一种骨肉瘤细胞的无血清培养基及其制备方法

摘要

本发明公开了一种骨肉瘤细胞的无血清培养基，由碳水化合物、氨基酸、核苷酸、维生素、无机盐、微量元素和添加物组成；所述添加物是由终浓度为10‑100mg/L透明质酸、1‑10mg/L吐温‑80、0.1‑10mg/L绿原酸和0.5mg/L酚红组成。本发明首次提供了一种适用于骨肉瘤细胞大规模悬浮培养的无血清培养基，本发明的无血清培养基能适用于骨肉瘤细胞高密度悬浮培养和表达重组蛋白，本发明的无血清培养基中化学成分明确，制备简单，能够重复性地人工配制并且质量稳定，同时生产成本较低，为利用骨肉瘤细胞表达重组蛋白的规模化生产提供一种成本低廉的培养方法。

说明书

技术领域

本发明涉及无血清培养基的制备技术领域，特别是涉及一种骨肉瘤细胞的无血清培养基及其制备方法。

背景技术

骨肉瘤细胞是从间质细胞系发展而来，在科研中得到了广泛应用。研究表明，骨肉瘤细胞具有传代稳定、增殖能力强和易于工业化培养的特征，并且具有糖基化修饰系统，同时具有高安全性的特点。有研究采用骨肉瘤细胞作为重组蛋白的哺乳动物细胞表达系统(中国专利“人碱性磷酸酶糖蛋白的癌细胞高效表达系统及其应用”，专利申请号201710024278.6)。因此，研发能够满足规模化悬浮培养骨肉瘤细胞的培养基具有重要的应用价值。

骨肉瘤细胞的培养一般采用在DEME或RPMI 1640基础培养基中添加5～10％胎牛血清，由于胎牛血清生产批次不同会造成质量不同，同时血清容易感染病毒或支原体，不适合骨肉瘤细胞的规模化培养和生产重组蛋白。

无血清培养基是继天然培养基、合成培养基之后的第三类培养基。与传统的培养基相比较，无血清培养基是不含有动物血清，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖的一种培养基。无血清培养基由于增加了成分的确定性，性能更加一致，容易进行纯化和下游加工，因此，无血清培养基在现代生物技术领域得到了广泛的应用。

但目前还没有专门用于骨肉瘤细胞悬浮培养的无血清培养基，虽然骨肉瘤细胞能够在部分市售无血清培养基中生长，但由于无血清培养基没有广泛的适应性，同类型的细胞、甚至不同的细胞系或细胞株需要特定的培养基成分和比例，对无血清培养基的适应往往是不同的，因此，骨肉瘤细胞在市售的无血清培养基中往往不能获得优良的细胞数量和倍增时间，不能满足规模化悬浮培养骨肉瘤细胞的需要。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种骨肉瘤细胞的无血清培养基及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种骨肉瘤细胞的无血清培养基。

本发明的骨肉瘤细胞的无血清培养基由碳水化合物、氨基酸、核苷酸、维生素、无机盐、微量元素和添加物组成；

所述碳水化合物是由终浓度为1000-10000mg/L D-葡萄糖、100-500mg/L丙酮酸钠、1-10mg/L甘油、1-20mg/L葡萄糖乙醇胺和1-20mg/L精胺组成；

所述氨基酸是由终浓度为100-1000mg/L酪蛋白氨基酸、5-80mg/L甘氨酸、5-80mg/L半胱氨酸、5-80mg/L组氨酸、5-80mg/L赖氨酸、5-80mg/L苯丙氨酸、5-80mg/L丝氨酸、5-80mg/L苏氨酸和5-80mg/L色氨酸组成；

所述核苷酸是由终浓度为1-10mg/L胞苷、1-10mg/L腺苷、1-10mg/L鸟苷、1-10mg/L胸苷、1-10mg/L尿苷和1-10mg/L次黄嘌呤组成；

所述维生素是由终浓度为0.1-10mg/L D-泛酸钙、0.1-10mg/L叶酸、0.1-10mg/L烟酰胺、0.1-10mg/L维生素B6、0.1-10mg/L维生素B12、0.1-10mg/L核黄素、0.1-10mg/L维生素C、0.1-10mg/L硫胺素和0.1-10mg/L硫辛酸组成；

所述无机盐是由终浓度为0.1-10mg/L氯化钠、0.1-10mg/L硫酸镁、0.1-10mg/L氯化钙、0.1-10mg/L氯化钾、0.1-10mg/L磷酸二氢钠、0.1-10mg/L磷酸氢二钠、0.1-10mg/L七水硫酸锌、0.1-10mg/L柠檬酸铁和0.1-10mg/L碳酸氢钠组成；

所述微量元素是由终浓度为0.001-0.01mg/L亚硒酸钠、0.001-0.01mg/L偏钒酸钠、0.001-0.01mg/L钼酸铵、0.001-0.01mg/L硫酸锰和0.001-0.01mg/L氯化钴组成；

所述添加物是由终浓度为10-100mg/L透明质酸、1-10mg/L吐温-80、0.1-10mg/L绿原酸和0.5mg/L酚红组成。

优选的，本发明的骨肉瘤细胞的无血清培养基中，各原料物质的终浓度为：

碳水化合物部分：

6000mg/L D-葡萄糖、150mg/L丙酮酸钠、5mg/L甘油、8mg/L葡萄糖乙醇胺、4mg/L精胺；

氨基酸部分：

600mg/L酪蛋白氨基酸、15mg/L甘氨酸、20mg/L半胱氨酸、20mg/L组氨酸、30mg/L赖氨酸、15mg/L苯丙氨酸、20mg/L丝氨酸、15mg/L苏氨酸、20mg/L色氨酸；

核苷酸部分：

5mg/L胞苷、5mg/L腺苷、5mg/L鸟苷、5mg/L胸苷、5mg/L尿苷、2mg/L次黄嘌呤；

维生素部分：

0.2mg/L D-泛酸钙、0.2mg/L叶酸、0.2mg/L烟酰胺、0.15mg/L维生素B6、0.15mg/L维生素B12、0.15mg/L核黄素、0.4mg/L维生素C、0.2mg/L硫胺素、0.15mg/L硫辛酸；

无机盐部分：

8mg/L氯化钠、2mg/L硫酸镁、2mg/L氯化钙、1mg/L氯化钾、5mg/L磷酸二氢钠、5mg/L磷酸氢二钠、0.5mg/L七水硫酸锌、0.5mg/L柠檬酸铁、1mg/L碳酸氢钠；

微量元素部分：

0.002mg/L亚硒酸钠、0.002mg/L偏钒酸钠、0.002mg/L钼酸铵、0.002mg/L硫酸锰、0.002mg/L氯化钴；

添加物部分：

80mg/L透明质酸、5mg/L吐温-80、0.5mg/L绿原酸、0.5mg/L酚红。

本发明的第二方面，提供上述骨肉瘤细胞的无血清培养基的制备方法，步骤如下：

将各原料物质加入到超纯水中，混合均匀，调节pH至7.2，过滤除菌，即得。

本发明的第三方面，提供上述无血清培养基在规模化悬浮培养骨肉瘤细胞中的用途。

优选的，上述用途中，所述骨肉瘤细胞为表达重组碱性磷酸酶蛋白的骨肉瘤细胞。

进一步的，本发明还提供上述无血清培养基在表达重组蛋白中的用途，特别是在表达重组碱性磷酸酶蛋白中的用途。

本发明的第四方面，提供一种悬浮培养骨肉瘤细胞的方法，步骤如下：

(1)按上述方法制备骨肉瘤细胞的无血清培养基；

(2)将骨肉瘤细胞接种到步骤(1)的无血清培养基中，在20L细胞培养罐中37℃、5％CO₂悬浮培养。

优选的，步骤(2)中，悬浮培养的转速为60r/min，培养的时间为8天。

本发明的第五方面，提供一种表达重组碱性磷酸酶的方法，步骤如下：

(1)按上述方法制备骨肉瘤细胞的无血清培养基；

(2)将携带重组碱性磷酸酶表达载体的骨肉瘤细胞接种到步骤(1)的无血清培养基中，在20L细胞培养罐中37℃、5％CO₂，60r/min悬浮培养，即表达得到重组碱性磷酸酶。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次提供了一种适用于骨肉瘤细胞大规模悬浮培养的无血清培养基，本发明的无血清培养基能适用于骨肉瘤细胞高密度悬浮培养和表达重组蛋白，本发明的无血清培养基中化学成分明确，制备简单，能够重复性地人工配制并且质量稳定，同时生产成本较低，为利用骨肉瘤细胞表达重组蛋白的规模化生产提供一种成本低廉的培养方法。

(2)本发明的无血清培养基中还特别添加了一定量的添加剂，所述添加剂由透明质酸、吐温-80、绿原酸和酚红组成；其中，透明质酸可以为骨肉瘤细胞提供悬浮环境，促进骨肉瘤细胞对营养物质的吸收；吐温-80可以提高表面张力，降低骨肉瘤细胞的聚集成团倾向；低浓度绿原酸可以刺激骨肉瘤细胞快速生长，明显降低细胞的倍增时间，提高细胞数量。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中还没有专门用于骨肉瘤细胞悬浮培养的无血清培养基，骨肉瘤细胞在市售的无血清培养基中往往不能获得优良的细胞数量和倍增时间，不能满足规模化悬浮培养骨肉瘤细胞的需要。基于此，本申请提出了一种骨肉瘤细胞的无血清培养基及其制备方法。

在本申请的一种实施方案中，提供了一种骨肉瘤细胞的无血清培养基，由碳水化合物、氨基酸、核苷酸、维生素、无机盐、微量元素和添加物组成；

所述碳水化合物是由终浓度为1000-10000mg/L D-葡萄糖、100-500mg/L丙酮酸钠、1-10mg/L甘油、1-20mg/L葡萄糖乙醇胺和1-20mg/L精胺组成；

所述氨基酸是由终浓度为100-1000mg/L酪蛋白氨基酸、5-80mg/L甘氨酸、5-80mg/L半胱氨酸、5-80mg/L组氨酸、5-80mg/L赖氨酸、5-80mg/L苯丙氨酸、5-80mg/L丝氨酸、5-80mg/L苏氨酸和5-80mg/L色氨酸组成；

所述核苷酸是由终浓度为1-10mg/L胞苷、1-10mg/L腺苷、1-10mg/L鸟苷、1-10mg/L胸苷、1-10mg/L尿苷和1-10mg/L次黄嘌呤组成；

所述维生素是由终浓度为0.1-10mg/L D-泛酸钙、0.1-10mg/L叶酸、0.1-10mg/L烟酰胺、0.1-10mg/L维生素B6、0.1-10mg/L维生素B12、0.1-10mg/L核黄素、0.1-10mg/L维生素C、0.1-10mg/L硫胺素和0.1-10mg/L硫辛酸组成；

所述无机盐是由终浓度为0.1-10mg/L氯化钠、0.1-10mg/L硫酸镁、0.1-10mg/L氯化钙、0.1-10mg/L氯化钾、0.1-10mg/L磷酸二氢钠、0.1-10mg/L磷酸氢二钠、0.1-10mg/L七水硫酸锌、0.1-10mg/L柠檬酸铁和0.1-10mg/L碳酸氢钠组成；

所述微量元素是由终浓度为0.001-0.01mg/L亚硒酸钠、0.001-0.01mg/L偏钒酸钠、0.001-0.01mg/L钼酸铵、0.001-0.01mg/L硫酸锰和0.001-0.01mg/L氯化钴组成；

所述添加物是由终浓度为10-100mg/L透明质酸、1-10mg/L吐温-80、0.1-10mg/L绿原酸和0.5mg/L酚红组成。

上述氨基酸中添加的酪蛋白氨基酸为利用酶解法生产的氨基酸混合物，可以满足骨肉瘤细胞对氨基酸类营养物质的大部分需求，可以降低无血清培养基的生产成本。

上述添加物中透明质酸可以为骨肉瘤细胞提供悬浮环境，提高骨肉瘤细胞对营养物质的吸收效率；吐温-80可以提高表面张力，降低骨肉瘤细胞的聚集成团倾向；低浓度绿原酸可以刺激骨肉瘤细胞快速生长，明显降低细胞的倍增时间，提高细胞数量。

本申请通过对无血清培养基的配方进行优化设计，使其能特别的适用于骨肉瘤细胞的悬浮培养，更好的促进细胞的生长、增殖以及目的产物的表达，

在本申请的另一种实施方案中，提供了一种利用上述无血清培养基悬浮培养骨肉瘤细胞的方法，步骤如下：

将骨肉瘤细胞接种到本申请的无血清培养基中，在20L细胞培养罐中37℃、5％CO₂，60r/min悬浮培养，连续培养8天。

在本申请的再一种实施方案中，提供了一种利用上述无血清培养基表达重组碱性磷酸酶的方法，步骤如下：

将携带重组碱性磷酸酶表达载体的骨肉瘤细胞接种到本申请的无血清培养基中，在20L细胞培养罐中37℃、5％CO₂悬浮培养，即表达得到重组碱性磷酸酶。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例和对比例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：骨肉瘤细胞的无血清培养基的制备

无血清培养基中各原料物质的配方见表1。

表1：无血清培养基配方

按照表1的成分组成，将各成分添加到超纯水中，混合均匀后，pH值调整为7.2，用0.22μM滤膜过滤除菌，然后在4℃冰箱中保存备用。

对比例1：无血清培养基的制备

将实施例1中表1的添加物省略，其余原料不变，制备方法同实施例1，制备得到无血清培养基。

对比例2：

将实施例1中表1的氨基酸部分的“酪蛋白氨基酸”省略，其余原料不变，制备方法同实施例1，制备得到无血清培养基。

实施例2：无血清培养基培养骨肉瘤细胞

取实施例1制备的无血清培养基25mL置于100mL体积的细胞培养瓶，将骨肉瘤细胞MG-63接种到培养瓶，在20L细胞培养罐中37℃、5％CO₂，60r/min悬浮培养。连续培养8天，检测细胞密度，结果显示细胞密度达到3.4×10⁶个/mL。

实施例3：利用无血清培养基表达重组蛋白

取实施例1制备的无血清培养基25mL置于100mL体积的细胞培养瓶中，接种携带重组碱性磷酸酶表达载体的骨肉瘤细胞MG-63，在20L细胞培养罐中37℃、5％CO₂，60r/min悬浮培养。连续培养8天，检测细胞密度和重组碱性磷酸酶的表达量。结果显示重组碱性磷酸酶表达量达到27.3μg/ml(培养液)。

实施例4：不同培养基培养骨肉瘤细胞的比较

无血清培养基A：按照实施例1制备的无血清培养基；

无血清培养基B：市售无血清培养基；

无血清培养基C：按照对比例1制备的无血清培养基；

无血清培养基D：按照对比例2制备的无血清培养基；

有血清培养基E：在按照实施例1制备的无血清培养基基础上，添加5％V/V胎牛血清；

有血清培养基F：RPMI 1640基础培养基添加5％V/V胎牛血清。

分别取上述培养基(培养基A-F)25mL置于100mL体积的细胞培养瓶中，将携带重组碱性磷酸酶表达载体的骨肉瘤细胞MG-63接种到，在20L细胞培养罐中37℃、5％CO₂，60r/min悬浮培养。连续培养8天，检测细胞密度和重组碱性磷酸酶的表达量，结果见表2，

表2不同培养基培养骨肉瘤细胞和表达重组蛋白的结果比较

结果表明本发明的无血清培养基能够满足骨肉瘤细胞MG-63的悬浮培养和重组碱性磷酸酶表达，优于市售无血清培养基、对比例制备的无血清培养基和RPMI 1640有血清培养基，并且添加血清后不能显著改善细胞生长和重组蛋白表达情况。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。