CMYA5基因及其表达产物在喉鳞癌中的应用

摘要

本发明公开了CMYA5基因及其表达产物在喉鳞癌中的应用，CMYA5在喉鳞癌组织中呈低表达，增加CMYA5的表达可以降低喉鳞癌的细胞增殖和侵袭，本发明大大提高了喉鳞癌诊断的敏感性和特异性，同时为喉鳞癌的精准治疗提供了新的靶点。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及CMYA5基因及其表达产物在喉鳞癌中的应用，具体的涉及在喉鳞癌诊断和治疗中的应用。

背景技术

喉癌是世界上最常见的头颈肿瘤之一，约占所有肿瘤的6％。在全世界范围内，喉癌平均每年新增病例超过500,000例，每年新增死亡人数超过200,000人5年生存率在50％-70％左右。尽管近些年在手术、放疗及化疗方面的研究有大量的进展，但是喉癌病人的长期预后仍然不理想。肿瘤的局部复发、淋巴结转移和远处转移是影响喉癌病人预后的主要原因。肿瘤的恶性生物学行为需要多种特异性蛋白的激活以及失活，而这些特异性蛋白的表达和功能方面的调节就有可能会阻止肿瘤细胞的恶性生物学行为。

伴随癌变领域的深入研究和分子生物学的不断发展，至今发现在喉癌组织中有多种基因异常表达，但是其具体发病机制仍不清楚。因此从基因变化方向探索肿瘤的发生、发展机制，寻找与肿瘤发生发展相关的基因，对肿瘤的早期诊断、治疗、判断预后及相关药物的研发等方面都具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，提供一种与喉鳞癌发生发展相关的基因，通过检测该基因的表达水平实现喉鳞癌的诊断。

本发明的目的之二，提供一种喉鳞癌的治疗靶标，通过靶向于靶标实现喉鳞癌的治疗。

本发明的目的之三，提供一种筛选治疗喉鳞癌的潜在物质的方法，通过所述物质能否调节生物靶标的表达水平来判断所筛选的物质是否是治疗喉鳞癌的潜在物质。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种CMYA5基因及其表达产物的用途，用于制备早期诊断喉鳞癌的产品。

进一步，所述产品包括检测CMYA5基因及其表达产物表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括用RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或免疫测定技术检测CMYA5基因及其表达产物表达水平的试剂。

其中，用RT-PCR检测CMYA5基因及其表达产物表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增CMYA5基因的引物；用实时定量PCR检测CMYA5基因及其表达产物表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增CMYA5基因的引物；所述用原位杂交检测CMYA5基因及其表达产物表达水平的试剂包括与CMYA5基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片检测CMYA5基因及其表达产物表达水平的试剂包括与CMYA5的核酸序列杂交的探针或与CMYA5蛋白特异性结合的抗体或配体；所述用免疫测定技术检测CMYA5基因及其表达产物表达水平的试剂包括与CMYA5蛋白特异性结合的抗体和/或配体。

本发明提供了一种诊断喉鳞癌的产品，所述产品包括检测样本中CMYA5基因或其编码的蛋白表达水平的试剂。所述产品包括(但不限于)芯片、制剂、试剂盒。

进一步，所述试剂包括特异性识别CMYA5的探针或特异性扩增CMYA5的引物；或特异性结合CMYA5编码的蛋白的抗体或配体。

在本发明中，所述诊断喉鳞癌的产品可用于检测包括CMYA5在内的与喉鳞癌相关的多个基因和/或其表达产物的表达水平。多个基因联合诊断，可以增加喉鳞癌诊断的准确性。

本发明提供了一种CMYA5基因及其表达产物的用途，用于筛选治疗喉鳞癌的潜在物质。

进一步，筛选治疗喉鳞癌的潜在物质的步骤如下：

用候选物质处理表达或含有CMYA5基因或其编码的蛋白的体系；和

检测所述体系中CMYA5基因或其编码的蛋白的表达或活性；

其中，若所述候选物质可促进CMYA5基因或其编码的蛋白的表达或活性(优选显著升高，如高20％以上，较佳的高50％以上；更佳的高2倍以上)，则表明该候选物质是预防或治疗喉鳞癌的潜在物质。

本发明提供了一种筛选预防或治疗喉鳞癌的潜在物质的方法，筛选步骤为：

用候选物质处理表达或含有CMYA5基因或其编码的蛋白的体系；和

检测所述体系中CMYA5基因或其编码的蛋白的表达或活性；

其中，若所述候选物质可促进CMYA5基因或其编码的蛋白的表达或活性(优选显著升高，如高20％以上，较佳的高50％以上；更佳的高2倍以上)，则表明该候选物质是预防或治疗喉鳞癌的潜在物质。

在测试组中，将候选物质加入到表达或含有CMYA5基因或其编码的蛋白的体系中；和/或检测测试组的体系中CMYA5基因或其编码的蛋白的表达或活性，并与对照组相对比，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达或或含有CMYA5基因或其编码的蛋白的体系；如果测试组中CMYA5基因或其编码的蛋白的表达或活性高于对照组，即表明该候选物质是预防或治疗肺腺癌的潜在物质。

进一步，所述步骤还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从潜在物质中进一步选择和确定对于预防、缓解或治疗喉鳞癌有用的物质。

在本发明中，所述体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。所述候选化合物包括(但不限于)：针对CMYA5基因或其上游或下游基因设计的核酸促进物、蛋白促进剂、蛋白结合分子。

本发明提供了一种CMYA5基因及其表达产物的用途，用于制备治疗喉鳞癌的药物组合物。

进一步，所述药物组合物包括CMYA5基因、蛋白或其促进剂。所述CMYA5蛋白包括全长CMYA5蛋白、成熟的CMYA5蛋白、CMYA5的与DNA结合的结构域、或含所述结构域的CMYA5活性片段；所述促进剂包括CMYA5基因表达产物、促进型miRNA、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。

进一步，所述药物组合物包括促进CMYA5功能性表达的促进剂。

本发明提供了一种治疗喉鳞癌的药物组合物，所述药物组合物包括：CMYA5功能性表达的促进剂；和/或

药学上可接受的载体。

进一步，所述促进剂包括提高CMYA5基因或其表达产物稳定性、上调CMYA5基因或其表达产物的表达水平、增加CMYA5基因或其表达产物有效作用时间的物质。

所述药学上可接受的载体，包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

附图说明

图1是利用QPCR检测CMYA5基因在喉鳞癌组织中的表达情况图；

图2是利用Western blot检测CMYA5蛋白在喉鳞癌组织中的表达情况图；

图3是CMYA5在喉鳞癌细胞中的转染情况图；其中，图A是利用QPCR检测转染对喉鳞癌细胞中CMYA5mRNA表达的影响图；图B是利用Western blot检测转染对喉鳞癌细胞中CMYA5蛋白的影响图；

图4是用MTT法检测CMYA5基因对喉鳞癌细胞增殖的影响图；

图5是利用细胞划痕实验检测CMYA5对喉鳞癌细胞迁移的影响图；

图6是利用Transwell小室检测CMYA5对喉鳞癌细胞侵袭的影响图。

具体的实施方式

本发明通过高通量测序技术，首次发现了喉鳞癌中CMYA5显著性下调。实验证明，通过增加CMYA5的表达水平，能够有效地抑制喉鳞癌细胞的生长、侵袭，提示CMYA5基因可用于喉鳞癌的临床诊断和治疗。

CMYA5基因

CMYA5是位于人5号染色体长臂3区3带上，本发明中的CMYA5包括野生型、突变型或其片段。一种代表性的CMYA5基因序列如目前国际公共核酸数据库GeneBank中CMYA5基因(NC_000005.10)所示。

本发明的人CMYA5核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

诊断产品

在本发明中，诊断喉鳞癌的产品可以是任何形式，包括(但不限于)芯片、制剂、试剂盒，只要其能够检测CMYA5基因或其表达产物的表达水平即可。

本发明中的芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于CMYA5所示的部分或全部序列。

具体地，可根据本发明所述的基因，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明中所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如包括但不限于塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

所述的CMYA5芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测CMYA5的表达。优选的，所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。

促进剂和药物组合物

基于发明人的发现，本发明提供了一种所述CMYA5促进剂，所述促进剂包括提高CMYA5基因或其表达产物稳定性、上调CMYA5基因或其表达产物的表达水平、增加CMYA5基因或其表达产物有效作用时间的物质。所述促进剂可以是CMYA5基因表达产物、促进型miRNA、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。

在本发明中，是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的所述的CMYA5的促进剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于治疗喉鳞癌。任何前述的CMYA5的促进剂均可用于组合物的制备。本发明的药物组合物可以用于补充内源性的CMYA5蛋白的缺失或不足，通过提高CMYA5基因或蛋白的表达，从而治疗因CMYA5减少导致的喉鳞癌。

所述药学上可接受的载体，包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

其中，稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

本发明中的药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂等添加剂。

其中，稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。添加剂缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。

本发明所述药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。

本发明的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方式包括将含有CMYA5基因的药物或者含有CMYA5蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植或回输到体内。体内方式包括直接将含有CMYA5基因的药物或者含有CMYA5蛋白质的药物注入体内组织中。

在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

本发明的药物组合物还可以与其他治疗喉鳞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。

本发明中，术语“样本”以其最广泛的含义使用。意在包括从任何来源获得的标本或培养物，以及生物和环境样本。生物样本可获自动物(包括人)并涵盖液体、固体、组织和气体。生物样本包括血液制品，诸如血浆、血清等。然而，此类样本不应解释为限制适用于本发明的样本类型。

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，癌组织与正常癌旁粘膜组织的配对比较采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与喉鳞癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集6例喉鳞癌组织及对应的正常黏膜组织样本，组织样本的取得获得患者的知情同意，并且取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备

1)加入液氮研磨组织至粉末，加入1ml TRIzol(Invitrogen)溶液，吹打混匀，使组织充分裂解，静置5min；

2)12000rpm 4℃离心5min，将上清液转移至1.5ml RNase free EP管中；

3)加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置15min；

4)4℃环境中12000g离15min，溶液离心为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；

5)加入0.5ml异丙醇，轻柔充分混匀，室温静置10min；

6)4℃下，12000g离心10min，加入与RNAiso Plus等体积的75％乙醇沉淀RNA，7500g 4℃离心5min，去上清；

7)用75％乙醇洗涤两次，超净台风干；加入30μl DEPC水溶解沉淀。

8)RNA样品的质量分析

利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间。

3、去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。

4、构建cDNA文库

利用利用Illumina的Truseq RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

5、上机测序

使用Hiseq4000测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

6、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位，通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，利用cuffdiff检测差异表达，当p值<0.001，|log2(Fold_change)normalized|>2时，认为mRNA显著差异表达。

7、结果

RNA-seq结果显示，在喉鳞癌患者中差异表达的基因有665个，上调的450个，下调的215个，其中基因CMYA5在喉鳞癌组织中的表达量显著低于正常癌旁黏膜组织中的表达量。

实施例2QPCR测序验证CMYA5基因的差异表达

1、对CMYA5基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择喉鳞癌患者正常癌旁粘膜组织和喉鳞癌组织各50例。

2、RNA提取具体步骤如实施例1所述。

3、逆转录

3、逆转录：采用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行mRNA反转录。具体步骤如下：

(1)加入5×gDNA Buffer 2.0μl，总RNA1μg，加Rnase Free ddH₂O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min；

(2)构建20μl反应体系，10×Fast RT Buffer 2.0μL，RT Enzyme Mix 1.0μl，FQ-RT Primer Mix 2.0μl，RNase Free ddH₂O>

(3)水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，-20℃储存备用。

4、QPCR扩增

(1)引物设计

根据Genebank中CMYA5基因和管家基因GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德公司合成。

CMYA5基因的引物序列：

正向引物序列为5’-CAATCGCTCCTCCATCTAA-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物序列为5’-GGCACCTTATCTACTACATCA-3’(SEQ ID NO.2)。

GAPDH基因的引物序列：

正向引物序列为5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物序列为5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’(SEQ ID NO.4)。

(2)PCR反应体系：正向引物和反向引物各0.6μl，2×SuperReal PreMix Plus 10μl，DNA模板2μl，ddH₂O>△2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。

(3)PCR反应条件：95℃15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s。在ABI 7300型荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、结果

结果如图1所示，与喉鳞癌正常癌旁粘膜组织相比，CMYA5在喉鳞癌组织中表达下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同高通量测序结果一致。

实施例3蛋白免疫印记实验检测CMYA5蛋白的差异表达

1、组织总蛋白的提取

用剪刀剪碎组织后将其放入置于冰内的玻璃匀浆器内，RIPA裂解液和PMSF以100:1的比例混匀，按照每20mg组织标本加入100μl裂解液的比例加入相应量的RIPA裂解液，玻璃匀浆器碾碎组织直至其充分裂解，将裂解后的液体吸至EP管中，4℃下14000rpm离心5min，收集上清。

2、总蛋白浓度测定

按照BCA蛋白浓度测定试剂盒的说明书进行蛋白浓度的测定。

3、SDS-PAGE电泳

按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒的说明书配制8％的分离胶和5％的浓缩胶并进行电泳。

4、western检测

1)电转移

将PVDF膜放入甲醇溶液中激活5min，放入转膜缓冲液中平衡20min。取出PAGE胶放入转膜缓冲液中，切下相应的PAGE胶，按照由下到上依次为滤纸、PVDF膜、PAGE胶、滤纸的顺序放到半干的转膜仪中，恒压25V转膜1.5h；

2)免疫杂交

取出PVDF膜，PBS冲洗后置于5％BSA溶液中室温下摇动封闭2h，将PVDF膜放入杂交袋中，加入一抗过夜，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜，再加入相应的二抗，室温下孵育2h，TBST缓冲液洗涤。

3)DAB显色

PVDF膜稍干后滴加新鲜配制的DAB显色液，PVDF膜显色后扫描记录。以β-actin作为内参照，采用Quantity One凝胶成像分析系统对条带进行半定量灰度分析，实验重复3次，结果取平均灰度值；

5、结果

结果如图2所示，CMYA5蛋白在喉鳞癌组织中的表达水平显著低于正常癌旁粘膜组织。

实施例4 CMYA5基因的过表达

1、细胞培养

人喉鳞癌细胞株Hep2，以含10％胎牛血清和1％P/S的RPMI1640培养基在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，细胞生长良好，呈单层贴壁生长。使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、转染

1)转染前细胞的处理

转染前一天，6孔培养板上种3～5×10⁵个细胞/孔，在无抗生素培养基中培养一天，转染时细胞密度为30～50％，于转染前换成无血清培养基。

2)基因过表达载体的构建

根据GeneBank中CMYA5的序列合成特异的PCR扩增引物，引物序列如下：

正向引物：5’-CCGGGTACCGCCACCATGGCGAGCCGCGATAGCA-3’(SEQ ID NO.5)

反向引物：5’-CGGCTCGAGCTTGTGCCTTACAGAATCCGGGGGCTC-3’(SEQ ID NO.6)

在5’端引物和3’端引物分别添加KpnI和XhoI两个限制性酶切位点。以肺腺癌患者组织提取和反转录得到的cDNA作为扩增模板，上述cDNA序列经限制性内切酶KpnI和XhoI双酶切后插入到经KpnI和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-1用于后续实验。

将实验分为三组：对照组(Hep2)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1、siRNA2)，其中阴性对照组siRNA与CMYA5基因的序列无同源性。

3)转染

将肺腺癌细胞分为3组，分别为对照组(A549)、空白对照组(转染pcDNA3.1-NC)、实验组(转染pcDNA3.1-1)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-1的转染浓度均为0.5μg/ml。

3、QPCR检测CMYA5基因的表达水平

1)细胞总RNA的提取

采用Qiagen的细胞RNA提取试剂盒对细胞中的RNA进行提取，实验操作按照说明书进行。

2)逆转录步骤同实施例2。

3)QPCR扩增步骤同实施例2。

4、Western blot检测CMYA5蛋白的表达水平

1)细胞总蛋白的提取

收集处于对数期的不同处理组的细胞，用预冷的PBS洗涤细胞。将RIPA细胞裂解液和PMSF以100:1的比例混匀，向细胞中加入上述裂解液150μl，冰上放置30min，使用细胞刮刀将裂解的细胞刮下来，使用移液器将裂解后的液体吸至EP管中，4℃下14000rpm离心5min。小心收集离心后的上清。

2)总蛋白浓度的测定

按照BCA蛋白浓度测定试剂盒的说明书进行蛋白浓度的测定。

3)SDS-PAGE电泳

按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒的说明书配制8％的分离胶和5％的浓缩胶并进行电泳。

4)Western检测

步骤详见实施例3。

5、结果

结果如图3所示，与非转染组与转染空白质粒组相比，转染CMYA5组中的CMYA5过表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例5 CMYA5基因对喉鳞癌细胞增殖的影响

采用MTT实验检测CMYA5基因对喉鳞癌细胞增殖能力影响。

1、取生长状况良好的细胞，常规消化成单细胞悬液后，计数细胞，将细胞稀释成合适浓度的细胞悬液；

2、于96孔培养板中，将稀释后的不同处理组细胞每孔接种2000细胞，至少设3个平行孔，37℃、5％CO₂培养24h；

3、于接种后1、2、3、4、5天每天取出3孔细胞以MTT法检测其490nm的OD值，进行计数，计算平均值；

4、检测前弃去上清液，培养液洗3次，每孔加入MTT无血清培养基溶液(0.2mg/ml)100μl，37℃培养箱中继续培养4h；

5、终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150μl DMSO，震荡10min，使结晶物充分溶解，在酶标仪上用波长为490nm测定光密度(OD)值，以时间为横轴，光密度值为纵轴绘制细胞生长曲线。

6、结果

结果如图4所示，与对照相比，实验组细胞的增殖明显受到了抑制，差异具有统计学意义(P<0.05)说明CMYA5过表达具有抑制癌细胞增殖的作用。

实施例7 CMYA5基因对喉鳞癌细胞凋亡的影响

使用流式细胞仪检测CMYA5基因对细胞凋亡的影响。

1、细胞培养 步骤同实施例3。

2、细胞转染 步骤同实施例3。

3、步骤

1)将处于对数生长期的不同处理组的细胞经胰酶消化后吹打成细胞悬液并计数。取10⁶量的细胞悬液，1000rpm离心5min；

2)弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞；

3)加入5μl的Annexin V-FITC，轻柔混匀，室温下避光孵育10min；

4)1000rpm离心5min，弃上清，加入190μl的Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞；

5)加入10μl碘化丙啶(PI)染色液，轻柔混匀，冰浴避光放置，进行流式细胞仪检测细胞凋亡情况，所有实验均重复3次，结果取平均值。

4、结果：

结果显示，实验组与对照组相比，细胞的凋亡率无明显变化，说明CMYA5对喉鳞癌细胞的凋亡影响不大。

实施例8细胞划痕实验

1、向6孔板中每孔加入1ml 50μg/ml的纤连蛋白，并置于4℃冰箱中过夜；

2、弃去剩余的纤连蛋白溶液，用无血清培养基清洗，将处于对数生长期的不同处理组细胞经胰酶消化重悬后，接种于铺有纤连蛋白的6孔板中，每组细胞设2个复孔，每孔5×10⁵个细胞；

3、置入37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜；

4、待细胞长至约90％融合时，用10μl的Tip头划出一条无细胞的细痕，PBS溶液洗去脱落的细胞，加入无血清培养基继续培养；

5、分别于划痕后0h、48h观察细胞划痕处的愈合情况并拍照。实验重复3次，结果取平均值。

6、结果

结果如图5所示，实验组相比对照组而言，细胞体外划痕后的迁移距离明显降低，而对照组之间无显著差异，说明CMYA5过表达可以抑制喉癌细胞的迁移。

实施例9细胞侵袭实验

1、Transwell小室制备

将50mg/L的Matrigel胶用4℃预冷的无血清培养基以1:8的比例稀释、混匀，包被Transwell小室的底部膜的上室面，4℃风干。取60μl～80μl稀释的Matrigel胶(3.9μg/μl)置于孔径为8μm的Transwell上室的聚碳酸脂膜上，使膜上的所有的微孔均被Matrigel覆盖，置于37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

2、配置细胞悬液

将处于对数生长期的不同处理组的细胞经胰酶消化，无血清培养基重悬后，调整细胞浓度为5×10⁴个/ml。

3、细胞接种

在Transwell上室加入2ml的细胞悬液，下室加入1ml的含10％胎牛血清的完全培养基，放置于配套的6孔板上，37℃、5％CO₂条件下培养20-24h；取出Transwell小室，棉签擦尽上室面的Matrigel胶和未穿透膜的细胞。

4、染色

细胞培养结束后，取出Transwell小室，棉签擦尽上室面的Matrigel胶和未穿透膜的细胞，下室面用95％酒精固定15min后，苏木素染色2min，倒置显微镜下随机取5个高倍镜视野观察、计数并拍照。计数小室下室面的细胞数即为穿透Matrigel胶的细胞数，取平均数作为实验结果，并以该细胞数代表肿瘤细胞的侵袭力，实验重复3次，每组细胞设3个复孔。

5、结果

结果如图6所示，与对照组相比，实验组的细胞穿过Transwell小室聚碳酸酯膜的细胞数明显减少，而对照组之间无明显差异，结果说明CMYA5过表达可以降低喉鳞癌的侵袭。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> CMYA5基因及其表达产物在喉鳞癌中的应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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