一种宫颈细胞瓦博格效应简易检测试剂及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种宫颈细胞瓦博格效应简易检测试剂及其制备方法和应用。所述试剂由试剂A、试剂B、试剂C和试剂D组成；试剂A为4‑6%的枯草杆菌蛋白酶等渗溶液；试剂B为pH 3.5‑6.0的醋酸盐缓冲液；试剂C由0.1 g/L‑0.25 g/L的3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺溶液、1.0 mL/L‑2.5 mL/L的6‑甲氧基喹啉溶液和2‑5mL/L的过氧化羟基异丙苯溶液组成；试剂D由0.03‑0.07%甲苯胺蓝O溶液、2.5‑7.5 mL/L的曲拉通X‑100溶液组成。所述试剂可用于定性检测宫颈脱落细胞的细胞游离亚铁原卟啉和活性氧含量，判断宫颈细胞的瓦博格效应强弱。

说明书

技术领域

本发明涉及一种宫颈细胞瓦博格效应简易检测试剂及其制备方法和应用，属于医学检验领域。

背景技术

宫颈癌是妇女健康的第二“杀手”，全世界每年近50万新发宫颈癌病例，每年夺去全球30万名女性的性命。中国每年新增宫颈癌发病数超过15万，占女性生殖系统恶性肿瘤发病率的73-93%。死亡率约50%。宫颈癌已在我国严重威胁到中青年女性的健康和生命。提高癌症治愈率的关键在于“三早”（早发现、早诊断、早治疗）。有证据表明，如果女性适时地进行检查，在早期发现宫颈癌并且将其扼杀在萌芽阶段的几率将会大大增高。宫颈癌只要能够做到“三早”，其5年生存率几乎达到100%。几年来，我国农村两癌普查受众仅达9%，究其原因，一缺资金，二缺技术。由于基本公共卫生设施严重缺乏，细胞学医生严重不足，较高的费用，寻找更加客观，判读简单，经济的生物标志物以管理宫颈癌高危妇女成为了一个关键问题。

研究发现，宫颈细胞在癌变早期出现糖代谢异常，癌细胞的耗糖量是正常宫颈上皮细胞的十倍，但是其产生的能量只是正常细胞的十分之一，而且磷酸戊糖途径代谢模式活跃，这种异常称为瓦博格效应。目前，宫颈癌细胞的瓦博格效应可由PET-CT（正电子发射计算机断层显像）检测获得。但是，PET-CT运营成本相当高，全身检查一次，辐射量相当于一个正常人30年的辐射在一小时内接受。因此，开发新的能够简便准确检测宫颈癌的试剂具有重要现实意义。

发明内容

为解决PET-CT运营成本高、对人体有较重的辐射危害及无简便筛查检测宫颈癌试剂问题，本发明提供了一种可快速准确对宫颈细胞瓦博格效应进行简易检测的试剂。

本发明的另一目的是提供一种宫颈细胞瓦博格效应简易检测试剂的制备方法。

本发明的再一目的是提供一种宫颈细胞瓦博格效应简易检测试剂在检测宫颈细胞瓦博格效应的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种宫颈细胞瓦博格效应的简易检测试剂，由试剂A、试剂B、试剂C和试剂D组成；

其中，

试剂A为4-6 %的枯草杆菌蛋白酶等渗溶液；

试剂B为pH 3.5-6.0的醋酸盐缓冲液；

试剂C由0.1 g/L-0.25 g/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液、1.0 mL/L-2.5 mL/L的6-甲氧基喹啉溶液和2-5mL/L的过氧化羟基异丙苯溶液组成

试剂D由0.03-0.07 %甲苯胺蓝O溶液、2.5-7.5 mL/L的曲拉通X-100溶液组成。

所述试剂A、试剂B、试剂C和试剂D的体积比为2:1:1:1。

作为优选，

所述试剂A枯草杆菌蛋白酶的浓度为5 %w.t；

所述试剂B醋酸盐缓冲液的浓度为2 mol/L，pH为5.0；

所述试剂C的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺浓度为0.15 g/L，6-甲氧基喹啉浓度为1.25mL/L，过氧化羟基异丙苯浓度为2.5 mL/L；

所述试剂D的甲苯胺蓝O浓度为0.05 %w.t，曲拉通X-100浓度为 5 mL/L。

一种上述简易检测试剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）试剂A的制作：

将枯草杆菌蛋白酶加入等渗溶液中溶解即得试剂A；

（2）试剂B的制作：

a）将醋酸钠与冰醋酸分别溶解于纯净水中；

b）将两种溶液混匀即试剂B；

（3）试剂C的制作：

a）将3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶于少量无水乙醇中；

b）将过氧化羟基异丙苯和6-甲氧基喹啉依次加入上述a）溶液中溶解；

c）纯净水定容，即得试剂C；

（4）试剂D的制作：

a）甲苯胺蓝O溶于纯净水；

b）曲拉通X-100加入上述a）溶液中溶解，即得试剂D。

所述无水乙醇与试剂C的体积百分比为30%。

一种上述简易检测试剂在检测宫颈细胞瓦博格效应的应用，包括以下步骤：

（1）将宫颈上皮脱落细胞置于试剂A中制成样本液；

（2）将上述样本液离心；

（3）取步骤（2）的上清液，先加入试剂B混匀，再加入试剂C以比色法测定细胞游离亚铁原卟啉含量：若不变色为阴性，浅蓝色为弱阳性，蓝色为阳性，深蓝色为强阳性；

（4）取步骤（2）的沉淀物，加入试剂D以比色法测定宫颈脱落细胞的活性氧含量：若不变色（蓝色）为阴性，蓝色变为浅蓝色为阳性，变为无色为强阳性。

本发明简易检测试剂的工作原理如下：

1. 宫颈细胞的溶解：宫颈细胞悬浮于预处理液（试剂A）中成为细胞悬液，细胞膜部分成分被枯草杆菌蛋白酶分解，细胞膜解离，含有细胞游离亚铁原卟啉的细胞内物质溶解于预处理液中，而产生细胞内活性氧的细胞器悬浮于预处理液中，通过离心将细胞器及其他细胞残渣沉淀。

2. 细胞游离亚铁原卟啉的测试原理：细胞游离亚铁原卟啉具有类似过氧化物酶的作用，具备水解过氧化物（如过氧化羟基异丙苯）的能力。细胞游离亚铁原卟啉与过氧化物反应，夺取过氧化物的氧原子，并与氧原子结合；但是与氧原子结合的细胞游离亚铁原卟啉极不稳定，迅即又脱掉氧原子传递给供氢体四甲基联苯胺，使原本不含发色集团的供氢体3,3’,5,5’-四甲基联苯胺脱氢，生成含发色集团醌基的蓝色物质联苯胺蓝。样本内若不含有细胞游离亚铁原卟啉，则无联苯胺蓝生成，因之不显色；样本内若含有细胞游离亚铁原卟啉，则有联苯胺蓝生成，反应液逐渐呈现蓝色。显色的深浅与样本内含有的细胞游离亚铁原卟啉成正比。如此，观察反应液的颜色即可测及样本内细胞游离亚铁原卟啉的含量。

3. 活性氧测定原理：细胞Fenton反应是线粒体内的过氧化氢与二价铁离子反应产生三价铁离子、羟基和羟自由基的反应。羟自由基是一种氧化能力很强的自由基，它很容易氧化各种有机物和无机物，氧化效率高，反应速率快。羟自由基与甲苯胺蓝O发生氧化反应，使甲苯胺蓝O的颜色发生变化，从而间接地测知羟自由基的含量。样本内若含有细胞羟自由基，则甲苯胺蓝O被氧化，反应液的颜色变淡，颜色的深浅与样本内含有的细胞羟自由基成正比。如此，观察反应液的颜色即可测及样本内细胞羟自由基的含量。

本发明具有以下优点：

本发明的宫颈细胞瓦博格效应的简易检测试剂可准确、方便、快速地检测细胞游离亚铁原卟啉含量和细胞的活性氧含量，以定性方法检测宫颈细胞糖代谢的瓦博格效应。本发明试剂稳定性好，在常温干燥环境下可以稳定保存两年以上。本宫颈细胞瓦博格效应简易检测试剂敏感度高，特异性好，符合筛查试剂的要求，适合于做大数据人群的宫颈癌筛查。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1试剂制备

（1）试剂A的制作：

将5.00 g枯草杆菌蛋白酶加入至100mL 0.9 % NaCl等渗溶液中溶解，得试剂A；

（2）试剂B的制作：

a）将82g醋酸钠溶于1000mL水中，得2 mol/L醋酸钠溶液；将15g冰醋酸溶于200mL水中，得2 mol/L醋酸溶液；

b）将上述溶液按5:1比例混匀，即得试剂B。

（3）试剂C的制作：

a）将0.15 g 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶于30 mL无水乙醇中；

b）将0.25 mL过氧化羟基异丙苯和0.125 mL 6-甲氧基喹啉依次加入上述a）溶液中溶解；

c）纯净水定容至100mL，即得试剂C；

（4）试剂D的制作：

a）将0.05 g甲苯胺蓝O溶于100 mL纯净水；

b）将0.5 mL曲拉通X-100加入上述a）溶液中溶解，即得试剂D。

实施例2试剂的使用方法

（1）用细胞刷轻轻刷取宫颈上皮脱落细胞，然后将细胞刷置于2mL试剂A中轻轻搅动，制成样本液；

（2）将上述样本液3000转/分钟高速离心3min；

（3）取步骤（2）的上清液，先加入1mL试剂B混匀，再加入1mL试剂C，在3分钟时观察反应液的颜色，由此显示测定细胞游离亚铁原卟啉含量：若不变色为阴性，浅蓝色为弱阳性，蓝色为阳性，深蓝色为强阳性；

（4）取1mL试剂D加入步骤（2）的沉淀物，在3分钟时观察反应液的颜色，由此显示测定细胞活性氧的含量：若不变色（蓝色）为阴性，蓝色变为浅蓝色为阳性，变为无色为强阳性；

结果判定：上述两种检测中均阳性为该样本细胞瓦博格效应阳性，显示存在宫颈癌的可能性；其一阳性为该样本细胞瓦博格效应可疑阳性，显示存在宫颈癌的风险；均阴性为该样本细胞瓦博格效应阴性，显示尚无宫颈癌的风险。

实施例3 临床验证

1.敏感度

（1）标本来源：某医疗单位妇科收纳的宫颈癌病人宫颈脱落细胞样本100份，宫颈癌均经病理学检查确诊。

（2）操作方法：按实施例2操作。

（3）验证结果：见表1。

表1 宫颈细胞瓦博格效应简易检测试剂敏感度

检测项目阳性阴性可疑阳性敏感度（%）细胞游离亚铁原卟啉检测8713--87细胞活性氧检测6436--64检测结果64132387

2.特异度

（1）标本来源：某医疗单位普通妇科收纳的非宫颈癌病人宫颈脱落细胞样本100份。非宫颈癌均经病理学检查排除宫颈癌。

（2）操作方法：按实施例2操作。

（3）验证结果：见表2。

表2 宫颈细胞瓦博格效应简易检测试剂特异度

检测项目阳性阴性可疑阴性特异度（%）细胞游离亚铁原卟啉检测1783--83细胞活性氧检测199--99检测结果1831699

3.约登指数

通过下式计算约登指数：

本宫颈细胞瓦博格效应简易检测试剂的约登指数为0.86。

由上述数据可知，本宫颈细胞瓦博格效应简易检测试剂的细胞游离亚铁原卟啉检测敏感度高（87%），细胞活性氧检测特异度高（99%），二者联合检测能够相互印证，具有良好的诊断符合率（86%）。本宫颈细胞瓦博格效应简易检测试剂符合筛查试剂的要求，适合于做大数据人群的宫颈癌筛查。