一种基于疏水离子交换固相萃取的卷烟主流烟气中烟草特有N‑亚硝胺的提取及测定方法

摘要

本发明涉及一种基于疏水离子交换固相萃取的卷烟主流烟气中烟草特有N‑亚硝胺的提取及测定方法，属于烟草化学检验技术领域。本发明卷烟主流烟气中烟草特有N‑亚硝胺的提取方法，将捕集有主流烟气总粒相物的滤片置于乙酸铵溶液，过滤，采用HiCapt MCX固相萃取柱进行固相萃取，即得。本发明卷烟主流烟气中烟草特有N‑亚硝胺的提取方法，能有效去除杂质及干扰物，提高测定方法的准确度和精密度，方法的相对回收率介于92.2％～108.9％之间，日内及日间精密度分别小于4.6％和4.2％。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于疏水离子交换固相萃取的卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的提取及测定方法，属于烟草化学检验技术领域。

背景技术

烟草特有N-亚硝胺是胺类化合物在酸性条件下与亚硝化试剂反应而生成的，是一类受到广泛关注的致癌物质，不仅是霍夫曼清单和美国食品药品监督管理局“烟草制品及烟气中有害及潜在有害物质名单”中的重要物质，也是国际癌症研究机构“无烟气烟草制品中28种有害物质”名单中的重要成分。因此，准确分析卷烟主流烟气中的烟草特有N-亚硝胺含量，对评价烟草及烟草制品、保障烟草制品消费安全具有重要意义。

卷烟烟气是极其复杂的混合物，目前已鉴定出的烟气成分超过5000余种，而其中烟草特有N-亚硝胺的含量水平一般在ng/支级别。因此，测定主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的释放量时通常面临以下难点：目标物含量低、存在基质干扰。因此，在烟草特有N-亚硝胺释放量进行测定时需要针对其性质选择合适的提取、纯化和浓缩方法才能进行后续的仪器测定。

目前，卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的检测方法有两种：第一种方法是用二氯甲烷提取粒相物中的烟草特有N-亚硝胺，浓缩提取液并采用碱性氧化铝层析柱进行净化，通过气相色谱-热能分析联用仪分离检测。但是上述方法要进行浓缩提取液，并且碱性氧化铝层析柱的填装和使用过程较费时，造成样品前处理步骤繁冗，不利于大量样品的快速分析。此外，热能分析仪虽是分析烟草特有N-亚硝胺的专属型检测器，但其仍存在前处理时间长、效率低等问题。第二种方法是用乙酸铵溶液提取粒相物中的烟草特有N-亚硝胺，将提取液过滤后进行液相色谱-串联质谱分析。该方法前处理操作简单，但是样品溶液进行仪器分析前没有经过净化处理，因此存在较强的基质干扰现象，加大了仪器维护频率。

申请公开号为CN102012407A的发明专利公开了一种烟草特有N-亚硝胺的检测方法，在该方案中将萃取液流经固相萃取小柱，然后采用甲酸水淋洗，最后用氨水/甲醇洗脱，得到待测液。该方案中的固相萃取填料为N-乙烯基吡咯烷酮-苯磺酸共聚物，有机聚合物填料在有机溶剂中会溶胀，会在一定程度上影响填料的富集和净化效果。另外，该方案中也没有对影响萃取效果的各种参数进行优化。

因此，开发一种灵敏度高、基质去除效果好且对环境污染小、快速检测卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的方法迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于疏水离子交换固相萃取的卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的提取方法，能有效去除杂质及干扰物。

本发明第二个目的在于提供一种基于疏水离子交换固相萃取的卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的测定方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种基于疏水离子交换固相萃取的卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的提取方法，包括以下步骤：

1)将捕集有主流烟气总粒相物的滤片加入浓度为5～100mmol/L的乙酸铵溶液进行提取，过滤，得粗提取液；

2)将步骤1)所得粗提取液流过活化后的HiCapt MCX固相萃取柱，完成上样；

3)用甲醇水溶液进行淋洗；

4)用丙酮、丙酮氨水混合液、丙酮甲酸混合液中的任意一种进行洗脱，即得N-亚硝胺的提取液；所述丙酮氨水混合液中丙酮、氨水的体积比为97～99:3～1；丙酮甲酸混合液中丙酮、甲酸的体积比为97～99:3～1；所述氨水的质量分数为35％。

所述卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺包括NNN、NNK、NAT和NAB。

所述HiCapt MCX固相萃取柱为疏水/离子交换混合保留机理固相萃取柱。

所述HiCapt MCX固相萃取柱购自于维泰克科技(武汉)有限公司。

步骤1)中提取为用乙酸铵溶液对捕集有主流烟气总粒相物的滤片进行超声提取。所述超声提取的超声功率280～700W，频率20～40kHz，时间不少于10min。超声提取时间优选为30min。

步骤1)过滤为采用水相滤膜进行过滤。所述水相滤膜优选聚醚砜膜。所述聚醚砜膜优选直径为0.22μm或0.45μm的聚醚砜膜。

步骤1)中每提取5支卷烟的主流烟气总粒相物所用乙酸铵溶液的用量不少于10mL。优选为：每提取5支卷烟的主流烟气总粒相物所用乙酸铵溶液的用量15mL～25mL。

步骤2)HiCapt MCX固相萃取柱中填料用量为：每将6mL粗提取液上样时对应使用50～1000mg HiCapt MCX固相萃取填料。进一步优选为500mg HiCapt MCX固相萃取填料。

步骤2)中活化为依次用丙酮、甲醇体积分数为5％的甲醇水溶液、水清洗固相萃取柱。所述丙酮、甲醇水溶液、水的体积比为1:2:2。

所述粗提取液在上样前调pH至3.0～11.0。进一步地，优选为pH至4.0～6.0。

所述调pH所用pH调节剂为乙酸或氨水。当选用乙酸调节pH时，优选质量分数为10％的乙酸溶液。

步骤3)中所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为5％～20％。甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选8％～12％。步骤3)中甲醇水溶液的用量选择时，每将6mL粗提取液上样，淋洗时甲醇水溶液的用量为≥0.5mL。优选为1mL。

步骤3)中淋洗后在真空泵的负压作用下抽干淋洗液。

步骤4)中丙酮与氨水体积比优选为99:1。丙酮与甲酸的体积比优选为99:1。

步骤4)中洗脱，洗脱液的用量为：每将6mL粗提取液上样，淋洗，干燥后使用的洗脱液体积≥0.5mL。优选为1～2mL。

一种基于疏水离子交换固相萃取的卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的测定方法，包括以下步骤：

1.提取液的制备

1.1将含有同位素内标的捕集有主流烟气总粒相物的滤片加入浓度为5～100mmol/L乙酸铵溶液进行提取，得粗提取液；

1.2将步骤1.1所得粗提取液流过活化后的HiCapt MCX固相萃取柱，完成上样；

1.3用甲醇水溶液进行淋洗，之后真空干燥；

1.4用丙酮、丙酮氨水混合液、丙酮甲酸混合液中的任意一种进行洗脱，即得N-亚硝胺的提取液；所述丙酮氨水混合液中丙酮、氨水的体积比为97～99:3～1；丙酮甲酸混合液中丙酮、甲酸的体积比为97～99:3～1；

2.卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的测定

将步骤1.4所得提取液吹干，用甲酸铵溶液、甲酸乙腈溶液配制而成的复溶液进行复溶，之后进行液相色谱-串联质谱测定。

步骤1.1中同位素内标包括NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4。

步骤1.1中每提取5支卷烟的主流烟气总粒相物所用乙酸铵溶液的用量不少于10mL。优选为：每提取5支卷烟的主流烟气总粒相物所用乙酸铵溶液的用量15mL～25mL。

步骤1.1滤片上同位素内标的加入量为：每使用1mL乙酸铵溶液对应各种同位素内标的加入量均为10ng。

步骤2中复溶液由0.01mol/L的甲酸铵溶液与甲酸体积分数为0.1％的甲酸乙腈溶液按照1～2:1～2的体积比配制而成。所述复溶液的用量为：每将6mL粗提取液上样，最终测定前需使用复溶液的体积≥0.1mL。进一步优选为0.2mL。

步骤1.4中丙酮与氨水体积比优选为99:1。丙酮与甲酸的体积比优选为99:1。

步骤4)中洗脱，洗脱液的用量为：每将6mL粗提取液上样，淋洗，干燥后使用的洗脱液体积≥0.5mL。优选为1～2mL。

本发明一种基于疏水离子交换固相萃取的卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的测定方法中，提取液的制备步骤中涉及到的具体参数及提取条件与卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的提取方法中相同。

上述步骤2中液相色谱-串联质谱测定包括系列浓度的混合标准溶液的配制，配制步骤为：

以四种烟草特有N-亚硝胺的同位素内标(NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4和NAB-d4)为溶质，甲醇为溶剂，配制内标溶液；以四种烟草特有N-亚硝胺(NNN、NNK、NAT和NAB)为溶质，加入固定体积的内标溶液，甲醇为溶剂，配制系列浓度的混合标准溶液。

本发明烟草特有N-亚硝胺的测定方法中标准曲线的制作步骤为：

以四种烟草特有N-亚硝胺的同位素内标(NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4和NAB-d4)为溶质，甲醇为溶剂，配制内标溶液；以四种烟草特有N-亚硝胺(NNN、NNK、NAT和NAB)为溶质，加入固定体积的内标溶液，甲醇为溶剂，配制系列浓度的混合标准溶液，将系列浓度的混合标准溶液进行液相色谱-串联质谱分析，以目标分析物峰面积和相应同位素峰面积之比对目标分析浓度做回归分析，即得各目标分析物的标准曲线。

所述液相色谱-串联质谱分析的条件为：色谱柱：Poroshell 120 EC-C18(3.0mm×100mm，2.7μm)；柱温：40℃；进样量：5μL；流动相为0.01mol/L甲酸铵(A)-0.1％甲酸乙腈(B)；流速：0.4mL/min；流动相梯度程序：t＝0min，10％B，t＝2.0min，40％B，t＝4.0min，60％B，t＝6.0min，90％B，t＝9.0min，90％B，t＝9.5min，10％B，t＝15.0min，10％B；质谱条件：电喷雾电压5000V；雾化气(Gas1)压力50psi；辅助雾化气(Gas2)压力50psi；气帘气(Gas1)压力35psi；离子源温度450℃；进口电压8V；出口电压10V；去簇电压40V；驻留时间40ms；监测模式：多反应监测。

所述多反应监测中NNN、NNK、NAT和NAB的定量离子对依次为178.1>148.2、208.1>122.1、190.1>160.1和192.1>162.2，相应的碰撞电压依次为15、16、15和17eV；NNN、NNK、NAT和NAB的定性离子对依次为178.1>120.1、208.1>106.1、190.1>106.1和192.1>133.1，相应的碰撞电压依次为15、16、15和17eV；NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4和NAB-d4的定量离子对依次为182.1>152.2、212.1>126.1、194.1>164.1和196.1>166.2，相应的碰撞电压依次为15、16、15和17eV。

本发明的有益效果是：

本发明采用固相萃取-液相色谱-串联质谱法定性、定量分析卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺，样品前处理操作简单、快捷，杂质及干扰物的去除效率高，处理时间和仪器分析短的优点。烟草特有N-亚硝胺本身具有疏水性能，再加上其结构中都含有吡啶环，具有离子交换能力，采用HiCapt MCX固相萃取柱对样品提取液进行萃取具有良好的净化效果，能有效去除杂质及干扰物，提高测定方法的准确度和精密度，方法的相对回收率介于92.2％～108.9％之间，日内及日间精密度分别小于4.6％和4.2％。

附图说明

图1为混合标准溶液3的色谱图；

图2为上百种卷烟主流烟气的测定结果图；

图3为HiCapt MCX固相萃取柱中填料质量的优化结果图；

图4为上样溶液pH值的优化结果图；

图5为淋洗液中甲醇含量的优化结果图；

图6为洗脱液种类的优化结果图；

图7为洗脱液体积的优化结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施方式作进一步说明。

实施例1

本发明一种基于疏水离子交换固相萃取的卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的提取方法，包括以下步骤：

1)按照GB/T 19609-2004、ISO 4387:2000的规定，用直线型吸烟机抽吸5支卷烟，将捕集有主流烟气总粒相物的滤片置于容器中，加入15mL、5mmol/L乙酸铵溶液，置于超声波发生器(购自昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-700DB)上超声提取30min，超声功率280W，频率40kHz，提取液过0.22μm水相滤膜，即得样品粗提取液，调节样品粗提取液pH值为4，作为上样溶液；

2)称取500mg HiCapt MCX固相萃取填料于带有筛板的固相萃取空柱管中，不断敲打使填料填充均匀，上端盖上筛板压紧，待用。上样前，依次用1.0mL丙酮、2.0mL甲醇体积分数为5％的甲醇水溶液、2mL水清洗活化固相萃取小柱；然后在重力作用下将6mL上样溶液自然流过固相萃取小柱以完成上样过程；

3)上样结束后用1mL甲醇体积分数为10％的甲醇水溶液进行淋洗，待淋洗液完全流过萃取柱后，在真空泵的负压作用下抽干淋洗液；

4)用2mL丙酮(含1％体积分数的浓氨水)洗脱目标分析物，收集，即得。

本发明一种基于疏水离子交换固相萃取的卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的测定方法，包括以下步骤：

1.卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的提取

1.1按照GB/T 19609-2004、ISO 4387:2000的规定，用直线型吸烟机抽吸5支卷烟，将同位素内标添加在捕集有主流烟气总粒相物的滤片上，置于容器中，加入15mL、5mmol/L乙酸铵溶液，置于超声波发生器(购自昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-700DB)上超声提取30min，超声功率280W，频率40kHz，提取液过0.22μm水相滤膜，即得样品粗提取液，调节粗提取液pH值为4，作为上样溶液；

1.2准确称取500mg HiCapt MCX固相萃取填料于带有筛板的固相萃取空柱管中，不断敲打使填料填充均匀，上端盖上筛板压紧，待用。上样前，依次用1.0mL丙酮、2.0mL甲醇体积分数为5％的甲醇水溶液、2mL水活化固相萃取小柱；然后在重力作用下将6mL上样溶液自然流过固相萃取小柱以完成上样过程；

1.3上样结束后用1mL甲醇体积分数为10％的甲醇水溶液进行淋洗，待淋洗液完全流过萃取柱后，在真空泵的负压作用下抽干淋洗液；

1.4用2mL丙酮(含1％体积分数氨水)洗脱目标分析物，收集，即得；

2.卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的测定

将步骤1.4所得提取液在35℃下氮气吹干，再用0.2mL复溶液进行复溶，即得待测液。复溶液由0.01mol/L的甲酸铵溶液和甲酸体积分数为0.1％的甲酸乙腈溶液按照1:1的体积比配制而成。

混合标准溶液的配制：以四种烟草特有N-亚硝胺的同位素内标(NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4和NAB-d4)为溶质，甲醇为溶剂，配制内标溶液；以四种烟草特有N-亚硝胺(NNN、NNK、NAT和NAB)为溶质，加入固定体积的内标溶液，甲醇为溶剂，配制系列浓度的混合标准溶液，具体见下表1。其中内标的浓度均为10ng/mL。将混合标准溶液进行液相色谱-串联质谱分析；

表1混合标准溶液的浓度表

标准曲线的制作：取混合标准溶液进行液相色谱-串联质谱分析，分析条件为：色谱柱：Poroshell 120 EC-C18(3.0mm×100mm，2.7μm)；柱温：40℃；进样量：5μL；流动相为0.01mol/L甲酸铵(A)-0.1％甲酸乙腈(B)；流速：0.4mL/min；流动相梯度程序：t＝0min，10％B，t＝2.0min，40％B，t＝4.0min，60％B，t＝6.0min，90％B，t＝9.0min，90％B，t＝9.5min，10％B，t＝15.0min，10％B；质谱条件：电喷雾电压5000V；雾化气(Gas1)压力50psi；辅助雾化气(Gas2)压力50psi；气帘气(Gas1)压力35psi；离子源温度450℃；进口电压8V；出口电压10V；去簇电压40V；驻留时间40ms；监测模式：多反应监测。

所述多反应监测中NNN、NNK、NAT和NAB的定量离子对依次为178.1>148.2、208.1>122.1、190.1>160.1和192.1>162.2，相应的碰撞电压依次为15、16、15和17eV；NNN、NNK、NAT和NAB的定性离子对依次为178.1>120.1、208.1>106.1、190.1>106.1和192.1>133.1，相应的碰撞电压依次为15、16、15和17eV；NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4和NAB-d4的定量离子对依次为182.1>152.2、212.1>126.1、194.1>164.1和196.1>166.2，相应的碰撞电压依次为15、16、15和17eV。程序运行结束，以目标分析物峰面积和相应同位素峰面积之比对目标分析浓度作回归分析，即得各目标分析物的标准曲线，参数见下表2，混合标准溶液3的色谱图见图1。

表2各目标分析物对应的标准曲线、定量限和检测限

注：检测限和定量限是信噪比(S/N)3和10时对应的浓度。

样品中烟草特有N-亚硝胺的测定：取上述待测溶液进行液相色谱-串联质谱分析，分析条件同混合标准溶液进行液相色谱-串联质谱分析的分析条件，将测得的各物质峰面积代入下式1中，经计算得到样品中目标分析物的含量。

式1：

式中，m为样品中目标分析物的含量，ng/g；x为目标分析物与同位素内标的峰面积之比；a为标准曲线的斜率，b为标准曲线的截距；V为样品提取液的体积，mL；n为样品质量，g。

实施例2

按实施例1所述的测定方法，选取另外上百种市售卷烟，测定其中烟草特有N-亚硝胺的含量，结果如图2所示。

在本发明其它实施例中，HiCapt MCX固相萃取柱中填料的用量还可以为50mg、100mg、200mg、300mg或1000mg，其它同实施例1。由图3HiCapt MCX固相萃取柱中填料质量的优化结果图可知，填料的质量在50-1000mg范围内，随着质量不断提高，目标分析物的峰面积均不断提高，当达到500mg时，继续增加填料质量，目标分析物的峰面积提高不明显，综合考虑所有目标分析物的萃取效果，优选填料的质量为500mg。

在本发明其它实施例中，上样溶液的pH值还可以为3.4、6、10.5或11，其它同实施例1。如图4上样溶液pH值的优化结果图所示，在pH为4.0时，所有被分析物具有较好的萃取效果；当pH值高于6.0或低于4.0时，目标分析物的萃取效率均有所下降；由于固相萃取柱中的填料对目标分析物的萃取主要是靠疏水和阳离子交换作用，pH在4.0-6.0时大部分目标分析物分子以质子化形式存在，而填料中的阳离子交换基团以负离子形式存在，此时填料和目标分析物之间的疏水作用和阳离子交换作用力较强，因此具有最佳的萃取效果。

在本发明其它实施例中，步骤3)及1.3中甲醇水溶液中甲醇的体积分数还可以为5％、8％、12％、15％或20％，其它同实施例1。如图5淋洗液中甲醇含量的优化结果图所示，当甲醇水溶液中甲醇体积分数为10％时，目标分析物具有较好的萃取效率，继续增加甲醇含量，降低了目标分析物与填料之间的疏水相互作用，不利于萃取效率的提高。因此，甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选为10％。

在本发明其它实施例中，步骤4)及1.4中的洗脱液还可以为含3％体积分数氨水的丙酮混合液、含1％或3％体积分数甲酸的丙酮混合液或丙酮，其它同实施例1。如图6洗脱液种类及图7洗脱液用量的优化结果图所示，在丙酮中添加一定比例的氨水，能够提高目标分析物的洗脱效率，这是因为碱性条件下能够破坏填料和目标分析物之间的阳离子交换作用。除了NAB外，其余的目标分析物均能被1mL洗脱液液完全洗脱，为了保证较好的洗脱效率，洗脱液的体积优选为1～2mL。

在本发明其它实施例中，卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的测定方法步骤2中复溶液还可以由0.01mol/L的甲酸铵溶液和甲酸体积分数为0.1％的甲酸乙腈溶液按照1:2或2:1的体积比配制而成，其它同实施例1。

试验例

1)精密度及加标回收测试

为考察上述测定方法的重现性，在实施例1的捕集有主流烟气总粒相物的滤片中加入一定量的混合标准溶液，配制成低、中、高三种浓度的样品(低、中、高浓度对应的值分别为各目标分析物线性范围最低值的2、10和40倍)。在优化的分析条件下，目标分析物与干扰物分离良好，干扰物不影响目标分析物的定量。

以一天内配制的5个样品进行测定，计算不同浓度下的日内相对标准偏差；以连续3天配制的样品进行测定，计算不同浓度下的日间相对标准偏差；将分析所得的峰面积之比代入标准曲线中，计算得到待测溶液中目标分析物的含量，并与实际添加量相比得到相对回收率，结果见下表3。

表3精密度及加标回收测试结果

从表3可以看出，目标分析物在不同浓度下的日内及日间精密度分别小于4.6％和4.2％，说明该方法具有较好的重现性。同时，不同浓度下目标分析物的相对回收率介于92.2％～108.9％之间。

为了进一步验证本发明烟草特有N-亚硝胺的测定方法的准确性，采用本方法和现行标准方法(YQ/T 17-2012)对市售卷烟进行分析，结果如表4所示。

表4采用本方法和标准方法对市售卷烟分析的结果(ng/支)

结果表明，两种方法得到的测定结果一致性良好，说明该方法的准确性好，可以满足日常分析要求。