一种同时测定烟草中常用除草剂残留量的方法

摘要

本发明公开了一种同时测定烟草中常用除草剂残留量的方法，该方法为：烟草样品中目标物经酸化乙腈提取，用弗罗里硅土固相萃取小柱净化，体积比位3:7的丙酮/环己烷的混合液洗脱，洗脱液浓缩后用三甲基硅烷化重氮甲烷衍生化，再利用在线凝胶渗透色谱‑气相色谱‑串联质谱联用仪进行检测。与标准方法相比，合并了四个标准方法的检测指标，并加入敌草索，本发明显著提高检测工作效率同时，具有较高的灵敏度，抗干扰能力，最大程度上保证了样品的高回收率和最佳的重现性。

说明书

技术领域

本发明属于烟草农药残留检测领域，涉及烟草中农药残留量检测技术，尤其涉及烟草中常用除草剂残留量的测定方法，具体是检测烟草中麦草畏、2,4-滴、氟乐灵、氟草胺、2,4,5-涕、异恶草酮、双苯酰草胺、甲草胺、敌草胺、敌草索、仲丁灵、异丙乐灵、二甲戊灵、氟节胺、除草醚和精吡氟禾草灵共16种除草剂的残留量。

背景技术

烟草是我国重要的经济作物, 近年来，除草剂的施用极大地降低了劳动强度、有效提高了农业生产效率，对烟叶产量和品质起到了积极作用。随着除草剂使用范围的扩大，其残留对人类健康和环境造成的危害越来越受到人们的关注，尤其在水环境中的残留，在农田生态系统中会迁移，引起土壤、地下水、大气等污染。有研究表明，苯氧羧酸类等除草剂可以引起人类软组织恶性肿瘤，对动物体也表现出胎盘毒性。

国际烟草科学研究合作中心(CORESTA) 农用化学品咨询委员会(ACAC)于2013年提出了烟草中120种农药的指导性残留限量( Guidance Residue Levels，GRLs)，其中规定了属于6大类别15种除草剂的指导性残留限量。分别是：1）苯氧羧酸类3种（麦草畏0.2 mg/kg、2,4-滴0.2 mg/kg和2,4,5-涕0.05 mg/kg）；2）酰胺类2种（双苯酰草胺0.05 mg/kg和甲草胺0.1 mg/kg）；3）二硝基苯胺类6种（仲丁灵5 mg/kg、异丙乐灵0.07 mg/kg、二甲戊灵5mg/kg、氟节胺0.06 mg/kg、氟草胺0.06 mg/kg和氟乐灵0.1 mg/kg）；4）二苯醚类1种（除草醚0.02 mg/kg）；5）芳氧苯氧丙酸酯类1种（精吡氟禾草灵1.0 mg/kg）；6）有机杂环类2种（异恶草酮0.2 mg/kg和敌草索0.5 mg/kg）。

目前，完成上述15种除草剂的检测需使用4个行业标准：1）“YC/T 181-2004 烟草及烟草制品 有机氯除草剂农药残留量的测定 气相色谱法，可检测麦草畏、2,4-滴和2,4,5-涕；2）“YC/T 179-2004 烟草及烟草制品 酰胺类除草剂农药残留量的测定 气相色谱法，可检测甲草胺、双苯酰草胺和敌草胺”；3）“YC/T 405.3-2011 烟草及烟草制品 多种农药残留量的测定 第3部分：气相色谱质谱联用及气相色谱法，可检测甲草胺、氟草胺、仲丁灵、氟节胺、异丙乐灵、除草醚、氟乐灵”；4）“YC/T 405.1-2011 烟草及烟草制品 多种农药残留量的测定 第1部分：高效液相色谱-串联质谱法，可检测异恶草酮、双苯酰草胺、精吡氟禾草灵”。文献 “陈晓水, 边照阳, 唐纲岭,等. 气相色谱-串联质谱技术分析烟草中的132种农药残留[J]. 色谱, 2012, 30(10):1043-1055.”只能完成其中10种除草剂残留检测（氟乐灵、氟草胺、异恶草酮、甲草胺、敌草索、异丙乐灵、二甲戊灵、氟节胺、双苯酰草胺、除草醚）。现有的检测标准和文献不能一个方法同时测定烟草中上述规定限量的15种除草剂残留，存在检测效率低、操作繁琐及耗时长的问题，因此，建立同时测定烟草中上述规定限量的15种除草剂残留的方法迫在眉睫。

本发明提及的16种除草剂，其中15种分列于上述4项烟草行业标准中，增加敌草索的检测指标，更为全面覆盖当前国内外对烟草中除草剂残留量检测指标要求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种同时测定烟草中常用除草剂残留量的方法，该方法可同时测定烟草中麦草畏、2,4-滴、氟乐灵、氟草胺、2,4,5-涕、异恶草酮、双苯酰草胺、甲草胺、敌草胺、敌草索、仲丁灵、异丙乐灵、二甲戊灵、氟节胺、除草醚和精吡氟禾草灵的残留量，更为全面覆盖当前国内外对烟草中除草剂残留量检测指标要求，以解决现有技术中存在的问题。

本发明采取的技术方案为：一种同时测定烟草中常用除草剂残留量的方法，其特征在于：烟草样品中目标物经酸化乙腈提取，用弗罗里硅土固相萃取小柱净化，丙酮/环己烷(体积比3:7)的混合液洗脱，洗脱液浓缩后用三甲基硅烷化重氮甲烷衍生化，再利用在线凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱联用仪进行检测。

一种同时测定烟草中常用除草剂残留量的方法，该方法具体的操作步骤如下:：

（1）内标溶液的配制:配制丙草胺浓度为10 μg/mL的丙酮内标溶液；

（2）衍生剂：2 mol/L三甲基硅烷化重氮甲烷正己烷溶液；

（3）除草剂目标物的提取: 称取2.00 g烘干磨好的烟叶样品，加入2 mL超纯水润湿10min，依次加入2 g氯化钠、50 μL步骤(1)配制的内标溶液、10 mL 含1 %乙酸的乙睛溶液，以2500 rpm涡旋震荡5 min，再以5000 r/min离心5 min，待净化；

（4）弗罗里硅土固相萃取柱活化：用5 mL丙酮/环己烷混合液活化柱子，弃去流出液；

（5）弗罗里硅土固相萃取柱净化: 精确移取2 mL步骤（3）的提取液至步骤（4）活化后的固相萃取柱中，用10 mL丙酮/环己烷混合液洗脱小柱，丙酮/环己烷体积比3:7，收集洗脱液至具盖玻璃试管中；

（6）洗脱液浓缩: 将步骤（5）得到的洗脱液在40 ℃水浴氮吹浓缩至1mL，待衍生化；

（7）衍生化：在步骤（6）浓缩液中加入100 μL步骤（2）的衍生剂，具盖密封涡旋混匀，放置于40 ℃水浴中进行衍生化反应30 min，40 ℃氮吹浓缩至近干，精确加入体积比3:7为1mL丙酮/环己烷，涡旋混匀，过0.45μm有机相滤膜，待GPC-GC-MS/MS检测；

（8）标准储备液配制: 分别称取10 mg的麦草畏、2,4-滴、氟乐灵、氟草胺、2,4,5-涕、异恶草酮、双苯酰草胺、甲草胺、敌草胺、敌草索、仲丁灵、异丙乐灵、二甲戊灵、氟节胺、除草醚和精吡氟禾草灵标准品，用丙酮定容于10 mL容量瓶中，制得1000 μg/mL的标准储备液，-20℃保存；

（9）混合标准溶液配制：取步骤（8）中标准储备液各100 μL至10 mL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，制得10 μg/mL的混合标准溶液，2~8 ℃保存；

（10）空白烟草样品基质工作溶液的配置：取步骤（9）的混合标准溶液，以不同的体积加入步骤（6）待衍生化的空白烟叶的萃取基质中，按步骤（7）进行衍生化，制得不同浓度的16种除草剂烟草基质标准工作溶液，涡旋混匀，过0.45μm有机相滤膜，待GPC-GC-MS/MS检测；

(11) GPC-GC-MS/MS测定：将步骤（7）中样品提取液和步骤（10）中的基质混合标准溶液，注入GPC-GC-MS/MS进行测定；

（12）结果计算：按内标法以相对峰面积对其相应浓度进行回归分析，计算出样品待测液中16种除草剂的含量。

优选的，上述步骤（11）中GPC测定时的采用的条件为：色谱柱为Shodex CLNpakEV-200( 2.1 mm x 150 mm），流动相为丙酮-环己烷混合溶液，丙酮和环己烷体积比为3:7，流速为0.1 mL/min，柱温为40 ℃，进样量为10 µL，目标物的收集片段为3.46~3.57 min。

优选的，上述步骤（11）中GC-MS/MS测定时采用的条件为：色谱柱为惰性石英毛细管：预柱(5 m x 0.53 mm)、捕集柱为DB-5 MS柱（5 m x 0.25 mm x 0.25 µm）、分离柱为DB-5MS柱(25 m x 0.25 mm x 0.25 µm)；PTV进样模式；进样口升温程序：120 ℃（保持5 min），以100 ℃/min升至250 ℃（保持30 min）；色谱柱升温程序:82 ℃（保持5 min），以8 ℃/min升至280 ℃（保持5 min），总运行时间为30 min；电子轰击离子源(EI)；电子能量:70 eV；离子源温度: 230 ℃；接口温度:280 ℃；溶剂延迟时间:12 min；检测器电压：1.0 KV；碰撞气流速：氦气1.5 mL/min；数据扫描方式:正离子；测定方式：选择反应监测方式(MRM)。

优选的，上述步骤（11）中GPC-GC/MSMS测定具体操作为：取烟草提取液和不同浓度的麦草畏、2,4-滴、氟乐灵、氟草胺、2,4,5-涕、异恶草酮、双苯酰草胺、甲草胺、敌草胺、敌草索、仲丁灵、异丙乐灵、二甲戊灵、氟节胺、除草醚和精吡氟禾草灵的空白烟草基质混合标准溶液，注入GPC-GC-MS/MS进行测定，按内标法以相对峰面积对其相应浓度进行回归分析，计算出样品待测液中麦草畏、2,4-滴、氟乐灵、氟草胺、2,4,5-涕、异恶草酮、双苯酰草胺、甲草胺、敌草胺、敌草索、仲丁灵、异丙乐灵、二甲戊灵、氟节胺、除草醚和精吡氟禾草灵的含量。

本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明效果如下：

（1）本发明能够对4个标准方法的检测指标进行测定，并加入了敌草索，使检测种达到16种，满足烟草中大部分除草剂检测要求，减少了独立检测每种除草剂的工序和准备，大大降低了检测成本；

（2）本发明采用1%的乙酸乙腈作为提取溶剂，可促使目标物与基质分离，尤其提高苯氧羧酸类除草剂的稳定性，增加了回收率；

（3）本发明提取液经弗罗里硅土固相萃取柱净化，去除电负性的醇类和色素等干扰杂质，如甾醇类物质；再结合在线凝胶渗透色谱进一步净化，去除了大分子的脂类和色素，得到较干净的上机溶液，各种目标物的峰形尖锐对称性好，且减轻对色谱柱和离子源的污染；由图4、图5 SCAN谱图的NIST05谱库检索结果可知，主要的干扰杂质为醇类物质；

（4）本发明选用在线凝胶渗透色谱的流动相丙酮/环己烷（体积比3:7）混合液作为固相萃取柱的洗脱液，仅10 mL洗脱液就能洗脱全部的目标物，且洗脱液易挥发体积少，使得前处理操作更为简便；

（5）本发明选用三甲基硅烷化重氮甲烷为衍生剂，对苯氧羧酸类除草剂的麦草畏、2,4-滴和2,4,5-涕进行衍生化，同时衍生剂的加入并未改变其他种类除草剂的化学性质和结构，实现了16种不同种类除草剂的同时测定。

（6）本发明选用丙草胺作内标，准确的对16种除草剂进行定量，提高了方法的准确性，还有效降低基质干扰和前处理过程中引起的误差；

（7）本发明结合在线GPC净化的GC-MS分析技术和手段，其在线GPC在富含脂肪、色素、生物碱、聚合物等大分子的样品分离净化方面具有明显的优势,扩展的二级质谱(MS/MS)相对一级质谱(MS)，其抗干扰能力更强,适用于烟草等复杂基质样品的残留农药快速筛查与确证；

（8）与以往相比，检测工作时间缩短为原来的四分之一，检测成本降为原来的三分之一，检测工作效率大大提高。本发明的方法具有简便、快速、灵敏、准确的优点。

附图说明

图1为16种除草剂标准品MRM谱图；

图2为烟草空白样本添加16种除草剂标准品MRM谱图；

图3为烟草空白样本MRM谱图；

图4为烟草提取液SCAN谱图；

图5为烟草提取液用弗罗里硅土固相萃取柱净化SCAN谱图。

具体实施方式

下面结合附图及具体的实施例对本发明进行进一步介绍。

实施例1: 一种同时测定烟草中常用除草剂残留量的方法，其特征在于：烟草样品中目标物经酸化乙腈提取，用弗罗里硅土固相萃取小柱净化，丙酮/环己烷(体积比3:7)的混合液洗脱，洗脱液浓缩后用三甲基硅烷化重氮甲烷衍生化，再利用在线凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱联用仪进行检测。

一种同时测定烟草中常用除草剂残留量的方法，该方法具体的操作步骤如下:：

（1）内标溶液的配制:配制丙草胺浓度为10 μg/mL的丙酮内标溶液；

（2）衍生剂：2 mol/L三甲基硅烷化重氮甲烷正己烷溶液；

（3）除草剂目标物的提取: 称取2.00 g烘干磨好的烟叶样品，加入2 mL超纯水润湿10min，依次加入2 g氯化钠、50 μL步骤(1)配制的内标溶液、10 mL 含1 %乙酸的乙睛溶液，以2500 rpm涡旋震荡5 min，再以5000 r/min离心5 min，待净化；

（4）弗罗里硅土固相萃取柱活化：用5 mL丙酮/环己烷混合液活化柱子，弃去流出液；

（5）弗罗里硅土固相萃取柱净化: 精确移取2 mL步骤（3）的提取液至步骤（4）活化后的固相萃取柱中，用10 mL丙酮/环己烷混合液洗脱小柱，丙酮/环己烷体积比3:7，收集洗脱液至具盖玻璃试管中；

（6）洗脱液浓缩: 将步骤（5）得到的洗脱液在40 ℃水浴氮吹浓缩至1mL，待衍生化；

（7）衍生化：在步骤（6）浓缩液中加入100 μL步骤（2）的衍生剂，具盖密封涡旋混匀，放置于40 ℃水浴中进行衍生化反应30 min，40 ℃氮吹浓缩至近干，精确加入体积比3:7为1mL丙酮/环己烷，涡旋混匀，过0.45μm有机相滤膜，待GPC-GC-MS/MS检测；

（8）标准储备液配制: 分别称取10 mg的麦草畏、2,4-滴、氟乐灵、氟草胺、2,4,5-涕、异恶草酮、双苯酰草胺、甲草胺、敌草胺、敌草索、仲丁灵、异丙乐灵、二甲戊灵、氟节胺、除草醚和精吡氟禾草灵标准品，用丙酮定容于10 mL容量瓶中，制得1000 μg/mL的标准储备液，-20℃保存；

（9）混合标准溶液配制：取步骤（8）中标准储备液各100 μL至10 mL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，制得10 μg/mL的混合标准溶液，2~8 ℃保存；

（10）空白烟草样品基质工作溶液的配置：取步骤（9）的混合标准溶液，以不同的体积加入步骤（6）待衍生化的空白烟叶的萃取基质中，按步骤（7）进行衍生化，制得不同浓度的16种除草剂烟草基质标准工作溶液，涡旋混匀，过0.45μm有机相滤膜，待GPC-GC-MS/MS检测；

(11) GPC-GC-MS/MS测定：将步骤（7）中样品提取液和步骤（10）中的基质混合标准溶液，注入GPC-GC-MS/MS进行测定；

（12）结果计算：按内标法以相对峰面积对其相应浓度进行回归分析，计算出样品待测液中16种除草剂的含量。

优选的，上述步骤（11）中GPC测定时的采用的条件为：色谱柱为Shodex CLNpakEV-200( 2.1 mm x 150 mm），流动相为丙酮-环己烷混合溶液，丙酮和环己烷体积比为3:7，流速为0.1 mL/min，柱温为40 ℃，进样量为10 µL，目标物的收集片段为3.46~3.57 min。

优选的，上述步骤（11）中GC-MS/MS测定时采用的条件为：色谱柱为惰性石英毛细管：预柱(5 m x 0.53 mm)、捕集柱为DB-5 MS柱（5 m x 0.25 mm x 0.25 µm）、分离柱为DB-5MS柱(25 m x 0.25 mm x 0.25 µm)；PTV进样模式；进样口升温程序：120 ℃（保持5 min），以100 ℃/min升至250 ℃（保持30 min）；色谱柱升温程序:82 ℃（保持5 min），以8 ℃/min升至280 ℃（保持5 min），总运行时间为30 min；电子轰击离子源(EI)；电子能量:70 eV；离子源温度: 230 ℃；接口温度:280 ℃；溶剂延迟时间:12 min；检测器电压：1.0 KV；碰撞气流速：氦气1.5 mL/min；数据扫描方式:正离子；测定方式：选择反应监测方式(MRM)。

优选的，上述步骤（11）中GPC-GC/MSMS测定具体操作为：取烟草提取液和不同浓度的麦草畏、2,4-滴、氟乐灵、氟草胺、2,4,5-涕、异恶草酮、双苯酰草胺、甲草胺、敌草胺、敌草索、仲丁灵、异丙乐灵、二甲戊灵、氟节胺、除草醚和精吡氟禾草灵的空白烟草基质混合标准溶液，注入GPC-GC-MS/MS进行测定，按内标法以相对峰面积对其相应浓度进行回归分析，计算出样品待测液中麦草畏、2,4-滴、氟乐灵、氟草胺、2,4,5-涕、异恶草酮、双苯酰草胺、甲草胺、敌草胺、敌草索、仲丁灵、异丙乐灵、二甲戊灵、氟节胺、除草醚和精吡氟禾草灵的含量。

实施例2：烟草样品中16种除草剂残留量的检测

1.仪器与试剂:

在线凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱联用系统(Online GPCGCMS/MS系统)(日本岛津公司),包括SIL20ADvp 自动进样器、ShodexEV200A凝胶渗透色谱柱、CEO20ASvp柱温箱、SPD20Avp紫外检测器、QP2010Plus气相色谱仪、TQ8040型质谱联用仪、PTV2010大体积进样器，X-22R高速冷冻离心机（美国Allegra公司）,旋涡振荡器(美国TAIBOYS公司)，AL204分析天平(美国Mettler公司)，TurboVap II 氮吹仪(瑞典Biotage公司)。

乙腈（色谱纯）、丙酮（色谱纯）、环己烷（色谱纯）、氯化钠（农残级）、乙酸（色谱纯）；实验用水均为Milipore-Q超纯水；衍生剂：2 mol/L三甲基硅烷化重氮甲烷正己烷溶液（北京百灵威）。

标准品：麦草畏、2,4-滴、氟乐灵、氟草胺、2,4,5-涕、异恶草酮、双苯酰草胺、甲草胺、敌草胺、敌草索、仲丁灵、异丙乐灵、二甲戊灵、氟节胺、除草醚、精吡氟禾草灵及丙草胺（内标）,（纯度大于98.0%，德国DR公司）。

标准储备液配制: 分别称取10 mg的麦草畏、2,4-滴、氟乐灵、氟草胺、2,4,5-涕、异恶草酮、双苯酰草胺、甲草胺、敌草胺、敌草索、仲丁灵、异丙乐灵、二甲戊灵、氟节胺、除草醚和精吡氟禾草灵的标准品，用丙酮定容于10 mL容量瓶中，制得1000 μg/mL的标准储备液，-20 ℃保存；

混合标准溶液配制：取上述标准储备液各100 μL至10 mL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，制得10 μg/mL的16种除草剂混合标准溶液，2~8 ℃保存

内标溶液的配制:按上述方法配制丙草胺浓度为10 μg/mL的丙酮内标溶液，2~8 ℃保存；

2. 样品处理:

（1）除草剂目标物的提取: 称取2.00 g烘干磨好的烟叶样品，加入2 mL超纯水润湿10min，依次加入2 g氯化钠、50 μL内标溶液、10 mL 含1 %乙酸的乙睛溶液，以2500 rpm涡旋震荡5 min，再以5000 r/min离心5 min，提取液待净化；

（2）弗罗里硅土固相萃取小柱活化：用5 mL丙酮/环己烷（体积比3:7）混合溶液活化柱子，弃去流出液；

（3）弗罗里硅土固相萃取小柱净化: 精确移取2 mL提取液至活化后的固相萃取柱中，用10 mL丙酮/环己烷（体积比3:7）混合液洗脱小柱，收集洗脱液至具盖玻璃试管中；

4）洗脱液浓缩: 将洗脱液在40 ℃水浴的氮吹仪中浓缩至约1 mL；

（5）衍生化：在浓缩液中加入100 μL衍生剂，具盖密封涡旋混匀，放置于40 ℃水浴中进行衍生反应30 min，在40 ℃氮吹浓缩至近干，加入1mL丙酮/环己烷（体积比3:7）混合液，涡旋混匀，过0.45 μm有机相滤膜，待GPC-GC-MS/MS检测；

3.在线凝胶渗透色谱-气相色谱一串联质谱条件( GPC-GC-MS/MS)测定：

（1）在线GPC条件：色谱柱为Shodex CLNpak EV-200( 2.1 mm x 150 mm）；流动相为丙酮-环己烷(体积比为3:7)混合溶液；流速为0.1 mL/min；柱温为40 ℃；载气吹扫0.1min；进样量为10 µL；目标物的收集片段为3.46~3.57 min。

（2）GC-MS/MS条件：色谱柱为惰性石英毛细管：预柱(5 m x 0.53 mm)、捕集柱为DB-5 MS柱（5 m x 0.25 mm x 0.25 µm）、分离柱为DB-5MS柱(25 m x 0.25 mm x 0.25 µm)；PTV进样模式；进样口升温程序：120 ℃（保持5 min），以100 ℃/min升至250 ℃（保持30min）；色谱柱升温程序:70 ℃（保持5 min），以8 ℃/min升至280 ℃（保持5 min），总运行时间为30 min；电子轰击离子源(EI)；电子能量:70 eV；离子源温度: 230 ℃；接口温度:280℃；溶剂延迟时间:12 min；检测器电压：1.0 KV；碰撞气流速：氦气1.5 mL/min；数据扫描方式:正离子；测定方式：选择反应监测方式(MRM)，主要质谱参数见表1。

表1 16种除草剂及内标的保留时间及质谱参数

序号中文通用名英文名称保留时间（min）定量离子对（m/z）碰撞能量(v)定性离子对（m/z）碰撞能量(v)1麦草畏Dicamba12.24203>18815203>1751422,4-滴2,4-D14.48199>15612199>125153氟乐灵Trifluralin15.16306>26415264>160104氟草胺Benfluralin15.35292> 26410292>1602152,4,5-涕2,4,5-T17.48233>19025233>159186异恶草酮Clomazone18.85204>10718125> 89157甲草胺Alachlor19.17188>16010160>132108敌草索Chlorthal-dimethyl19.65331> 30110301>223209仲丁灵Butralin21.46266>22010266>1901510异丙乐灵Isopropalin22.22280>23810280>1801511二甲戊灵Pendimethalin22.49252>16212252>191812氟节胺Flumetralin23.10143> 10720143>1082013双苯酰草胺Diphenamid24.23239>1678167>1651514敌草胺Napropamid25.46271>12810128>722015除草醚Nitrofen28.13283>16225283>2021516精吡氟禾草灵Fluazifop-butyl28.38282>9115383>28210IS丙草胺Pretilachlor20.78238>17620162>13225

4.基质匹配标准曲线和最低检出限

(1) 称取5份空白烟草样品，按步骤“2.样品处理：（1）~（4）”进行处理，制备1 mL空白烟草样品基质提取液，于10 mL玻璃试管中，待用；

（2）移取5、10、20、40、80 μL的 16种除草剂的混合标准溶液，至装有空白烟草样品基质提取液的玻璃试管中，分别加入100 μL衍生剂，具盖密封40 ℃水浴衍生化30 min，40 ℃氮吹近干，加入1 mL丙酮/环己烷（体积比3:7）混合溶液，混匀，配成具有浓度梯度的基质混合标准工作溶液。配制的系列标准溶液的浓度分别为:0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μg/mL；

（3） 基质混合标准工作溶液过0.45 μm有机滤膜后，注入GPC-GC-MS/MS进行测定。并对各标样峰面积与内标的峰面积的比值(Y)和其浓度(X)进行线性回归分析，得到标准曲线。结果表明，在0.05～0.8 μg/mL范围内与测得的峰面积呈良好的线性关系，相关系数（γ）均大于0.99。分别根据3倍信噪比(S/N)计算16种除草剂的检出限(LOD)为0.002～0.02 mg/kg，详见表2。

表2 16种除草剂的线性方程、相关系数和的检出限

序号除草剂线性方程相关系数（γ）检出限（mg/kg）1麦草畏y=4.4632*x-0.34510.99950.00422,4-滴y=7.2341*x-0.00230.99760.0083氟乐灵y=3.8460*x-0.30220.99670.0024氟草胺y=2.7681*x-0.00920.99950.00952,4,5-涕y=4.3233*x-0.07520.99790.0086异恶草酮y=7.8975*x-0.02940.99980.0087甲草胺y=12.3039*x-0.19900.99540.0068敌草索y=0.9635*x-0.07790.99970.0059仲丁灵y=1.8997*x-0.06780.99230.00410异丙乐灵y=6.0398*x-0.01270.99990.00811二甲戊灵y=8.7066*x-0.01030.99450.0112氟节胺y=6.0004*x-0.02010.99970.00613双苯酰草胺y=1.0709*x-0.07280.99450.00614敌草胺y=7.0298*x-0.16710.99670.00415除草醚y=4.3109*x-0.04450.99950.0216精吡氟禾草灵y=9.0334*x-0.00340.99790.01

5.本发明方法的回收率和重复性：

选取空白样品，分别准确添加低、中、高三个浓度水平(0.05、0.1、0.2 mg/kg)的16种除草剂混合标准溶液，并按前述方法进行前处理和GPC-GC-MS/MS分析，以加标量和测定值的比值计算方法的回收率，以每个水平重复测定6次的结果计算方法的重复性。结果表明，16种除草剂的平均回收率为85.4 %～107.9 %,相对标准偏差(RSD)为2.8 %~13.2 %。结果满足国际烟草科学研究合作中心(CORESTA)农用化学品咨询委员会（ACAC)指导残留限量(GRLs)和技术方法指导对回收率、精密度的要求，结果见表3。

表3 16种除草剂的回收率和重复性（n=6）

除草剂空白样品(mg/kg)回收率(mg/kg)RSD(%)回收率(mg/kg)RSD(%)回收率(mg/kg)RSD(%)麦草畏0.0085.46.589.95.494.64.52,4-滴0.0087.58.986.36.386.36.7氟乐灵0.0097.39.696.77.491.08.6氟草胺0.0078.910.688.95.892.36.72,4,5-涕0.0087.29.591.412.3105.69.7异恶草酮0.0096.75.798.06.797.84.9甲草胺0.0095.39.386.57.985.84.8敌草索0.00107.94.6103.37.395.36.3仲丁灵0.0092.313.486.88.489.97.1异丙乐灵0.0089.114.989.188.4101.45.9二甲戊灵0.0095.77.994.39.495.77.3氟节胺0.0087.46.788.02.890.44.3双苯酰草胺0.0093.46.189.36.798.44.6敌草胺0.0089.59.090.65.895.97.3除草醚0.0088.713.297.09.499.48.1精吡氟禾草灵0.00100.26.5105.95.4102.34.5

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内，因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。