风险患者发展或重新发展艰难梭菌感染的易感性的预测

摘要

本发明涉及预测风险患者发展或重新发展艰难梭菌感染的易感性的方法，其包括通过免疫测定确定来自所述患者的粪便样品中抗艰难梭菌毒素B的IgA抗体水平，并且将这个水平与用暴露于细菌的两群患者预先确定的参考值S进行比较，所述患者一群尚未发展或重新发展这样的感染，而另一群已发展或重新发展这样的感染，‑低于所述参考值S的水平表示所述患者是具有增加的发展或重新发展艰难梭菌感染风险的患者，以及‑高于所述参考值S的水平表示所述患者不是具有增加的发展或重新发展艰难梭菌感染风险的患者。

说明书

本发明涉及被细菌艰难梭菌(Clostridium difficile)感染的领域。特别地，本发明涉及发展或重新发展由于细菌艰难梭菌的感染的易感性的预测。

细菌艰难梭菌是产生毒素的、形成孢子的、厌氧的细菌，属于Gram+芽孢杆菌类型。它是引起抗生素后假膜性结肠炎(PMC)或腹泻的肠病原体，并且主要参与成年人的医院内腹泻。由于其非常高的传染潜力，它是非常可怕的。虽然约5％的群体是该细菌的无症状携带者，但是其病理表现与住院密切相关。

这种细菌在通过抗生素疗法减弱的肠道菌群中发展，并且可以分泌两种毒素，毒素A和毒素B。仅产生毒素的菌株是致病的。毒素A(一种肠毒素)，引起肠道上皮通透性的改变。毒素B(一种细胞毒素)，直接攻击上皮细胞。两种毒素的联合效应是减少肠内运送时间和肠吸收，导致腹泻。

几年前，不认为细菌艰难梭菌是临床公害。自2003年以来，在美国、加拿大然后在欧洲超高毒性菌株如菌株艰难梭菌核糖体型027(C.difficile Ribotype 027)的出现和快速传播导致对这种细菌的公众健康警惕(Kuijper E.J.et al.,2006)。现在它是医院内感染性腹泻的主要原因，造成15％-25％的假膜性结肠炎病例(Bartlett J.G.,2002)。其在综合医院中引起日益严重的病例和增加的死亡率。每天，在美国10000个患者中有7-12人受到影响(Freeman J.et al.,2010)，在欧洲10000个患者中多达5人受到影响(Bauer M.P.etal.,2011)。

粪便样品中感染艰难梭菌的诊断是已知的。其由几个步骤组成。不是必须的第一步由研究代表这种细菌存在的可检测蛋白之一(即谷氨酸脱氢酶(GDH))组成。其他可检测蛋白是在细菌产生毒素时分泌的毒素。GDH的检测或定量可以通过免疫测定进行，例如通过ELISA测定。这种技术给出比通过毒素的免疫测定检测或定量更大的诊断灵敏度。如果GDH测试为阳性，则推荐毒素的研究，因为这种技术提供更大的特异性。

粪便样品中毒素的这种研究构成第二步，或者如果未进行GDH的研究，则构成第一步。其可以通过ELISA测定或通过细胞毒性测定进行，后者构成“黄金标准”。还可能使用PCR，其更灵敏。这种技术的主要缺点是其仅检测毒素A和/或B基因的存在，不指示毒素是否实际产生，这可能对特异性是有害的。事实上，毒素的产生可能是失活的，在这种情况下，菌株是不致病的。

最后，如果粪便样品中毒素的研究是阴性的，在合适的CCFA(环丝氨酸头孢西丁果糖琼脂)培养基中进行细菌培养，这构成第三步。如果培养是阳性的，对菌落进行毒素的研究，例如通过ELISA测定或通过细胞毒性测定。

证实患者患有艰难梭菌感染之后，他接受治疗。这种治疗包括抗生素如甲硝唑(MTZ)或万古霉素(VA)。但是，治疗经常失败，并且再感染率在最初发作中达到20％，在连续感染中达到40％-60％(C.P.Kelly and J.T.Lamont,2008and D.W.Eyre et al.,2012)。再感染通常发生在原发感染治疗结束之后的28天内，但是延迟可以长达6-8周。

在1994年，Warny M.等(Warny M.et al.,1994)在具有感染艰难梭菌的单一发作的21个非免疫抑制患者以及具有(多次)再感染的4个非免疫抑制患者中研究了人对艰难梭菌的毒素A的免疫应答。在这个研究中，作者观察到抗毒素A血清IgG抗体和抗毒素A粪便IgA抗体的滴度在具有艰难梭菌感染的单一发作的患者中显著高于具有(多次)再感染的患者。对非常少量患者获得的后一种情况未做进一步研究。另一组(Johnson S.et al.,1992)甚至获得了相反的结果，在这个意义上他们发现具有再感染的患者具有高滴度的抗毒素A血清抗体。

详细制定了评分系统用于预测哪些患者对发展艰难梭菌感染易感。这个评分系统是基于几个标准，如患者的年龄、住院、抗生素的施用等(Garey K.W.et al.,2008)。但是，来自评分的结果并不总是一致，因此临床医生仍没有获得如体外诊断测试的简单工具。

尚未有研究组成功提出体外测定，使得可以在有风险的患者中预测对发展或重新发展艰难梭菌感染易感的那些患者。

因此有多年未满足的迫切需要，发现好工具以便能够在有风险的患者中预测具有发展或重新发展艰难梭菌感染的风险的那些患者。

申请人出乎意料地发现可以使用IgA型粪便抗体，针对艰难梭菌的毒素B，作为鉴定所述风险患者的标记。

因此，本发明涉及一种预测风险患者发展或重新发展艰难梭菌感染的易感性的方法，所述方法包括或由以下组成：通过免疫测定确定来自所述患者的粪便样品中针对艰难梭菌的毒素B的IgA抗体水平，以及将这个水平与以前用暴露于所述细菌的两群患者确定的参考值S进行比较，一群尚未发展或重新发展这样的感染，另一群已发展或重新发展这样的感染，

-低于所述参考值S的水平表示所述患者是具有增加的发展或重新发展艰难梭菌感染风险的患者，以及

-高于所述参考值S的水平表示所述患者不是具有增加的发展或重新发展艰难梭菌感染风险的患者。

其还涉及一种通过免疫测定确定在可能包含至少一种IgA抗体的患者的生物样品中所述至少一种IgA抗体的水平的方法，所述至少一种IgA抗体针对在酸的存在下不受影响的蛋白，优选针对艰难梭菌的毒素B。所述方法包括或由将一种或多种结合配对物带至所述至少一种IgA抗体组成，用于进行免疫测定，与包含用酸性样品处理缓冲液预处理的所述生物样品的酸性反应混合物接触，在其用于免疫测定之前不中和。

本发明最终涉及一种试剂盒，其通过免疫测定确定在可能包含至少一种IgA的患者的生物样品，特别是粪便样品中所述至少一种IgA抗体的水平，所述至少一种IgA抗体针对在酸的存在下不受影响的蛋白，特别是针对艰难梭菌的毒素B，所述试剂盒包括：(i)用于进行免疫测定的所述至少一种IgA抗体的一种或多种结合配对物(binding partner)，以及(ii)酸性样品处理缓冲液，应当理解所述试剂盒不含任何中和溶液。

出乎意料的是，申请人因此显示可以通过免疫测定确定来自所述患者的粪便样品中针对艰难梭菌的毒素B的IgA抗体水平，预测风险患者发展或重新发展艰难梭菌感染的易感性。

“发展艰难梭菌感染”表示患者第一次发展感染，无论艰难梭菌的菌株。

“重新发展艰难梭菌感染”表示患者有复发，即旧病复发(由于相同的艰难梭菌菌株感染)或再感染(由于不同于引起原发感染的菌株的艰难梭菌菌株感染)。

“风险患者”表示易受感染(vulnerable)的人。这个患者可能由于他的状况易受感染，例如因为：

-他是免疫抑制的，或者可能在未来药物治疗之后或在新疾病发生时变得免疫抑制；

-他刚刚发展感染，无论微生物，除了艰难梭菌；在这种情况下他可能已接受抗生素治疗；

-他刚刚发展艰难梭菌感染；在这种情况下他可能已接受抗生素治疗。在这种情况下，这个患者可以重新发展艰难梭菌感染。

他还可能由于他的年龄易受感染，因为他是早产儿、婴儿或超过65岁的人。

他还可能由于他的环境易受感染，因为他处于或即将处于可能存在艰难梭菌细菌的地方，如医院或护理中心。

当然，一个人可能仅具有这些易受感染性的风险之一，或者可能积累它们。

作为风险患者的非限制性实例，我们可以提到刚刚患有艰难梭菌感染、仍在医院中的人。在这种情况下，本发明的所述方法可以在治疗结束时进行(约7-10天的治疗之后和治疗结束之后长达28天)。根据一实施方案，所述风险患者是诊断为已患有艰难梭菌感染的患者，并且风险由重新发展新的艰难梭菌感染组成。

我们还可以提到已知或不知道已患有艰难梭菌感染且到达医院的人，这些人有接受抗生素治疗和/或免疫抑制剂的风险。根据另一个实施方案，所述风险患者是到达医院且可能接受导致他的免疫防御减少的药物的患者。

我们还可以提到年龄超过65岁，或者免疫抑制的，并且有用抗生素和/或免疫抑制剂治疗的风险的到达医院的人，无论这些人的艰难梭菌感染状态，即从未患有艰难梭菌感染，是艰难梭菌的携带者或已患有艰难梭菌感染。

根据本发明的所述方法的结果和患者的分层，如果认为他是具有增加的发展或重新发展艰难梭菌感染风险的患者，则临床医生能够决定一个或多个以下行动：施用适度的抗生素疗法，隔离患者以避免任何污染，推迟免疫抑制剂治疗，施用预防性免疫疗法，接种疫苗。

预测风险患者发展或重新发展艰难梭菌感染的易感性的所述方法采用免疫测定。免疫测定是本领域技术人员公知的测试。简单地说，其由利用分析物的至少一种结合配对物确定分析物的水平组成，在本申请情况下针对艰难梭菌的毒素B的IgA抗体。

当然，例如，术语“免疫测定”中的前缀“免疫”，在本申请中并不认为严格表示结合配对物必须是免疫来源的配对物，如抗体或抗体片段。事实上，如本领域技术人员公知的，这个术语更广泛用于表示测定和方法，其中结合配对物不是免疫来源/性质的配对物，而是例如由我们希望检测和/或定量的分析物的受体组成。必要条件是涉及的结合配对物应当能够结合至需要的分析物，在本申请情况下具有抗体的性质，优选特异性地。因此，已知对使用在严格意义上不是免疫的结合配对物的测定谈到ELISA测定，在英语中更常称作“配体结合测定(ligand binding assay)”，其可以翻译为法语“essai utilisant la liaisonàun ligand”，而术语“免疫”包括在对应于首字母缩略语ELISA的全称中。为了清晰和一致，术语“免疫”在本申请中用来表示使用至少一种适合结合至需要的分析物以及检测和/或定量后者的结合配对物的任何生物学分析，优选特异性地，即使所述结合配对物在严格意义上不是免疫性质或来源。

“针对艰难梭菌的毒素B的IgA抗体的结合配对物”，也称作针对艰难梭菌的毒素B的IgA抗体，表示能够结合至所述IgA的任何分子。作为抗毒素B IgA的结合配对物的实例，我们可以提到天然或重组毒素B、毒素B片段、抗IgA抗体或已知与抗毒素B IgA相互作用的任何其他分子。

天然来源(也称作天然)的毒素B可以在培养细菌艰难梭菌并从细菌裂解物中纯化蛋白之后获得。重组毒素B可以通过本领域技术人员熟悉的技术，通过遗传工程获得。这例如由Anderson BM et al.,1993描述。天然毒素B可以获得自公司如The Native AntigenCompany(Upper Heyford,United Kingdom)。

抗体类型的结合配对物是例如多克隆抗体或单克隆抗体，其制备是本领域技术人员公知的。

作为抗体片段的实例，我们可以提到片段Fab、Fab'、F(ab')2以及scFv(单链可变片段)、dsFv(双链可变片段)。这些功能性片段可以特别地通过遗传工程获得。

由确定抗毒素B IgA水平组成的免疫测定是本领域技术人员公知的半定量或定量测定，优选采用IgA的两种结合配对物。可以将两种配对物之一偶联至标记以形成缀合物或示踪物(tracer)。可以将另一种结合配对物捕获在固体支持物上。然后我们说后者为捕获配对物，前者为检测配对物。优选地，所述捕获配对物是艰难梭菌的毒素B，而所述检测配对物是抗人IgA抗体。

然后所述免疫测定中发出的测量信号与生物样品中抗毒素B IgA的量成比例。

特别地，标记表示包含与结合配对物的基团反应的基团的任何分子，其直接而没有化学修饰，或者在化学修饰之后以便包括这样的基团，所述分子能够直接或间接产生可检测的信号。这些直接检测标记的非穷举列表由以下组成：

·产生例如通过比色法、荧光、发光可检测的信号的酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，

·发色团如荧光化合物、发光化合物、染料，

·放射性分子如³²P、³⁵S或¹²⁵I，

·荧光分子如Alexa染料或藻蓝蛋白，以及

·电化学发光盐如基于吖啶(acridinium)或钌的有机金属衍生物。

还可以使用间接检测系统，例如能够与抗配体反应的配体。然后所述配体对应于标记，与所述结合配对物构成缀合物。

本领域技术人员熟悉配体/抗配体对，例如以下对：生物素/链霉抗生物素蛋白、半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体、糖/凝集素、多核苷酸/多核苷酸补体。

然后抗配体可以通过上文所述的直接检测标记直接检测，或者其本身可以通过另一配体/抗配体对检测，等等。

在某些条件下，这些间接检测系统可以导致信号的放大。本领域技术人员熟悉信号放大的这种技术，并且可以参考申请人较早的专利申请FR 2781802或WO 95/08000。

根据所用的标记的类型，本领域技术人员会添加试剂用于标记的可视化，或者发射通过任何合适类型的测量设备如分光光度计、荧光分光光度计、密度计或高清摄像机可检测的信号。

免疫测定还可以包括本领域技术人员已知的其他步骤，如洗涤步骤和温育步骤。

如本领域技术人员公知的，免疫测定可以是一步或两步测定。简单地说，一步免疫测定包括使测试样品与两种结合配对物同时接触，而两步免疫测定包括一方面使测试样品与第一结合配对物接触，然后使由此形成的分析物-第一结合配对物复合物与第二结合配对物接触。

本发明的方法中使用的参考值S是预先用暴露于细菌艰难梭菌的两群患者获得的值，例如在医院环境中，一群尚未发展或重新发展这样的感染，而另一群已发展或重新发展这样的感染。所述确定是本领域技术人员公知的。其特别地由以下组成：在来自这两个群体的粪便样品中进行与本发明的方法中采用的相同的免疫测定，以及确定测定(信号)值以区分这两个群体。

当参考值S是抗体的数量、滴度或浓度时，采用的免疫测定是定量的，并且来自所述方法的结果给出IgA抗体的数量、滴度或浓度。然后必须利用以前从标准范围建立的数学模型将获得的信号与生物样品中的数量、滴度或浓度关联。这个标准范围会以已知的方式预先获得。简单地说，获得标准范围由以下组成：测量已知的、增加量或浓度的抗毒素B IgA抗体产生的信号，作图曲线给出信号作为数量、滴度或浓度的函数，以及找到尽可能忠实地表示这种关系的数学模型。所述数学模型将用于通过外推确定待测试的生物样品中包含的未知抗毒素B IgA抗体的数量、滴度或浓度。

在本发明的意义上可用的可能包含抗艰难梭菌毒素B的IgA的生物样品是患者的粪便样品。它们可以是粪便本身或直肠灌肠剂。这些样品可以如它们在本发明的方法中使用，或者可以经过预处理，优选后一实施方案。

粪便样品是难以处理的基质。IgA可以包括在由粘液、蛋白质、毒素、颗粒等组成的复合物中。根据一实施方案，将免疫测定中采用的粪便样品预先用酸性样品处理缓冲液处理。酸性样品处理缓冲液表示具有1.5-3(优选2-3)的pH的缓冲液，优选2.5的pH。

作为适合本发明的目的的酸性样品处理缓冲液的实例，我们可以提到盐酸-甘氨酸缓冲液(pH 2.2-3)、磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH 2.2-3)、盐酸-氯化钾缓冲液(pH 2-2.2)和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3)。

粪便样品预处理的持续时间必须是合理的，最多30分钟的持续时间是合适的。根据一实施方案，粪便或直肠灌肠剂样品预处理的持续时间为最多30分钟，优选最多20分钟、15分钟、10分钟、5分钟、3分钟、2分钟、1分钟、45秒、30秒、15秒或10秒。

这样处理的生物样品然后经过分离，特别地通过过滤或沉降，例如离心，然后回收包含所关注的IgA的滤液或上清液，用于本发明的方法的免疫测定。

通常，当生物样品经过酸预处理时，然后在用于免疫测定之前将这样获得的反应混合物中和以再次提高pH，以避免改变用于免疫测定的结合配对物，特别是捕获配对物。出乎意料的是，这样的中和步骤在本发明的方法中不是必需的，因此，根据一实施方案，样品预处理步骤不包括在用于免疫测定之前中和反应混合物的步骤。

“反应混合物中和步骤”表示添加中和溶液，对于待中和的酸性溶液是碱性的，允许pH提高至7左右以不改变免疫测定中采用的结合配对物。在本发明的背景下，这个步骤因此是不必要的。

应当注意免疫测定中常规使用的所有其他缓冲液，如洗涤缓冲液或反应缓冲液，不是中和溶液，因为它们的目的不是将酸性反应混合物的pH带回至7左右。

其他标记可以用于辅助预测风险患者发展或重新发展艰难梭菌感染的易感性。这类标记例如针对艰难梭菌毒素A的IgA抗体。

可以与对确定针对毒素B抗体水平的描述相似地进行针对艰难梭菌毒素A的IgA抗体水平的确定：在粪便样品中，如果必要用酸性样品处理缓冲液预处理，通过进行免疫测定。

正如我们刚才看到的，出乎所有人意料地，由确定生物样品中的IgA水平组成的免疫测定可以在酸性反应混合物中进行。因此，本发明进一步涉及一种通过免疫测定确定可能包含至少一种IgA抗体的患者的生物样品中所述至少一种IgA抗体水平的方法，所述方法包括使用于进行免疫测定的所述至少一种IgA抗体的一种或多种结合配对物与包含用酸性样品处理缓冲液预处理的所述生物样品的酸性反应混合物接触，在其用于免疫测定之前不中和。

换句话说，通过免疫测定确定可能包含至少一种IgA抗体的患者的生物样品中所述至少一种IgA抗体的水平包括或由以下组成：

-提供用酸性样品处理缓冲液预处理的患者的生物样品，

-提供包含所述至少一种IgA抗体的一种或多种结合配对物的免疫测定试剂盒，

-使所述预处理的样品与所述试剂盒中的结合配对物或多种配对物接触，应当理解所述预处理的样品在其与结合配对物或多种配对物接触之前不经历中和，以及

-确定IgA抗体的水平。

在本发明的意义上合适的IgA抗体是针对在酸的存在下不受影响的蛋白质的抗体。事实上，为了所述方法是特异性的，作为IgA抗体的结合配对物，适合至少使用抗体识别的蛋白质或其片段。与预处理的样品接触，因此在酸pH下的这种蛋白质必须承受这种酸性条件。

“在酸的存在下不受影响的蛋白质”表示在酸pH下其三维结构经历变化不大的任何蛋白质。对应于酸变性耐受性的这种稳定性可以通过任何已知方法证实，例如通过DSC(差式扫描量热法)类型的微量热法。简单地说，这种方法由以下组成：强制具有期望pH的介质中的量热计内的蛋白质热变性，以及从进行的测量推导两个参数，即Tm和ΔH。Tm是半经验参数，其对应于50％的蛋白质为天然状态且50％为变性状态的温度。ΔH(焓的变化，或变性的热)是对应于必须提供给蛋白质以获得其完全变性的能量的定量参数。这两个参数与受试蛋白质的固有稳定性直接关联：它们各自的值增加越多，蛋白质的稳定性相对于参考值越大。

为了确定蛋白质的三维结构在酸的存在下是否受到影响，必须确定这种蛋白质在酸pH下和在其免疫稳定性pH下的Tm和/或ΔH。在这个比较实验中，pH是唯一的可变因子。待研究的蛋白质的浓度、加热速率和缓冲液的化学性质必须全部恒定。因此，缓冲剂必须选择具有几个pKa值，提供广泛的缓冲效应，如磷酸盐(1.7-2.9；5.8-8.0)、柠檬酸盐(2.2-6.5)或琥珀酸盐(3.2-5.2；5.5-6.5)，或者使用可以覆盖范围pH3-pH10的tri-缓冲液。为这个比较实验选择的所述酸pH是根据本发明的酸性样品处理缓冲液的pH。当在酸pH下确定的ΔH相对于在蛋白质的免疫稳定性pH下确定的ΔH不相差最多约25％，优选最多约10％时，认为蛋白质的结构在酸的存在下不受影响。如果是已计算的Tm，在酸pH下确定的Tm相对于在研究的蛋白质的免疫稳定性pH下确定的Tm必须不相差最多约25％，优选最多约10％。

在酸的存在下不受影响的蛋白质是本领域技术人员公知的。作为实例，我们可以提到微生物的蛋白质，如细菌和病毒的蛋白质，特别是细菌和病毒结构的蛋白质，除了包膜，例如HCV病毒的核心蛋白，以及毒素如艰难梭菌的毒素A和B。

在预测风险患者发展或重新发展艰难梭菌感染的易感性的方法的背景下上文描述的特征应用于确定这里描述的IgA水平的方法，例如免疫测定本身，酸性样品处理缓冲液的性质，其pH，酸处理之后是否使用通过反应混合物的过滤或沉降分离。

特别地，如上，预处理的持续时间必须是合理的，特别是少于30分钟，与TressU.et al.,2006的教导相反，其推荐来自狗的粪便样品的过夜处理用于定量总IgA和免疫测定之前的中和步骤。

诊断和预后关注且针对在酸的存在下不受影响的蛋白质的所有IgA抗体，包括针对艰难梭菌的毒素B的那些IgA抗体，优选分泌的，适合这种方法的目的。此外，除粪便和直肠灌肠剂以外的生物样品，如粘液、痰、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar wash)、阴道分泌物、阴道灌肠剂、汗液、泪液、唾液、乳汁和初乳，也是合适的。

用于通过免疫测定确定在可能包含至少一种IgA的患者的生物样品中所述至少一种针对在酸的存在下不受影响的蛋白质的IgA抗体(特别是针对艰难梭菌的毒素B的IgA抗体)的水平的试剂盒构成本发明的另一目的，所述试剂盒包含或含有：(i)用于进行免疫测定的所述至少一种IgA抗体的一种或多种结合配对物，以及(ii)酸性样品处理缓冲液，优选pH 2.5，应当理解所述试剂盒不含任何中和溶液。

这种试剂盒的组分和特征如上文定义。

根据另一具体实施方案，所述试剂盒还包含或含有至少一个对照样品，其是包含已知量的针对艰难梭菌毒素B的IgA抗体的样品。

所述试剂盒还可以包含证实结合配对物或多种配对物与靶IgA抗体之间的反应必需的所有化合物，如洗涤缓冲液或者允许可检测信号标记或发射可视化的试剂。

从以下实施例(为了说明目的给出且是非限制性的)以及从图1中会更好地理解本发明，图1示出曲线图，其给出利用仪器获得的RFV信号，对应于免疫测定之前与酸性样品处理缓冲液接触的3个粪便样品(S719-高阳性样品；S709-低阳性样品；和S700-阴性样品)的抗毒素B的IgA抗体水平，作为样品和酸性样品处理缓冲液之间接触的持续时间的函数。

实施例

实施例1：艰难梭菌的重组毒素A和B的制备

编码艰难梭菌的毒素A的tcdA基因和编码艰难梭菌的毒素B的tcdB基因源自参考菌株VPI 10463，toxinotype 0，核糖体型087(毒素A：Swissprot登录号：P16154和毒素B：Swissprot登录号：P18177)。对于每个基因，通过Geneart(Invitrogen)优化整个序列用于在大肠杆菌(E.coli)中表达，并且在N-端侧添加8个组氨酸以允许通过金属-螯合物亲和色谱进行纯化。通过NcoI和BamHI限制性位点将获得的合成基因克隆入pET3d载体(Novagen)中。

将这样构建的表达质粒引入大肠杆菌BL21细菌和衍生物(Stratagene,AgilentTechnologies)。在2x YT培养基(Difco)中，在100μg/mL氨苄西林和10％葡萄糖的存在下，在24℃搅拌下进行培养。一旦其处于指数生长阶段，通过添加1mM的IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)4h来诱导蛋白质的表达。在培养结束时，通过在4℃下以10000g离心30min来收集细菌。将细菌沉淀物在-80℃下冷冻。

将细菌沉淀物置于PBS缓冲液2X(磷酸缓冲盐水)中并裂解。将裂解物在4℃下以3000g离心30min。上清液包含纯化的可溶性蛋白质，重组毒素A或毒素B，取决于最初使用的表达质粒。

通过一步金属-螯合物亲和色谱纯化蛋白质。将离心之后获得的上清液装载在Ni-NTA-琼脂糖树脂(Qiagen)上。洗涤循环之后，在250mM咪唑的存在下洗脱所述蛋白质(毒素A或毒素B)。将蛋白质在50mM磷酸盐、150mM NaCl缓冲液中透析。

实施例2：检测针对毒素B的粪便IgA的免疫测定

利用自动化免疫分析仪(bioMérieux)进行免疫测定。一次性圆锥体用作反应的固相和移液系统。暗盒包含用铝箔覆盖、密封和标记的10个孔(X0-X9)。第一个孔(X0)包含预切部分以便于样品插入。最后一个孔(X9)为光学比色杯，其中测量底物的荧光。中间的孔(X1-X8)中包含分析所需的各种试剂。测定的所有步骤通过仪器自动进行。它们由反应混合物的抽吸/排出的一连串循环组成。

a)圆锥体的敏化和钝化

将圆锥体用300μL的在PBS缓冲液，pH 7.2中稀释至2μg/mL的重组或天然毒素B的溶液敏化。灭活的天然毒素B(Cat.No.CDB-TDL)获得自The Native Antigen Company(Upper Heyford,United Kingdom)。在+18/25℃下用敏化溶液温育约20h之后，将圆锥体清空。然后添加300μL的包含5g/L牛白蛋白的200mM Tris溶液。在+18/25℃下继续钝化过夜。将圆锥体清空，干燥，然后储存在+4℃下直至使用，远离潮湿。

b)样品预处理

使1体积的粪便与3体积的样品处理缓冲液接触(稀释1/4)。这种缓冲液的组成的改进在实施例3中说明。进行手动匀浆，然后在涡旋振荡器中搅拌。这个步骤需要约30秒-2分钟，取决于粪便稠度。将样品以12000g离心5分钟以回收可溶性蛋白质。对这个上清液进行免疫测定，将所述上清液直接沉积在暗盒的孔X1中。

c)免疫测定方法

孔X1包含300μL的样品稀释剂，具有与样品处理缓冲液相同的组成。将200μL的步骤b)中获得的上清液转移至孔X1以进行额外的稀释。一旦圆锥体与样品接触，免疫反应的第一步就开始。这步允许粪便样品上清液中存在或不存在的粪便抗毒素B IgA特异性结合至圆锥体上吸附的毒素B。在37℃下温育4分钟之后，通过用200mM Tris缓冲液pH7.8、NaCl 300mM、20 0.25％洗涤去除未结合的组分。在第二步中，将圆锥体用在10mM磷酸盐缓冲液(包含300mM的NaCl和5g/L的牛血清白蛋白)中包含约0.5μg/mL的偶联至碱性磷酸酶的抗人IgA小鼠IgG(bioMérieux)的缀合物溶液温育。孔X5包含400μL的这种溶液，仍然在37℃下圆锥体抽吸/排出5分钟。所述第二步导致在粪便抗毒素B IgA和偶联至碱性磷酸酶的抗IgA缀合物之间形成复合物。这步之后是3个连续洗涤操作以去除未固定的化合物。

在最后的检测步骤中，抽吸底物4-甲基伞形酮基磷酸酯然后在圆锥体中排出；缀合物的酶催化这种底物的水解反应至4-甲基伞形酮，在450nm处测量其发射的荧光。荧光信号的值(RFV＝相对荧光值)与样品中存在的粪便抗毒素B IgA的浓度成比例。

下文表1示出利用缓冲液R1作为样品处理缓冲液通过自动化仪器确定的荧光信号(RFV＝相对荧光值)。这种缓冲液形成检测粪便中的毒素A和B的艰难梭菌毒素A&B试剂盒(Cat.No.30118,bioMérieux)的部分。如试剂盒的说明书所述，其pH为7.2。其用于从人粪便提取毒素。使用的粪便样品获得自咨询department of Dr.RobertSpencer,Health Protection Agency Regional Laboratory,Bristol,United Kingdom怀疑的艰难梭菌感染的患者。

表1.人粪便中粪便IgA的检测。

Neg＝阴性；Pos＝阳性；ND＝未确定

通过比较每个样品在测定的检测限测量的RFV信号解释免疫测定的结果，其定义如下：平均背景噪声(用缓冲液测量的RFV信号)+3标准差。认为这个检测限以上的信号为阳性：存在抗毒素B IgA抗体。认为这个检测限以下的信号为阴性：不存在抗毒素B IgA抗体。

重要的是注意具有114RFV信号的样品S709分类为阳性，而具有91RFV信号的样品S713分类为阴性。绝对值接近的两个信号导致不同的生物学解释：这种情况并不令人满意。因此其需要改进。

实施例3：粪便IgA提取的优化

实施例2中使用的适合提取毒素A和B的缓冲液R1表明可以改进粪便IgA的分析。因此利用实施例2中表征的粪便样品测试另一样品处理缓冲液，具有与之前相同的处理时间(30s和2min)。这种缓冲液是pH 2.5的盐酸-甘氨酸缓冲液(1M甘氨酸pH 2.5)。下文表2示出通过自动化仪器确定的荧光信号(RFV＝相对荧光值)。利用其上固定重组毒素B的圆锥体获得这个实验中示出的结果。

表2.用不同缓冲液从人粪便提取的粪便IgA的检测。酸缓冲液＝1M甘氨酸pH 2.5以及实施例2中描述的缓冲液R1。

Pos＝阳性；Neg＝阴性

1M甘氨酸酸性缓冲液pH 2.5使得可以显著增加对阳性样品获得的RFV信号，比用缓冲液R1多3-7倍。选择酸pH的提取溶液用于剩余实验。

实施例4：样品和样品处理缓冲液之间接触时间的研究

利用高阳性样品(S719)、低阳性样品(S709)和阴性样品(S700)研究样品和酸性样品处理缓冲液(实施例3中的条件)之间接触的持续时间。结果在图1中示出。阴性样品(S700)不存在信号的显著减少。阳性样品表现出信号减少。30分钟的温育之后，对于S719仍有91％的信号，并且对于S709仍有72％的信号。60分钟之后，对于S719仍有82％的信号，并且对于S709仍有63％的信号。这些结果表明在1M甘氨酸缓冲液pH 2.5的存在下温育60min引起样品中存在的抗毒素B IgA的量显著减少。在弱阳性样品的情况下，最好不超过15min以便不损失超过10％的信号。如果与提取缓冲液接触的持续时间过度延长，则这样的样品可以被检测为“阴性”。对于剩余实验，我们使用约30秒-2分钟的接触时间。

实施例5：重组毒素B和天然毒素B用于通过免疫测定检测抗毒素BIgA的比较

我们比较了当使用重组毒素B和天然毒素B制备捕获相(吸附在圆锥体上)时获得的荧光信号。将两种类型的毒素B以相同浓度(2μg/mL)固定在固相上。结果在下文表3中示出。样品SP023和SP池获得自Professor M.Delmée,Clostridium difficile NationalReference Center,Catholic University of Louvain,Brussels,Belgium。

重复上文实施例3中描述的方法。

除了样品S709，对所有样品获得的信号在固相具有天然毒素时比重组毒素强。对于阴性样品，增加可以忽略不计(+37至+67RFV)，而对于4个阳性样品中的3个，增加非常大(+640至+1797RFV)。因此，使用天然毒素B用于捕获允许更好地区分阳性和阴性样品。

根据表3中示出的结果，当使用重组毒素B时阳性阈值固定在200RFV，而当使用天然毒素B时阳性阈值固定在250RFV。

表3.通过重组毒素B或天然毒素B检测粪便抗毒素B IgA。根据实施例3，粪便样品的预处理在1M甘氨酸酸性缓冲液pH 2.5的存在下进行。

Pos＝阳性；Neg＝阴性

实施例6：研究具有多次再感染的患者中的粪便IgA和确定参考值S

这个实施例中使用的粪便样品获得自已重复感染艰难梭菌的患者，称作具有多次再感染的患者。这些患者咨询Clinical Microbiology Division,在the MedicalDepartment of the Sir Mortimer B.Davis-Jewish General Hospital,in Montreal,Quebec,Canada。根据实施例3中的条件，粪便样品的预处理在1M甘氨酸酸性缓冲液pH 2.5的存在下进行。将不同类型的毒素B以相同浓度(2μg/mL)全部固定在固相上。根据实施例2中描述的方法利用实施例1中描述的毒素通过免疫测定研究针对毒素B的粪便IgA以及针对毒素A的粪便IgA。结果在表4中示出。

表4.研究具有多次再感染的患者粪便中的针对毒素B和针对毒素A的粪便IgA。

NAv＝不可用，由于样品体积不足，测试不可以进行。

在测试的8个中，在具有多次再感染的3个患者中，可以检测到针对毒素B的粪便IgA(MR002,MR007,MR008)。对于所有这些患者，获得的信号在250RFV的测定阳性阈值之上。此外，这些结果独立地证实使用重组毒素B的免疫测定比使用天然毒素B的方法较不灵敏：患者MR007未检测为阳性，并且对于200RFV的阈值，患者MR002在阳性的界限，具有191RFV的信号。

患者的临床随访表明所有患者MR001-MR008在他们咨询并获得这个实施例中使用的样品之后存在至少一次再感染。我们的测定表明这些患者中的一些(MR002,MR007,MR008)具有抗毒素B IgA抗体，在一些情况下抗毒素AIgA抗体，或者没有这两种类型的抗体。可以得出结论，这些患者具有的粪便抗毒素B IgA抗体的滴度不足以保护免受这样的再感染。因此这组患者构成具有增加的发展或重新发展艰难梭菌感染风险的患者的组。

根据临床图片，患者MR009最初分类为具有多次再感染的患者组。补充生物学研究表明这事实上是不合理分类。第一次测定之后监测这个患者3个月。尽管几次尝试，通过培养研究细菌艰难梭菌通常证实阴性。未观察到再感染。因此应当考虑患者MR009受到保护免于再感染。这个患者具有抗毒素B IgA(1001RFV)和抗毒素A IgA(462RFV)。因此这个患者构成没有增加的发展或重新发展艰难梭菌感染风险的患者的组。

基于对这些患者组获得的所有这些结果，我们能够定义参考值S。对于给定的捕获抗原，以这样的方式选择参考值S：对具有多次再感染的患者MR001-MR008获得的所有信号低于它，而对患者MR009的那些高于它。

对于抗毒素B抗体，当天然毒素B用于捕获时，参考值S为870-1000RFV，或者固定在约930RFV。当重组毒素B用于捕获时，其为200-600RFV，或者固定在约400RFV。对于抗毒素A抗体，当重组毒素A用于捕获时，参考值S为160-460RFV，或者固定在约310RFV。

实施例7：研究具有疑似的艰难梭菌感染的毒素A和B阴性患者中的粪便IgA

这个实施例中使用的粪便样品获得自存在怀疑的艰难梭菌感染的患者，在department of Dr.Robert Spencer,Health Protection Agency Regional Laboratory,Bristol,United Kingdom。利用试剂盒艰难梭菌GDH(Cat.No.30125,bioMérieux)和艰难梭菌毒素A和B(Cat.No.30118,bioMérieux)表征我们拥有的样品。根据实施例2、3和6中描述的方案利用天然毒素B和重组毒素A进行粪便IgA的研究。

实施例7中选择用于研究的样品全部是毒素A和毒素B阴性的，以及GDH阴性的(表5)。这个选择包括两个亚组的患者。在第一亚组中，这两个测定是阴性的，因为患者从未与细菌艰难梭菌接触。导致怀疑感染艰难梭菌的症状是由于其他原因。第二亚组对应于事实上已与细菌接触但能够消除它或限制它的增殖并因此从感染恢复的患者。我们没有允许我们区分这两个亚组的临床数据。相反，如果我们检测患者粪便中的抗毒素B IgA和/或抗毒素AIgA，他们无疑是已有症状性感染的患者或者艰难梭菌的携带者。因此，我们显示测试的12个中的6个患者(50％)具有实施例6中定义的参考值S以上的抗毒素B抗体水平。在这6个患者中，仅5个还具有实施例6中定义的参考值S以上的抗毒素A抗体(表5)。因此，如果仅研究抗毒素A IgA，患者SP252不会被检测为具有抗艰难梭菌分泌抗体。

对这个群体获得的结果表明检测抗毒素B IgA比检测抗毒素A IgA更灵敏。

表5.研究来自具有怀疑的艰难梭菌感染的患者的粪便中针对毒素B和毒素A的粪便IgA。

Pos＝阳性；Neg＝阴性

实施例8：研究具有艰难梭菌感染的患者中的粪便IgA和预测再感染

这个实施例中使用的粪便样品获得自具有证实的艰难梭菌感染的患者。这些患者出现在Clinical Microbiology Division,在the Medical Department of the SirMortimer B.Davis-Jewish General Hospital,in Montreal,Quebec,Canada。只要可能，对每个患者收集两个连续的粪便样品，相隔10-35天。第一个样品和第二个之间的天数在表6中示出。对于所有患者，对来自第一个粪便样品的提取物进行细菌艰难梭菌的遗传物质的PCR研究。这个研究证实此研究中包括的所有患者为阳性，因此证实艰难梭菌感染的临床怀疑。

根据实施例2、3和6中描述的方案利用天然毒素B进行粪便IgA的研究。在实施例6中，我们获得的被确定高于参考值S(930RFV，当天然毒素B用于捕获时)的信号的样品被认为是阳性，并且信号低于这个值的那些为阴性。结果在表6中示出。

表6.研究具有艰难梭菌感染的患者的粪便中针对毒素B的粪便IgA。

Pos＝阳性；Neg＝阴性；NAv＝不可用，由于样品体积不足，测试不可以进行；NA＝不适用。

为了评价再感染的风险，研究在认作原发感染的感染艰难梭菌之后10-38天(优选15-25天)获得的粪便样品中的针对毒素B的粪便IgA是有用的。

如果粪便样品包含参考值S以上的抗毒素B IgA水平，则患者是再感染低风险的：他在认作原发感染的感染艰难梭菌发作之后最多会具有0或1次再感染。

如果粪便样品包含参考值S以下的抗毒素B IgA水平，则患者是再感染高风险的：他在认作原发感染的感染艰难梭菌发作之后会具有2次或更多次再感染。

通过应用这个规则做出的预测在表6中的“再感染的风险”列中示出，其还示出在这些相同患者中实际观察到的再感染次数。应该注意到预测和临床观察之间完全一致。

对于3个患者(CD001、CD002和CD005)，在第一个之后10-35天不可以获得第二个样品。但是，分析显示获得自这些患者的第一个粪便样品包含高水平的粪便抗毒素B IgA。

参考文献

-Bartlett,J.G.,2002,N.Engl.J.Med.346(5):334-339

-Bauer M.P.et al.,2011,Lancet,14:63-73

-Eyre D.W.et al.,2012,Clinical Infectious Diseases,55(S2):77-87

-Freeman J.,2010,Clin.Microbiol,3:529-549

-Garey K.W.et al.,2008,Journal of Hospital Infection,70:142-147

-Johnson S.et al.,1992,JID,166:1287-1294

-Kelly C.P.and Lamont.J.T.,2008,N Engl.J.Med.,359:1932-1940

-Kuijper E.J.et al.,2006,Clinical Microbiology and InfectiousDiseases,CMI,12(S6):2-18

-Tress U.et al.,2006,AJVR,67(10):1756-1759

-Warny M.et al.,1994,Infection and Immunity,62(2):384-389