一种基于分子印迹固相萃取‑气/质谱联用技术的检测食用油中24种多环芳烃的方法

摘要

本发明提供一种基于分子印迹固相萃取‑气/质谱联用技术的检测食用油中24种多环芳烃的方法，包括以下步骤：(1)配制成1.0mg/L的标准使用液，同位素内标标准使用液，定容至1.0mg/L；(2)前处理：准确称取食用油0.50g在10mL具塞试管内，先加入混合内标使用液20μl，再加3mL正己烷，涡旋混匀，待净化，分别用5mL正己烷和5mL二氯甲烷活化高分子印迹固相萃取小柱，之后，稀释油样加入到小柱上，6mL正己烷分两次淋洗小柱后弃去，用10mL的二氯甲烷、乙酸乙酯1∶1的混合液洗脱，收集洗脱液，氮气吹至近干，加入0.3mL正己烷溶解，进行GC/MS分析；本发明的有益效果是精密度和准确度良好，满足限量值要求。

说明书

技术领域

本发明属于多环芳烃检测技术领域，尤其是涉及一种基于分子印迹固相萃取-气/质谱联用技术的检测食用油中24种多环芳烃的方法。

背景技术

多环芳烃(PAHs)是指2个或2个以上苯环以稠环形式相连的一类化合物，有4个或少于4个苯环的属轻质多环芳烃，多于4个苯环的属重质多环芳烃。它作为持久性有机污染物(POPs)的重要一种在自然界广泛存在。此类物质一般具有亲脂性，易溶于甲苯、正己烷、乙酸乙酯等有机溶剂。PAHs主要是由煤、石油、木材等有机化合物的热解和不完全燃烧而产生的一类化合物，其对人体具有多方面的危害，大量研究表明多数PAHs具有慢性毒性和不同程度的致癌、致畸、致突变的“三致作用”，如苯并(a)芘、苯并(a)蒽、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、二苯并(a，h)蒽。尤其是致癌作用，其中苯并(a)芘的危害最大且最为明确。同时研究表明，PAHs的致癌特性会随着苯环数的增加而明显增强。2005年10月，国际癌症研究机构(IARC)研究了具有潜在致癌性的60多种PAHs，在人们比较关注的项目中，确定苯并(a)芘对人类是致癌物(组1)，3种对人类很可能是致癌物(组2A)，10种对人类可能是致癌物(组2B)，另外9种的致癌性尚不明确(组3)(见表1)。

目前，世界各国对于PAHs监测都制定了相应的标准和法律法规，以此来控制PAHs的危害。1980年美国环保总署(US-EPA)明确了16种PAHs作为优先监测的有机污染物(称为16EPA PAHs)，国内外大多数检测标准大多以16EPA PAHs为检测对象。进入21世纪以来，全球多家机构对多环芳烃重新进行风险评估，欧洲食品安全局(EFSA)整合了相关机构的评估结果，提出16种在实验动物体细胞内具有明显致突变性和基因毒性的多环芳烃，并在法规2005/108/(EC)中明确规定(称为16EU PAHs)。16EU PAHs剔除了16EPA PAHs中8种2-4环毒性较小的轻质多环芳烃，引入8种4-6环毒性较大的重质多环芳烃。

研究表明，对于不吸烟的非职业暴露人群，饮食接触PAHs是人体日暴露PAHs的主要途径，约占人体日暴露PAHs的70％以上，而从食用油中的摄入量占食物中摄人量的1/3。食用油中PAHs来源主要有以下几个途径：①PAHs可在油料干燥过程中同燃烧不完全或热解燃气直接接触而产生，并向食用油迁移。②大气污染油料作物，引发PAHs不断向食用油迁移。③油料在机械收获、运输、加工等过程中因接触机油等污染物而受到PAHs污染。鉴于此，对食用油中PAHs检测方法的研究具有现实意义。我国新修订的强制性食品安全国家标准GB2762-2012《食品中污染物限量》规定了食用油脂中苯并(a)芘的残留限量(10μg/kg)，欧盟委员会发布的835/2011/(EC)法规规定了食品中苯并(a)芘(2.0μg/kg)以及苯并(a)花、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)荧蒽总量(10μg/kg)的限量。我国标准的分类和限值相对于国际限量标准仍有一定差距。因而，进一步研究食用油中PAHs的检测方法，更新污染物残留限量的工作具有深远意义。

目前，关于食用油中PAHs的检测主要针对16EPA PAHs，而对16EU PAHs相关文献报道较少，24种PAHs同时检测的方法更是罕见。食用油中PAHs的常用检测仪器主要是液相色谱荧光检测及气质联用法，液相色谱仪荧光检测器灵敏度高，定量准确，但定性能力较弱，且低沸点PAHs回收率低且不稳定，对不具荧光吸收的环戊[c d]芘需再采集紫外图谱才能全部定量；气质联用法兼有色谱分离效率高、定量准确以及质谱的选择性高、鉴别能力强、提供丰富的结构信息便于定性等特点，并具有灵敏度、分析速度快、所需样品量少等优点。食用油PAHs含量低、基质复杂、干扰物多，因此样品的前处理过程在很大程度上决定了分析结果的准确性和可靠性。常用的前处理方法有液液萃取法(LLE)、固相萃取(SPE)、凝胶渗透色谱法(GPC)和供体受体复合物色谱法(DACC)，磁性分散固相萃取法(MSPE)等。食用油多环芳烃中含量低，背景复杂，传统的液液萃取法操作繁索，结果回收率低，会耗用大量的有机溶剂，对环境危害大；SPE是应用广泛的微量样品前处理技术，但由于缺少特异性吸附PAHs的柱填料，灵敏度及精密度低、净化效果不好；GPC溶剂使用量大，对大分子油脂、色素、腊质等杂质去除效果好，但对小分子干扰物去除效果差，同时自动化设备成本高；DACC法检测速度快，但在线DACC法对仪器要求较高，离线DACC法手动收集馏分的工作量较大，且DACC色谱对小环多环芳烃无法进行测定。磁性分散固相萃取法需要合成相应的磁性高分子材料，技术要求高且材料重复性难保证，不易商品化。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以解决以上问题的基于分子印迹固相萃取-气/质谱联用技术的检测食用油中24种多环芳烃的方法。

本发明的技术方案是：

本发明的一种基于分子印迹固相萃取-气/质谱联用技术的检测食用油中24种多环芳烃的方法，包括以下步骤：

(1)制备标准溶液：包括：

多环芳烃混合标准储备液：用正己烷逐级稀释定容，配制成1.0mg/L的标准使用液；

同位素内标标准使用液：分别将多环芳烃同位素内标储备液用正己烷逐级稀释，定容至1.0mg/L；

(2)前处理：

准确称取食用油0.50g在10mL具塞试管内，先加入混合内标使用液20μl(20ng)，再加3mL正己烷，涡旋混匀，待净化，分别用5mL正己烷和5mL二氯甲烷活化高分子印迹固相萃取小柱，之后，稀释油样加入到小柱上，6mL正己烷分两次淋洗小柱后弃去，用10mL的二氯甲烷、乙酸乙酯1∶1的混合液洗脱，收集洗脱液，氮气吹至近干，有液体可见，加入0.3mL正己烷溶解，进行GC/MS分析；

优选的，所述多环芳烃混合标准储备液内包括24种多环芳烃，分别为萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a)芘、茚并(1，2，3-c，d)芘、二苯并(a，h)蒽、苯并[g，h，i]芘、苯并(c)芴、环戊并(c，d)芘、5-甲基屈、苯并(j)荧蒽、二苯并(a，l)芘、二苯并(a，e)芘、二苯并(a，i)芘、二苯并(a，h)芘。

优选的，所述多环芳烃同位素内标储备液内包括16种同位素多环芳烃，分别为D8-萘、D8-苊烯、D10-苊、D10-芴、D10-菲、D10-蒽、D10-荧蒽、D10-芘、D12-苯并(a)蒽、D12-屈、D12-苯并(b)荧蒽、D12-苯并(k)荧蒽、D12-苯并(a)芘、D12-茚并(1，2，3-c，d)芘、D14-二苯并(a，h)蒽、D12-苯并[g，h，i]芘。

优选的，色谱条件为：DB-PAHEU石英毛细柱(20m×0.18mm×0.14μm)；进样口温度250℃；升温程序：初始温度80℃，保持2min，以10℃/min升至250℃，保持2min，以8℃/min升至315℃，保持5min，最后以20℃/min升至320℃，保持8min；载气(He)流速0.7mL/min，进样量1μL；不分流进样。溶剂延迟4min。

优选的，质谱条件为：电离方式：EI源，70eV；离子源温度230℃；扫描方式：选择离子扫描。

优选的，各物质定性和定量离子如下表所示。

24种PAHs的定性和定量离子

本发明具有的优点和积极效果是：由于采用上述技术方案，食用油内24种多环芳烃的检测更加方便，本发明方法的精密度和准确度良好，满足限量值要求。

具体实施方式

本发明的一种基于分子印迹固相萃取-气/质谱联用技术的检测食用油中24种多环芳烃的方法，包括以下步骤：

(1)制备标准溶液：

24种多环芳烃混合标准储备液(100mg/L)用正己烷逐级稀释定容，配制成1.0mg/L的标准使用液，其中16种EPA多环芳烃混合标准溶液(浓度均为100mg/L)来自美国Accustandard公司，成份为萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a)芘、茚并(1，2，3-c，d)芘、二苯并(a，h)蒽、苯并[g，h，i]芘，剩余8种单标分别为苯并(c)芴、环戊并(c，d)芘、5-甲基屈、苯并(j)荧蒽、二苯并(a，l)芘、二苯并(a，e)芘、二苯并(a，i)芘、二苯并(a，h)芘，这8种单标，浓度均为100mg/L，来自德国Dr公司；

同位素内标标准使用液(1mg/L)：分别将16种多环芳烃混合同位素内标储备液(来自德国Dr公司)用正己烷逐级稀释，定容至1.0mg/L，具体成份为D8-萘、D8-苊烯、D10-苊、D10-芴、D10-菲、D10-蒽、D10-荧蒽、D10-芘、D12-苯并(a)蒽、D12屈、D12-苯并(b)荧蒽、D12-苯并(k)荧蒽、D12-苯并(a)芘、D12-茚并(1，2，3-c，d)芘、D14-二苯并(a，h)蒽、D12-苯并[g，h，i]芘；

(2)前处理：

准确称取食用油0.50g在10mL具塞试管内，先加入混合内标使用液20μl(20ng)，再加3mL正己烷，涡旋混匀(旋涡混匀器来自德国IKA公司)，待净化。分别用5mL正己烷(HPLC级，德国默克公司)和5mL二氯甲烷(HPLC级，德国默克公司)活化高分子印迹固相萃取小柱(MIP-PAHs，500mg/6mL，上海安谱公司)，固相萃取仪来自美国安捷伦公司。之后，稀释油样加入到小柱上。6mL正己烷分两次淋洗小柱后弃去。用10mL二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶1)洗脱，收集洗脱液。利用全自动氮吹浓缩仪(美国BIOTAGE公司)，氮气吹至近干(有液体可见)，加入0.3mL正己烷溶解，进行GC/MS分析。

(3)仪器条件

GC/MS采用7890A-5975C气相色谱质谱联用仪，色谱条件：DB-PAHEU石英毛细柱(20m×0.18mm×0.14μm)；进样口温度250℃；升温程序：初始温度80℃，保持2min，以10℃/min升至250℃，保持2min，以8℃/min升至315℃，保持5min，最后以20℃/min升至320℃，保持8min；载气(He)流速0.7mL/min，进样量1μL；不分流进样。溶剂延迟4min。

质谱条件：电离方式：EI源，70eV；离子源温度230℃；扫描方式：选择离子扫描(SIM)；各物质定性和定量离子见表1。

表1 24种PAHs的定性和定量离子

优选的，

(4)方法的线性范围、检出限及定量限：

标准曲线：以24种PAHs标准使用液配制浓度分别为1、2、5、10、20和50μg/L(内标质量均为20ng)的PAHs系列标准曲液(二苯并(a，l)芘等4种同分异构体标准使用液配制浓度分别为5、10、25、50、100和250μg/L)，直接进样进行GC-MS测定。以PAHs色谱峰峰面积与其对应的内标物的色谱峰峰面积之比为纵坐标，PAHs与其对应内标的浓度比为横坐标绘制标准曲线。

检出限和定量限：样品溶液中添加10μg/kg的16种PAHs混合标准溶液，按实验步骤分别测定基质样品和加标样品。分别以3倍信噪比和10倍信噪比的响应对应的含量作为方法的检出限与定量限。

(5)方法的线性范围、检出限及定量限

在1～50μg/L范围内(二苯并(a，l)芘等4种同分异构体为5～250μg/L)，不同浓度的24种PAHs含量与峰面积均具有良好的线性，相关系数均＞0.998。以取样量为0.5g计，本方法检出限范围为0.1～1.2μg/kg，定量限范围为0.3～3.6μg/kg，苯并(a)芘满足限量标准判定要求(见表2)。

(6)回收率实验

将24种同位素内标混合液加入样品(10μg/kg)，净化后测得16种内标物绝对回收率范围为79.3％～94.7％。样品按加标浓度高中低分成三组，低浓度组(2μg/kg)回收率范围为78.5％～111.9％，相对标准偏差为3.2％～12.3％(n＝6)；中浓度组(10μg/kg)回收率范围为84.3％～117.6％，相对标准偏差为2.9％～10.4％(n＝6)。高浓度组(50μg/kg)回收率范围为90.3％～108.9％，相对标准偏差为2.1％～9.9％(n＝6)。加标回收实验结果表明，方法的精密度和准确度良好，满足限量值要求。

表2方法的线性范围、检出限及定量限

研究采自当地市场的超市及小卖部的样品，共检测了62份常用食用油，分别为菜籽油13份、茶油11份、玉米油11份、调和油8份、葵花籽油6份、花生油6份、大豆油4份、稻米油2份、橄榄油1份。

所有样品均有检出多环芳烃，检出率为100％(62/62)，其中苯并(a)芘检出28份，检出率为45.2％(28/62)，有2份样品苯并(a)芘含量超过我国限量标准10μg/kg，超标率为3.2％(2/62)，最高含量24.8μg/kg；若对照欧盟新法规2μg/kg的限值，超标17份，超标率为27.4％(17/62)。4种多环芳烃总含量最低为0.3μg/kg，最高为143.7μg/kg，中位值为7.8μg/kg，对照欧盟新法规PAH4的的限值10μg/kg，超标19份，超标率为30.6％(19/62)。24种多环芳烃总含量最低为18.5μg/kg，最高为957.3μg/kg，中位值为93.6μg/kg。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。