同时检测婴幼儿米粉中多种维生素或维生素衍生物的方法

摘要

本发明公开了一种可以同时检测婴幼儿米粉中多种维生素或维生素衍生物的方法。所述维生素为维生素B

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测婴幼儿米粉中维生素或维生素衍生物的方法，具体涉及一种同时检测婴幼儿米粉中多种维生素或维生素衍生物的方法。属于食品营养检测领域。

背景技术

维生素可分为脂溶性维生素和水溶性维生素两大类，前者包括维生素A、D、E、K，后者包括维生素B族和维生素C。它们是生物体所需要的微量营养成分，而一般又无法由生物体自己生产，需要通过饮食等手段获得。正常人每日需要摄入维生素A 2500～3000国际单位，维生素D 300～400国际单位。机体如果缺乏维生素，就会出现免疫力下降，容易患病。

6月龄以上的婴幼儿建议添加婴幼儿米粉，婴幼儿米粉在我国具有很大的市场需求。国家质检总局2012年第三季度抽查结果表明，婴幼儿米粉产品抽样合格率仅为54.2％，集中的问题表现在没有添加营养强化剂或营养强化剂不足。其中维生素是婴幼儿米粉中必不可少的营养成分。在婴幼儿米粉种类繁多、质量参差不齐的今天如何能快速、准确地测定婴幼儿米粉中维生素的含量显得尤为重要。但是采用现有方法测定婴幼儿米粉中维生素的含量的时候，存在前处理操作繁琐，检测周期长，试剂消耗量大，且不能同时检测多种维生素的问题。

超临界流体萃取(Supercritical Fluid Extraction，SFE)是一种物理分离和纯化的方法，利用压力和温度对超临界流体CO₂(scCO₂)的溶解能力的影响而进行的，由于scCO₂具有类似气体的扩散系数和液体的溶解力，表面张力为零，能迅速渗透进固体物质之中进行萃取，且具有高效、不易氧化、纯天然、无化学污染等特点而在众多领域有所应用。超临界流体色谱>

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种前处理简单、快速、准确、环保并且可同时测定婴幼儿米粉中多种维生素或维生素衍生物的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种同时检测婴幼儿米粉中多种维生素或维生素衍生物的方法，是以无水硫酸钠为分散剂，采用超临界流体萃取-超临界流体色谱-质谱(SFC-SFE-MS)联用的检测方法。所述维生素为维生素B₃，维生素D₂，维生素D₃，维生素E，维生素K₁，维生素K₂。其中，维生素>3为水溶性维生素，其余均为脂溶性维生素。所述维生素衍生物为维生素A乙酸酯(维A乙酸酯)。此方法可以同时检测婴幼儿米粉中维生素A乙酸酯、维生素D₂和维生素E。包括以下步骤：

(1)标准工作曲线的建立：取维生素或维生素衍生物标准品，以异丙醇为溶剂，配制成含维A乙酸酯、维生素D₂、维生素D₃、维生素E、维生素K₁、维生素K₂、维生素B₃浓度分别为232.5、242.5、260、255、262.5、240、265mg/L的混合标准溶液。称取一定质量的无水硫酸钠作为分散剂放入样品舟中，在分散剂表面分别加入体积为2μL、4μL、20μL、40>

(2)实际样品检测：称取一定质量的无水硫酸钠作为分散剂放入样品舟中，加入相应质量为m的市售婴幼儿米粉混匀，装入体积为5mL的萃取罐中，使用SFE-SFC-MS进行分析。根据SFC和MS可以测定样品中所含的维生素或维生素衍生物的种类，根据SFC峰面积并按照(1)中的标准曲线可以得到所测样品中维生素或维生素衍生物的质量m₁。根据公式x＝m₁/m计算得到所测样品中的维生素或维生素衍生物的含量x(mg/kg)。

优选的，步骤(1)和步骤(2)中，无水硫酸钠的质量均为5g。如果质量少于5g，会造成CO₂的湍流，多于5g，则会使萃取罐密封不严，都会造成萃取效率降低，检测结果不准确。

进一步优选的，步骤(2)中，实际样品的取样量优选为0.05g～1g，即无水硫酸钠和市售婴幼儿米粉的质量比为5：0.05～1，取样量过小将无法保证取样的代表性，取样量过大将导致明显的基质效应。

更进一步优选的，实际样品取样量为0.2g，即无水硫酸钠和市售婴幼儿米粉的质量比为 5：0.2。

优选的，步骤(1)中，溶解维A乙酸酯、维生素D₂、维生素D₃、维生素E、维生素>1、维生素K₂标准品的溶剂为正己烷，溶解维生素B₃标准品的溶剂为纯水。

优选的，步骤(1)和步骤(2)中SFE-SFC-MS的分析条件如下：

SFE萃取条件：

萃取剂：scCO₂；夹带剂：甲醇；夹带剂体积浓度：5％；

填充剂：A-scCO₂，B-甲醇；填充剂比例：A/B＝85/15(v/v)；

萃取流速：3mL/min；萃取方式：静态萃取3分钟+动态萃取2分钟，循环3次；

萃取温度：40℃；萃取背压：A-14.8MPa，B-15MPa

SFC色谱条件：

色谱柱：GL Science CN-3(4.6mm I.D.×250mm L.,3μm)；

流动相：A-scCO₂，B-甲醇；流动相流速：3mL/min；

柱温：40℃；背压：A-15MPa，B-40MPa；

洗脱方式：17-24分钟，5％B；24-27分钟，10％B；27-32分钟，50％B

*17分钟之前为填充和SFE萃取过程

质谱(MS)条件：质谱补偿液：甲醇；补偿液流速：0.2mL/min。

目标分析物的质谱参数见表1：

表1维生素质谱参数

*表示定量离子

本发明的有益效果：

(1)本发明利用SFE-SFC-MS系统，建立了婴幼儿米粉中多种维生素或维生素衍生物的检测方法。该方法准确度高、重复性好，可以满足定性、定量检测维生素或维生素衍生物的要求。

(2)本发明中的检测方法将原本需要多种前处理和分析手段才能分析的多种维生素和维生素衍生物实现了同时分析，且可以同时检测脂溶性和水溶性维生素。与现有技术相比，本方法具有前处理简单、高效快速、低耗环保、自动化程度高等优点。

(3)本发明中的检测方法中加入无水硫酸钠作为分散剂有效地解决了样品易堵塞萃取管路的问题，对于提高设备和原材料的利用率起到了重要作用。

(4)无水硫酸钠与样品的质量比优选为5：0.05～1，可以有效避免CO₂湍流的产生，使萃取效率更高。

附图说明

图1a是维生素或维生素衍生物混合标准品经SFE-SFC-MS系统检测的色谱图；图1b是维生素或维生素衍生物混合标准品经SFE-SFC-MS系统检测的色谱图的局部放大图；

图2a是优选萃取条件下维A乙酸酯标准品连续四次萃取的色谱图；图2b是优选萃取条件下维生素B₃标准品连续四次萃取的色谱图；图2c是优选萃取条件下维生素D₂标准品连续四次萃取的色谱图；

图3a是市售某品牌婴幼儿米粉中维A乙酸酯的色谱图；图3b是市售某品牌婴幼儿米粉中维生素D₂的色谱图；图3c是市售某品牌婴幼儿米粉中维生素E的色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例：

(1)标准工作曲线的建立

精密称定维A乙酸酯、维生素D₂、维生素D₃、维生素E、维生素K₁、维生素K₂标准品9.3、9.7、10.4、10.2、10.5、9.6mg，用正已烷定容到1mL，配制维A乙酸酯、维生素D₂、维生素D₃、维生素E、维生素K₁，维生素K₂浓度分别为9300、9700、10400、10200、10500、>3标准品10.6mg，用纯水定容到1mL，配制维生素B₃浓度为10600mg/L的单一标准溶液。分别准确移取以上7种单一标准溶液各1mL，用异丙醇定容到10mL，配制维A乙酸酯、维生素D₂、维生素D₃、维生素E、维生素K₁、维生素K₂、维生素B₃浓度分别为930、970、1040、1020、1050、960、1060mg/L的初始混合标准溶液。再移取上述初始混合标准溶液2.5mL，用异丙醇定容到10mL，配制维A乙酸酯、维生素D₂、维生素D₃、维生素E、维生素K₁、维生素K₂、维生素B₃浓度分别为232.5、>

SFE-SFC-MS系统的配置为：LC-30ADSF(CO₂输液泵)，LC-20AD_XR(输液泵，含LPGE>5(在线脱气机)，SFE-30A(超临界流体萃取单元)，SIL-30AC(自动进样器，5μL定量环)，CTO-20AC(柱温箱)，SFC-30A×2>

SFE萃取条件：

萃取剂：scCO₂；夹带剂：甲醇；夹带剂体积浓度：5％；

填充剂：A-scCO₂，B-甲醇；填充剂比例：A/B＝85/15(v/v)；

萃取流速：3mL/min；萃取方式：静态萃取3分钟+动态萃取2分钟，循环3次；

萃取温度：40℃；萃取背压：A-14.8MPa，B-15MPa

SFC色谱条件：

色谱柱：GL Science CN-3(4.6mm I.D.×250mm L.,3μm)；

流动相：A-scCO₂，B-甲醇；流动相流速：3mL/min；

柱温：40℃；背压：A-15MPa，B-40MPa；

洗脱方式：17-24分钟，5％B；24-27分钟，10％B；27-32分钟，50％B

*17分钟之前为填充和SFE萃取过程

质谱条件：质谱补偿液：甲醇；补偿液流速：0.2mL/min。

(2)线性关系考察

对上述标准工作曲线进行线性回归，结果见表2。结果表明各标准品在各自的质量范围内线性关系良好，证明本发明方法在所选线性范围内准确度高。

表2标准工作曲线及相关系数

序号名称线性范围(μg)线性方程相关系数准确度(％)1维A乙酸酯0.465-18.6Y＝473334X-1149980.997492.6-113.22维生素B₃0.485-19.4Y＝9684000X-22850000.995594.6-102.03维生素D₂0.520-20.8Y＝16893900X-7650140.995692.7-108.94维生素D₃0.510-20.4Y＝0.159397X-0.005754470.998490.8-111.95维生素E0.525-21.0Y＝25640000X-148500000.993590.9-118.06维生素K₁0.480-19.2Y＝22900000X+229700000.995196.3-111.17维生素K₂0.530-21.2Y＝21080000X+115800000.998391.2-116.8

(3)本实施例萃取条件下维生素或维生素衍生物标准品的萃取效率

称取5g无水硫酸钠作为分散剂，在分散剂表面加入维生素或维生素衍生物混合标准溶液80μL，待溶剂自然挥干后，将分散剂与维生素或维生素衍生物混合标准品搅拌均匀，加入萃取罐中，重复对同一萃取罐的混合标准品进行连续四次SFE-SFC-MS系统分析，检测条件如本实施例步骤(1)中所述。以每次萃取维生素或维生素衍生物标准品的峰面积对多次萃取峰面积之和做比，计算萃取效率，维生素或维生素衍生物标准品在此萃取条件下的首次萃取效率在82.13～100.00％之间，见表3。本实施例萃取条件下维A乙酸酯、维生素B₃和维生素D₂标准品连续四次萃取的色谱图见图2a～图2c。

表3 维生素或维生素衍生物标准品的萃取效率(％)

序号名称第一次第二次第三次第四次1维A乙酸酯100.00------2维生素B₃82.138.346.193.343维生素D₂99.170.640.20--4维生素D₃98.740.800.310.155维生素E99.600.280.090.046维生素K₁99.040.690.200.077维生素K₂98.870.820.230.08

(4)重复性考察：称取5g无水硫酸钠作为分散剂放入样品舟中，在分散剂表面加入维生素或维生素衍生物混合标准溶液33μL，待溶剂自然挥干后，将分散剂与维生素或维生素衍生物混合标准品搅拌均匀，加入萃取罐中，按照本实施例步骤(1)中所述的分析条件，使用 SFE-SFC-MS系统进行分析。平行制备六份样品，连续进样，考察SFE-SFC-MS分析系统的重复性。结果如表4所示，保留时间和峰面积的相对标准偏差在0.08～0.79％和7.33～11.50％之间。表明SFE-SFC-MS分析系统具有良好的重复性。

表4保留时间和峰面积重复性(n＝6)

(5)加标回收率考察：

①糯米粉基质加标回收率考察：称取5g无水硫酸钠作为分散剂放入样品舟中，加入已测定的不含待测维生素和维生素衍生物的市售糯米粉0.2g，再加入维生素或维生素衍生物混合标准溶液80μL，待溶剂自然挥干后，将分散剂、糯米粉与维生素或维生素衍生物混合标准品搅拌均匀，再加入萃取罐中，按照本实施例步骤(1)中所述的分析条件，使用SFE-SFC-MS 系统进行分析。平行制备六份样品进行连续测试，计算平均加标回收率和相对标准偏差，结果见表5。结果显示维生素或维生素衍生物的平均加标回收率在74.12％～107.79％之间，相对标准偏差在4.93％～10.74％，能够满足样品定量分析的要求。

表5糯米粉加标回收率(n＝6)

②婴幼儿米粉基质加标回收率考察：称取5g无水硫酸钠作为分散剂放入样品舟中，加入已测定的市售婴幼儿米粉0.2g，再加入维生素或维生素衍生物混合标准溶液20μL，待溶剂自然挥干后，将分散剂、婴幼儿米粉和与维生素或维生素衍生物混合标准品搅拌均匀，再加入萃取罐中，按照本实施例步骤(1)中所述的分析条件，使用SFE-SFC-MS系统进行分析。平行制备六份样品进行连续测试，扣除样品中维生素或维生素衍生物的实际含量(n＝4)，计算平均加标回收率和相对标准偏差，结果见表6。结果显示维生素或维生素衍生物的平均加标回收率在62.92％～114.19％之间，相对标准偏差6.59％～10.03％，能够满足样品定量分析的要求。

表6婴幼儿米粉加标回收率

(6)实际样品检测：称取5g无水硫酸钠作为分散剂放入样品舟中，加入质量(m)为0.2g的市售婴幼儿米粉混匀，装入萃取罐，按照本实施例步骤(1)中所述的分析条件，使用SFE-SFC-MS系统进行分析。平行制备4份样品进行连续测试。检测出此婴幼儿米粉中含有维A乙酸酯、维生素D₂和维生素E，由峰面积根据标准工作曲线得到质量m₁，根据公式>1/m计算得到此婴幼儿米粉中维A乙酸酯、维生素D₂和维生素E的质量含量分别为：28.55>2和维生素E>

对比例1：称取5g无水硫酸钠作为分散剂，在分散剂表面加入维生素或维生素衍生物混合标准溶液80μL，待溶剂自然挥干后，将分散剂与维生素或维生素衍生物混合标准品搅拌均匀，加入萃取罐中，重复对同一萃取罐的混合标准品进行连续四次SFE-SFC-MS分析。以每次萃取维生素或维生素衍生物标准品的峰面积对多次萃取峰面积之和做比，计算萃取效率。填充剂中超临界流体二氧化碳和甲醇的体积比选择85：15，萃取剂中夹带剂的体积浓度选择 15％，萃取方式为：静态萃取3分钟+动态萃取2分钟，重复3次，其他检测条件如实施例步骤(1)中所述。此对比例条件下得到的维生素或维生素衍生物标准品的萃取效率见表7。

表7对比例1条件下维生素或维生素衍生物标准品的萃取效率(％)

序号名称第一次第二次第三次第四次1维A乙酸酯87.007.272.663.082维生素B₃18.1737.8225.7618.253维生素D₂96.622.860.300.234维生素D₃97.072.100.82--5维生素E95.204.190.61--6维生素K₁85.6511.432.92--7维生素K₂98.411.040.54--

对比例2：称取5g无水硫酸钠作为分散剂，在分散剂表面加入维生素或维生素衍生物混合标准溶液80μL，待溶剂自然挥干后，将分散剂与维生素或维生素衍生物混合标准品搅拌均匀，加入萃取罐中，重复对同一萃取罐的混合标准品进行连续四次SFE-SFC-MS分析。以每次萃取维生素或维生素衍生物标准品的峰面积对多次萃取峰面积之和做比，计算萃取效率。填充剂中超临界流体二氧化碳和甲醇的体积比选择70：30，萃取剂中夹带剂的体积浓度为 30％，萃取方式为：静态萃取3分钟+动态萃取2分钟，重复3次，其他检测条件如实施例步骤(1)中所述。此对比例条件下得到的维生素或维生素衍生物标准品的萃取效率见表8。

表8对比例2条件下维生素或维生素衍生物标准品的萃取效率(％)

序号名称第一次第二次第三次第四次1维A乙酸酯71.8716.206.835.102维生素B₃46.6036.1012.464.843维生素D₂--------4维生素D₃--------5维生素E91.482.983.132.426维生素K₁--------7维生素K₂78.1512.225.604.03

对比例3：称取5g无水硫酸钠作为分散剂，在分散剂表面加入维生素或维生素衍生物混合标准溶液80μL，待溶剂自然挥干后，将分散剂与维生素或维生素衍生物混合标准品搅拌均匀，加入萃取罐中，重复对同一萃取罐的混合标准品进行多次SFE-SFC-MS系统分析。以每次萃取维生素或维生素衍生物标准品的峰面积对多次萃取峰面积之和做比，计算萃取效率。填充剂中超临界流体二氧化碳和甲醇的体积比选择85：15，萃取剂中夹带剂的体积浓度选择 5％，萃取方式为：静态萃取3分钟+动态萃取2分钟，重复1次，其他检测条件如实施例步骤(1)中所述。此对比例条件下得到的维生素或维生素衍生物标准品的萃取效率见表9。

表9对比例3条件下维生素或维生素衍生物标准品的萃取效率(％)

序号名称第一次第二次第三次第四次1维A乙酸酯89.069.870.730.342维生素B₃59.1127.898.634.373维生素D₂86.7112.530.590.174维生素D₃87.3212.000.560.125维生素E93.506.450.040.016维生素K₁90.648.740.490.137维生素K₂87.3311.800.670.20

试验例：以维生素或维生素衍生物的首次萃取效率为优化目标，分析实施例、对比例1、对比例2和对比例3的检测结果，见表10。

表10不同萃取条件下维生素或维生素衍生物的首次萃取效率对比

序号名称实施例对比例1对比例2对比例31维A乙酸酯100.0087.0071.8789.062维生素B₃82.1318.1746.6059.113维生素D₂99.1796.62--86.714维生素D₃98.7497.07--87.325维生素E99.6095.2091.4893.506维生素K₁99.0485.65--90.647维生素K₂98.8798.4178.1587.33

由表10可以看出，对比例1中水溶性维生素B₃的首次萃取效率最低。对比例2中虽然维生素B₃的首次萃取效率较对比例1有所提高，但是由于夹带剂体积浓度过高导致极性杂质共萃取，使得脂溶性维生素D₂、维生素D₃和维生素K₁谱图杂乱，无法积分。对比例3中维生素B₃的首次萃取效率相对于对比例1和对比例2有所提高，但相对于实施例，萃取效率仍然较低，并且维A乙酸酯、维生素D₂、维生素D₃、维生素E、维生素K₁和维生素K₂的首次萃取效率均低于实施例。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。