充分颠倒混匀，溶液应变清亮，离心以去除管盖内壁的液滴；

E、加入乙醇，颠倒混匀样品，室温放置，离心以去除管盖内壁的液滴；

F、取上一步所得溶液全部转入吸附柱CR2中，离心，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中；

G、向吸附柱CR2中加入缓冲液GD，离心，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中；

H、向吸附柱CR2中加入漂洗液PW，离心，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中；

I、重复步骤H，然后将吸附柱CR2置于室温放置，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

J、将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加洗脱缓冲液TB，室温放置后，离心，将溶液收集到离心管中，保存。

进一步的，步骤A具体为：取不超过10mg的寄生蜂卵到1.5ml的离心管中，立即加入180μl缓冲液GA，室温放置，使离心管温度平衡到室温。

步骤B具体为：加入20μl Proteinase K溶液，涡旋混匀10秒。

步骤C具体为：在56℃孵育直到样本充分降解消化，需要时间30min到1h，期间每15min需要涡旋混匀；或者置于水浴振荡仪中消化，离心以收集附着在管壁及管盖的液体。

步骤D具体为：加入200μl的缓冲液GB和1μl Carrier RNA储存液，浓度为1μg/μl，充分颠倒混匀，70℃放置10min，期间每3min涡旋混匀10sec，溶液变清亮，离心以去除管盖内壁的液滴。

步骤E具体为：加入200μl的乙醇(乙醇体积浓度96-100％)，轻轻颠倒混匀样品，室温放置5min，离心以去除管盖内壁的液滴。如果室温超过25℃，请将乙醇置冰上预冷。

步骤F具体为：取上一步所得溶液全部转入吸附柱CR2中，吸附柱放入收集管中，在12000rpm离心30秒，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

步骤G具体为：向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。缓冲液GD使用前请先检查是否已加入无水乙醇。

步骤H具体为：向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW，12000rpm(检查是否已加入无水乙醇)。

步骤I具体为：离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。(漂洗液PW使用前请先体为：向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR2置于室温放置2-5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。(漂洗液PW使用前请先检查是否已加入无水乙醇)。

步骤J具体为：将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存。

步骤4)PCR扩增体系具体为：

扩增体系中，10×Buffer Mg(‐)1.5ul、25mM Mgcl₂>2O>

蝇蛹金小蜂在其他发育阶段无法判断雌雄，本发明先获取不同地理品系的寄生蜂，利用微卫星可以区别不同株系(不同地理品系寄生蜂的微卫星条带长度不同，新疆株系与敦煌株系间不可用本发明引物区别)，两种不同株系寄生蜂交配产生的雌性后代则会出现两种微卫星条带，雄性后代则只有一种微卫星条带，为后续寄生卵性别鉴定奠定基础。构建不同的地理品系寄生蜂，才能找出区分不同品系寄生蜂的微卫星引物。进而，又由于寄生蜂的性别决定方式是单双倍型，即未受精的单倍体卵发育成雄性，受精后的二倍体卵发育为雌性。在此基础上，本发明利用微卫星技术可以鉴定寄生蜂卵的雌雄。与现有技术相比，本发明利用微卫星的特点，与寄生蜂的性别决定方式相结合，对不同地区株系的蝇蛹金小蜂进行DNA提取，随机片段化，纯化后进行末端修复，加“A”，并连接测序接头，随后用琼脂糖凝胶电泳选取350bp左右大小的片段，最后进行PCR扩增。对质控合格的文库进行上机测序得到原始数据，原始测序数据再经过质控、基因组组装以及微卫星标记筛选，获得序列位置匹配，SSR重复单元一致，但是重复数不一致SSR标记引物。设计的鉴别蝇蛹金小蜂卵性别的微卫星引物，具有PCR扩增结果稳定，多态性高等特点，有很好的应用价值。利用设计的微卫星引物，实现对蝇蛹金小蜂卵性别的鉴别。

附图说明

图1为引物对新疆、芜湖金小蜂的显示结果图，新疆金小蜂主要显示为200bp左右，芜湖金小蜂主要显示为300bp左右；

其中1—100bp；2—200bp；3—300bp；4—400bp；5—500bp；6—600bp；

图2为检测结果。

具体实施方式

实施例1

一种鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物，所述微卫星引物的核酸序列位置及重复单元等参数如下表1所示：

表1

所述鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物的设计方法：

饲养并建立家蝇繁殖株系，获得家蝇蛹，然后在不同地理位置诱集寄生蜂，通过形态鉴定，获得蝇蛹金小蜂，构建不同地理品系蝇蛹金小蜂的培养株系；对不同地区株系的蝇蛹金小蜂进行DNA提取，随机片段化，纯化后进行末端修复，加“A”，并连接测序接头，随后用琼脂糖凝胶电泳选取350bp大小的片段，最后进行PCR扩增。对质控合格的文库进行上机测序得到原始数据，原始测序数据再经过质控、基因组组装以及微卫星标记筛选，获得序列位置匹配，SSR重复单元一致，但是重复数不一致SSR标记引物，筛选出多态性丰富的微卫星引物，合成2对引物，序列如下：

AF1F：ACAGCAACCAAGTCGGCTAT，AF1R：CATGCAGAGTCGATGCAGAT；

AF2F：ACAGCAACCAAGTCGGCTAT，AF2R：ATGCTCATGCAGAGTCGATG。具体步骤为：

一、DNA提取

提取试剂盒：天根-血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)

试剂盒货号：DP304

步骤：1.将样本组织打碎处理为细胞悬浮液，然后10000rpm离心1分钟，倒尽上清，家200ul缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。

2.加入20ul Proteinase K溶液，混匀。在56度放置，直至组织溶解，简短离心以去除管盖内壁水煮，在进行下一步骤。

3.加入200ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁水珠。

4.加入200ul无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁水珠。

5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)12000rpm离心30秒。倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

6.将吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7.向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm，离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8.重复操作步骤7。

9.将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30ul的洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

二、DNA测序文库构建

建库试剂盒：VAHTSTM Universal DNA Library Prep Kit for

步骤：

1.提取的genomic DNA样品，用TE或Elution Buffer稀释。然后用Covaris对DNA进行破碎，破碎时片段大小设置为300-500bp。

2.使用试剂盒中的End Prep Mix2对打断后的DNA片段进行末端补平，并在5’端进行磷酸化，3’端加”A”尾。

2.1将End Prep Mix2解冻后颠倒混匀，于灭菌PCR管中配制如下表2反应：

表2

组分体积Input DNAX ulEnd Prep Mix215ulddH₂OTo 65ul

2.2使用移液器轻轻吹打混匀(请勿震荡混匀)，并短暂离心将反应液收集至管底。

2.3将PCR管置于PCR仪中，进行下表3反应：

表3

温度时间热盖105℃On20℃15min65℃15min4℃Hold

3.对End Preparation产物的末端连接接头。

3.1根据Input DNA量稀释Adapter至合适浓度。

3.2将Rapid Ligation buffer解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

3.3在End Preparation步骤PCR管中配制如下表4反应：

表4

组分体积End Preparation产物65ulRapid Ligation buffer25ulRapid DNA ligase5ulDNA Adapter X5ul总计100ul

3.4使用移液器轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀)，并短暂离心将反应液收集至管底。

3.5将PCR管置于PCR仪中，进行下述表5反应：

表5

温度时间热盖105℃On20℃15min4℃Hold

3.6使用VAHTS DNA Clean Beads对反应产物进行纯化：

1、磁珠平衡至室温后，涡旋振荡混匀VAHTS DNA Clean Beads。

2、吸取80μl VAHTS DNA Clean Beads至100μl Adapter Ligation产物中，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。

3、室温孵育5min。

4、将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。

5、保持PCR管始终置于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。

6、重复步骤5，总计漂洗两次。

7、保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10min至无乙醇残留。

8、将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱。

三、下机数据质控

1.使用FastQC软件对原始下机数据进行质量控制，去除含adapter、含N过多或含大量低质量碱基的reads。过滤的步骤如下：

去除含adapter的reads；

去除含N比例大于10％的reads；

去除低质量reads(质量值Q≤10的碱基数占整条read的50％以上)。

过滤后保留的数据为clean reads，用于后续的信息分析。

四、参考基因组序列组装

经过质控后的clean reads导入CLC Genomics Workbench软件，根据基因组组装操作步骤对三个样本的基因组序列分别进行组装。组装的K-mer值设置为26，其他参数默认。组装完成后，导出3个样本的组装序列。

五、SSR筛选

1.使用MISA软件对各样本的组装序列进行SSR检测。

2.使用Primer3对检测到的SSR进行引物批量设计。

3.采用MUMmer软件，对组装得到的三个金小蜂基因组序列进行两两比对，获取三个品种中共有且一一对应的基因组组装序列。

4.对这些共有且一一对应的基因组组装序列中检测到的SSR进行筛选。筛选位置关系一致，重复单元一致，但重复数不一致的SSR引物，用来区分品种。

实施例2

鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物的应用，用于鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵的性别。

实施例3

利用鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的方法，包括以下步骤：

1)在实验室内饲养并建立家蝇繁殖株系，获得家蝇蛹；使用家蝇蛹在国内三处不同地理区系(安徽芜湖、新疆乌鲁木齐和甘肃敦煌三个地区)诱集寄生蜂，通过形态鉴定，获得蝇蛹金小蜂；实验室内建立各地理品系蝇蛹金小蜂的培养株系；

2)在寄生蜂寄生家蝇蛹(寄主)15天后，利用5ml容量的冻存管，分装单个家蝇蛹，确保每只出蜂的寄生蜂是未交配状态。出蜂后的未交配寄生蜂饲养一天，将来自不同株系的雌性蝇蛹金小蜂和雄性蝇蛹金小蜂交配(比如雌性芜湖株系寄生蜂与雄性新疆株系寄生蜂或者雄性芜湖株系金小蜂与雌性新疆株系金小蜂)，并给予适量的寄主供其寄生产卵，获得具有鉴别性的寄生蜂卵；

3)采用天根生化科技有限公司的微量样品基因组DNA提取试剂盒对对步骤2)获得的有鉴别性的寄生蜂卵DNA进行提取；具体为：

A、取不超过10mg的组织到1.5ml的离心管中，立即加入180μl缓冲液GA，室温放置，使离心管温度平衡到室温。

B、加入20μl Proteinase K溶液，涡旋混匀10sec。

C、在56℃孵育直到样本充分降解消化，需要时间大约30min到1h，期间每15min需要涡旋混匀；或者置于水浴振荡仪中消化。简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。

D、加入200μl的缓冲液GB和1μl Carrier RNA储存液，浓度为1μg/μl，充分颠倒混匀，70℃放置10min，期间每3min涡旋混匀10sec，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴。

E、加入200μl的乙醇(96-100％)。如果室温超过25℃，请将乙醇置冰上预冷。轻轻颠倒混匀样品，室温放置5min，简短离心以去除管盖内壁的液滴。

F、取上一步所得溶液全部转入吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

G、向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

H、向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

I、重复操作上一个步骤12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR2置于室温放置2-5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

J、将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存。

4)以步骤3)提取的DNA为模板，利用鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物进行PCR扩增，具体为：

以提取的DNA为模板，进行PCR扩增，反应体系如下表6：

表6

反应程序：

94℃预变性5min；

94℃变性30s，筛选的温度40s，72℃延伸1min，35个循环；

72℃终延伸10min；

所得产物通过琼脂糖凝胶电泳跑条带，根据条带数来判断卵的雌雄。单条带为未受精的单倍体卵，即雄性；双条带为受精的二倍体卵，即雌性,结果如图2。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽师范大学

<120> 鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物、应用及鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的

方法

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物1上游引物

<400> 1

acagcaacca agtcggctat 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物1下游引物

<400> 2

catgcagagt cgatgcagat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物2上游引物

<400> 3

acagcaacca agtcggctat 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 鉴定蝇蛹金小蜂蜂卵性别的微卫星引物2下游引物

<400> 4

atgctcatgc agagtcgatg 20