一种用于治疗冠心病、高脂血症的中药有效部位、制备方法及从中分离有效成分的方法

摘要

本发明属于医药科技领域，具体涉及从毛郁金的根茎中提取得到的用于治疗冠心病、高脂血症的中药有效部位、其制备方法和从中分离有效成分的方法，以姜黄科植物毛郁金的干燥根茎为药用部位，药用部位经有机溶剂提取，提取物经分离、纯化得到的含有倍半萜类成分的有效部位。药理实验研究表明：莪术二醇、原莪术醇、莪术二酮和zedoarondiol及总提取物均有显著治疗心肌缺血作用，可明显减小缺血所致大鼠心肌损伤心肌梗塞区范围，对冠脉结扎大鼠心肌缺血损伤具有明显的保护作用。本申请是发明名称为“一种用于治疗冠心病、高脂血症的中药有效部位及其制备方法”的发明专利申请的分案申请。

说明书

本申请是2014年9月23日递交的申请号为201410491640.7，发明名称为“一种用于治疗冠心病、高脂血症的中药有效部位及其制备方法”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于医药科技领域，具体涉及从毛郁金的根茎中提取得到的用于治疗冠心病、高脂血症的中药有效部位、其制备方法和从中分离有效成分的方法。

背景技术

心脏病、恶性肿瘤、脑血管病变是当今严重威胁人类的生命3种疾病，上世纪90年代以来冠心病已排名我国健康杀手榜第一名，随着我国经济的飞速发展，人民生活水平不断提高及生活方式、饮食结构发生的巨大改变，冠心病在我国的发病率呈不断上升趋势。冠心病是一种最常见的心脏病，是指因冠状动脉狭窄、供血不足而引起的心肌机能障碍和器质性病变，故又称缺血性心脏病(IHD)。诱发了冠心病的主要病因有：高脂血症、高血压、糖尿病、肥胖症及吸烟等不良生活习惯。体内脂质代谢紊乱是冠心病最重要的起因，现代医学研究表明氧化低密度脂蛋白胆固醇和载脂蛋白的水平和冠心病事件的危险性之间存在着密切的关系，高脂血症与动脉粥样硬化密切相关，是冠心病的重要诱因。冠心病患者除了有可能因冠脉阻塞引起心肌梗塞导致死亡外，心绞痛的频繁发作也将使其学习、工作能力大大受限，严重时个人生活不能自理，对家庭和社会都带来了沉重的负担。因此，发现开发有效治疗冠心病、心绞痛的药物，以减少心血管疾病对人类健康的威胁是一项十分有意义的工作。

毛郁金为双子叶植物姜科姜黄属植物毛郁金(Curcuma aromatica salisb.)的根茎，分布在我国广西、贵州等地，为地方野生药用植物资源。毛郁金具有多种药用功效，临床上被习惯用于主治胸肋刺痛、经闭、风湿肩臂疼痛、跌扑肿痛等，现代药理研究表明其具有抗炎及免疫抑制作用。但其用于治疗心肌缺血、冠心病和高脂血症的作用研究未见报道。

我们在收集民间验方时，发现广西南宁地区有将其与其它药材配伍治疗胸痹的临床应用实践，方法简洁且疗效显著，收载的病例中不乏多名长年卧床不能行走、头晕、全身无力、胸闷气急、失眠的重症患者及多年服用心血管常用药物病情没有明显改善的久病患者。为了充分挖掘该药材的临床应用价值，对该药材进行了深入的研究，通过对临床经验方进行拆方研究，对方中药材的不同有效部位进行药效筛选，应用大量的公认动物模型进行药效学验证，筛选出目标有效部位和有效成分，药理研究证实毛郁金倍半萜类化合物能明显降低受损心肌细胞中LDH和CK的水平、减少心肌梗死范围，保护受损心肌，能有效治疗冠心病，降低血液中的血脂水平，改善预后，有可预见的临床获益。

发明内容

本发明通过对毛郁金的不同有效部位进行药效筛选，发现了其用于治疗目标冠心病和高脂血症有效部位，通过对有效部位中倍半萜类成分进行全面深入地分析研究，从中分离出莪术二醇、原莪术醇、莪术二酮、zedoarondiol等四个倍半萜单体有效成分，经理化常数及波谱分析，它们的结构式分别如下：

在本发明的第一方面，提供了一种用于治疗冠心病、高脂血症的中药有效部位，其特征在于：以姜黄科植物毛郁金(Curcuma aromatica salisb.)的干燥根茎为药用部位，药用部位经有机溶剂提取，提取物经分离、纯化得到的含有倍半萜类成分的有效部位，有效部位中倍半萜类成分的含量(质量百分比)大于50％。

具体的，倍半萜类成分中的主要化合物为莪术二醇、原莪术醇、莪术二酮和zedoarondio，其中莪术二醇在有效部位中的含量为10～40％，原莪术醇在有效部位中的含量为15～35％，莪术二酮在有效部位中的含量为10～30％，zedoarondiol在有效部位中的含量为5～30％。

本发明的第二方面提供了一种中药有效部位的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)毛郁金药用部位加2～12倍(重量比)浓度为50～95％的乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或乙酸乙酯中的一种或任意几种混合溶剂进行回流提取，提取液回收溶剂，浓缩得毛郁金粗提物；或将毛郁金药用部位粉碎过筛后，以乙醇为夹带剂，置超临界CO₂萃取，萃取物即为毛郁金粗提物；

(2)毛郁金粗提物用2～18倍量的水饱和正丁醇、乙酸乙酯或石油醚-乙酸乙酯萃取，萃取液回收溶剂，浓缩得毛郁金有效部位。

本发明还提供了另一种中药有效部位的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)毛郁金药用部位加2～12倍(重量比)浓度为50～95％的乙醇，或甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、乙酸乙酯中的一种或任意几种混合溶剂进行回流提取，提取液回收溶剂，浓缩得毛郁金粗提物；或将毛郁金药用部位粉碎过筛后，以乙醇为夹带剂，置超临界CO₂萃取，萃取物即为毛郁金粗提物；

(2)将毛郁金粗提物经大孔树脂吸附，分别用1～3倍柱体积的水、1～3倍柱体积的浓度为10～30％的乙醇冲洗树脂柱，弃去水及稀醇洗脱液，再用80～95％的乙醇解析树脂吸附的有效成分，分段收集80～95％的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩得毛郁金有效部位。

优选的，大孔树脂为苯乙烯型多孔性吸附树脂，极性为弱极性或中等极性；例如可以选用D101、HPD-100、HPD-300、HPD-450、HPD-5000或H103型大孔树脂。

本发明的第三方面提供了一种从毛郁金有效部位中分离有效成分的方法，包含以下步骤：

(1)制备得到毛郁金有效部位；

(2)将毛郁金有效部位经硅胶柱层析，洗脱液为8-20:1的石油醚-乙酸乙酯体系，收集洗脱液得莪术二酮粗品；莪术二酮粗品用制备型高效液相色谱法纯化得莪术二酮精制品；

(3)将洗脱液更换为4-7:1的石油醚-乙酸乙酯体系，收集洗脱液得到zedoarondiol粗品，zedoarondiol粗品用制备型高效液相色谱法纯化得zedoarondiol精制品；

(4)将洗脱液更换为3-2:1的石油醚-乙酸乙酯体系，收集洗脱液得到第三流分，收集所述第三流分通过制备型高效液相色谱分离纯化可得莪术二醇和原莪术醇。

有益效果：

首次发现莪术二醇、原莪术醇、莪术二酮和zedoarondiol及毛郁金有效部位均有显著治疗心肌缺血作用，可明显减小缺血所致大鼠心肌损伤心肌梗塞区范围，对冠脉结扎大鼠心肌缺血损伤具有明显的保护作用，对冠心病和高脂血症也有很好的疗效。

具体实施方式：

实施例1：

⑴、毛郁金根茎去泥沙、须根，洗净，切片，晒干，制成药用部位；

⑵、取毛郁金根茎饮片1800g，加6倍量80％的乙醇回流得取两次，合并两次提取液，滤过，滤过液回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10(45℃)左右，得毛郁金粗提物；

⑶、粗提物用2倍量的水饱和正丁醇萃取6次，合并正丁醇萃取液，减压回收正丁醇，浓缩，真空干燥得有效部位121g。

实施例2：

⑴、毛郁金根茎去泥沙、须根，洗净，切片，晒干，制成药用部位；

⑵、取毛郁金根茎饮片2000g，加6倍量75％的乙醇回流得取两次，合并两次提取液，滤过，滤过液回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.05～1.10(45℃)左右，得毛郁金粗提物；

⑶、粗提物用3倍量的乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收乙酸乙酯，浓缩，真空干燥得有效部位116g。

实施例3：

⑴、毛郁金根茎去泥沙、须根，洗净，切片，晒干，制成药用部位；

⑵、取毛郁金根茎饮片2000g，加6倍量75％的乙醇回流得取两次，合并两次提取液，滤过，滤过液回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.05～1.10(45℃)左右，得毛郁金粗提物；

⑶、粗提物用3倍量的由石油醚：乙酸乙酯(体积比为3～20：1)组成的混合溶剂萃取，萃取6次，合并由石油醚：乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，浓缩，真空干燥得有效部位105g。

实施例4

⑴、毛郁金根茎去泥沙、须根，洗净，切片，晒干，制成药用部位；

⑵、取毛郁金根茎饮片2000g，加6倍量75％的乙醇回流得取两次，合并两次提取液，滤过，滤过液回收乙醇，减压浓缩乙醇至尽，得毛郁金醇提液；

⑶、毛郁金醇提液经D101型大孔树脂吸附，树脂柱子径高比为1：8，上样量为药材：树脂＝3：1，树脂柱子先分别用2倍柱体积的水、2倍柱体积的浓度为30％的乙醇冲洗树脂柱，弃去水及稀醇洗脱液；

⑷、树脂柱子再用4倍柱体积90％的乙醇解析树脂吸附的有效成分，分段收集乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇，浓缩，真空干燥得有效部位102g。

实施例5：

⑴、毛郁金根茎去须根、泥沙，洗净，切片，晒干，制成药用部位；

⑵、取毛郁金根茎饮片粉碎，过10目筛，称取5Kg置超临界CO₂萃取装置的萃取釜中；

⑵、以乙醇为夹带剂(500g)，萃取压力和超临界CO₂流体温度为35MPa和50℃，分离釜Ⅰ压力和温度为8MPa和50℃，分离II压力和温度为5MPa和35℃，进行超临界萃取，循环萃取1.5～2小时，从分离釜Ⅰ、分离釜II出料口放出萃取物。

⑶、超临界CO₂萃取物60℃、-0.09MPa减压除去乙醇至尽，用2倍量的由石油醚：乙酸乙酯(体积比为3～20：1)组成的混合溶剂萃取4次，合并萃取液，减压回收溶剂，浓缩得有效部位415g。

实施例6：毛郁金倍半萜单体化合物的工艺制法：

⑴、毛郁金根茎去泥沙、须根，洗净，切片，晒干，制成药用部位；

⑵、取毛郁金根茎饮片3000g，加6倍量80％的乙醇回流得取两次，合并两次提取液，滤过，滤过液回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10(45℃)左右，得毛郁金粗提物；

⑶、粗提物用2倍量的水饱和正丁醇萃取6次，合并正丁醇萃取液，减压回收正丁醇，浓缩，真空干燥得有效部位204g。

⑷、取有效部位204g，与适量硅胶拌匀，干法上柱，经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯体系洗脱，先用石油醚-乙酸乙酯(按20:1)洗脱，得莪术二酮粗品洗脱液，洗脱液回收溶剂至尽，再用制备液相(流动相为50％的乙腈-水溶液)制备得莪术二酮精制品5.7g，纯度99.8％。硅胶柱层析再用石油醚-乙酸乙酯(按7:1)洗脱，得zedoarondiol粗品洗脱液，洗脱液回收溶剂至尽，再用制备液相(流动相10％-15％的乙腈-水溶液)制备得zedoarondiol精制品2.3g，纯度98.5％。硅胶柱层析再用石油醚-乙酸乙酯(按2:1)洗脱，得莪术二醇及原莪术醇粗品洗脱液，洗脱液回收溶剂至尽，用制备液相(流动相15％-50％的乙腈-水溶液)制备得莪术二醇精制品2.5g，纯度97.8％，经HPLC制备分离莪术二醇后的母液合并，回收溶剂后，再用制备液相(流动相30％的乙腈-水溶液)制备可得原莪术醇精制品6.1g，纯度98.9％。

实施例7

对四种化合物进行理化常数及波谱学分析：对化合物莪术二酮采用LC-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、Dept、¹H-¹H>13C-¹H>15H₂₄O₂，如化学结构式所示。对化合物zedoarondiol采用LC-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、Dept、¹H-¹H>13C-¹H>15H₂₄O₃，如化学结构式所示。对化合物莪术二醇采用LC-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、Dept、¹H-¹H>13C-¹H>15H₂₂O₃，结构式如化学结构式所示。对化合物原莪术醇采用LC-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、Dept、¹H-¹H>13C-¹H>15H₂₂O₂，如化学结构式所示。其中莪术二酮的¹³C-NMR为¹³C>3)δ16.57,18.54,19.86,21.12,26.41,30.00,34.05,44.24,46.81,53.61,55.92,129.90,131.59,211.14,214.37；zedoarondiol的¹³C-NMR为¹³C>3)δ20.17,21.16,22.06,22.21,22.38,28.47,39.67,51.83,56.15,60.61,71.28,78.49,135.57,139.18,202.55；莪术二醇的¹³C-NMR为¹³C>3)δ21.93；22.00；22.71；24.09；27.19；36.98；37.16；60.94；83.19；86.44；127.97；132.89；143.30；151.03；194.09；原莪术醇的¹³C-NMR为¹³C>3)δ20.35；21.52；22.49；23.39；26.02；27.75；39.04；49.62；53.01；79.39；128.27；135.40；135.88；154.22；198.26。碳谱数据与核磁共振碳谱数据库(上海微谱信息技术有限公司)中收录的化合物碳谱一致。

实施例8：有效部位中倍半萜类成分的含量检测分析

(一)、仪器与试剂

Dionex UltiMate 3000高效液相色谱仪，LPG-3400SD高压泵，WPS-3000(RS)自动进样器，TCC-3x00(RS)柱温箱，VWD-3x00(RS)紫外检测器，Chromeleon 6.8工作站。

乙腈，TEDIA公司，色谱纯；水为Hi-Tech水纯化系统自制的去离子水(18.2MΩ)。

对照品：莪术二酮、zedoarondiol、莪术二醇、原莪术醇

(二)、溶液的制备

对照品溶液的制备：精密称取莪术二酮、zedoarondiol、莪术二醇、原莪术醇自制对照品适量，加甲醇溶解制成每lmL含莪术二酮、zedoarondiol、莪术二醇、原莪术醇约100μg的对照品溶液。

(三)、供试品溶液的制备：精密称取制备的有效部位适量，加甲醇溶解制成每lmL含约2mg的供试品溶液。

(四)、色谱条件：

采用反相高效液相色谱SymmetryC₁₈(5μm，250×4.6mm)，以水为流动相A，以乙腈为流动相B，流速1.0mL/min，梯度洗脱程序见表1，检测波长230nm，柱温25℃。

表1梯度洗脱程序

(五)、测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μ1，注入液相色谱仪，测定，分别计算四种倍半萜类化合物的含量，四种倍半萜类化合物的含量的和为有效部位的含量。

(六)、含量测定结果：见下表2

表2不同制备方法得到的有效部位中倍半萜类成分的含量

注：以上有效部位中倍半萜类成分主要为莪术二酮、zedoarondiol、莪术二醇、原莪术醇四种。

结论：以上检测结果表明，本发明工艺具有实际意义。

药效实施例：

在本发明还提供了用5种方法制备的毛郁金有效部位、莪术二酮、zedoarondiol、莪术二醇和原莪术醇在制备防治心肌缺血、冠心病和高脂血症中的应用。

药理实验表明：莪术二醇、原莪术醇、莪术二酮、zedoarondiol及毛郁金有效部位对SD大鼠冠状动脉结扎所致的实验性心肌缺血模型有显著的治疗作用，通过测定模型动物的心肌梗塞范围及CK和LDH证实，药物可明显减小缺血所致大鼠心肌损伤心肌梗塞区范围，对冠脉结扎大鼠心肌缺血损伤具有明显的保护作用。

灌胃给予毛郁金有效部位能明显降低高脂血症家兔肝脏和血清TG、TC值，降低HDL-C、LDL-C，升高H/L，可改善其肝脏脂肪变性程度，各试验组动物的肝脏脂肪变性程度明显减轻，其降脂作用与辛伐他汀基本相当。

(一)、降脂实验：

1、供试品：毛郁金有效部位(来源于上海捌加壹医药科技有限公司)

2、阳性对照品Ⅰ：复方益肝灵片(来源于江苏中兴药业有限公司)

批号：130303161；规格：0.32g/片，每片含水飞蓟素21mg

3、阳性对照品II：辛伐他汀片(来源于杭州默沙东制药有限公司)

批号：120333；规格：20mg/片×7片/盒

4、阴性对照：CMC-Na(国药集团化学试剂有限公司)

批号：F20091021(用试验用水配制成0.5％溶液使用)

5、实验动物

种系：新西兰兔(上海生旺实验动物养殖有限公司)

许可证号：SCXK(沪)2012-0007；合格证号：200700071847

6、实验方法

雄性新西兰大白兔100只，初始体重：2,188.4±227.9g，适应性喂养2周后，除正常对照组饲喂标准饲料外，其余动物每日上午定量给予高脂饲料150g。连续饲喂至33天后，隔夜禁食，耳缘静脉采血分离血清测定TG、TC、HDL-C、LDL-C，以确认造模成功与否。

确认模型成功后，剔除血脂水平不合格的动物，根据上述指标和体重将模型动物均衡分至模型对照组，方法1～5制得的有效部位给药组(相当10g生药/kg)，复方益肝灵片组(30mg/kg)，辛伐他汀组(3mg/kg)，于分组后开始给药，空白对照组和模型组灌胃给予4mL/kg空白溶剂，其余组灌胃给予相应的样品，每天一次，连续给药至阳性对照组出现明显降脂作用。给药期间不停高脂饲料。

试验期间每周称一次体重，根据体重调整给药剂量。给药2周后，动物隔夜禁食不禁水12h，耳静脉采血，离心分离血清，检测TG、TC、HDL-C、LDL-C值，并计算HDL-C/LDL-C比值；给药3周后，再次隔夜禁食采血测定上述指标，采血后第二天家兔用3％戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔麻醉，解剖取肝脏400mg，加脂质提取液(正庚烷：异丙醇＝2：3.5)4mL匀浆，振荡提取脂质，离心沉淀后取上清液测定肝脏TG和TC。

7、统计学处理：所有计量数据均以表示，数据的统计学分析用t检验；

8、实验结果

各实验组家兔肝脂质含量实验结果见表3。结果显示，模型组肝组织TG、TC含量均明显高于正常对照组(p<0.01)，说明造模成功。毛郁金有效部位各组可明显降低肝组织TG和TC含量。

各实验组家兔血清TG、TC实验结果见表4。结果显示，给药前，各给药组和模型组的血清TG、TC值非常显著高于正常对照组(p<0.01)；而各给药组的血清TG、TC值与模型组基本一致，提示造模成功，分组均匀。

各实验组家兔HDL-C、LDL-C含量和比值(H/L)实验结果见表5。结果显示，给药前，各实验组血清HDL-C和LDL-C含量均非常显著高于正常对照组(p<0.01)；H/L比值非常显著低于正常对照组(p<0.01)；各给药组的血清HDL-C、LDL-C和H/L比值与模型组基本一致，提示模型成功动物分组较为均匀。给药后第2周和第3周，模型组的HDL-C、LDL-C非常显著高于正常组(p<0.01)，H/L非常显著低于正常组(p<0.01)。

9、结论

以上实验结果提示，给药3周结束后，五种方法制备的毛郁金有效部位(相当10g生药/kg)和复方益肝灵片30mg/kg灌胃给药能明显降低高脂血症家兔肝脏和血清TG、TC值，降低HDL-C、LDL-C，升高H/L，可改善肝脏脂肪变性程度，且毛郁金有效部位各试验组动物的肝脏脂肪变性程度均减轻。辛伐他汀组3mg/kg灌胃给药可明显降低高血脂家兔血清TG、TC、HDL-C、LDL-C值，升高H/L，对肝脏TG、TC亦有明显降低作用。结果提示在本模型上，毛郁金有效部位可降低动物血脂水平，其降脂作用与辛伐他汀基本相当。

表3.各实验组家兔肝脏组织脂质含量结果

^*p<0.05；^**p<0.01，与模型组比较；^#p<0.05；^##p<0.01，与复方益肝灵片组比较；^△p<0.05；^△△p<0.01，与辛伐他汀组比较

表4.各实验组家兔血脂含量结果

^*p<0.05；^**p<0.01，与模型组比较；^#p<0.05；^##p<0.01，与复方益肝灵片组比较；^△p<0.05；^△△p<0.01，与辛伐他汀组比较。

表5.各实验组家兔血清高低密度脂蛋白胆固醇含量和比值结果

^*p<0.05；^**p<0.01，与模型组比较；^#p<0.05；^##p<0.01，与复方益肝灵片组比较；^△p<0.05；^△△p<0.01，与辛伐他汀组比较。

(二)、对心肌缺血再灌注大鼠的治疗作用

1、受试物

用本发明方法一、方法二、方法三、方法四、方法五制备的毛郁金有效部位(以下简称方法一制、方法二制、方法三制、方法四制、方法五制)及用本发明方法六制备的四个倍半萜单体化合物莪术二醇、原莪术醇、莪术二酮、zedoarondiol，临用时以CMC-Na溶液配制成所需浓度的药液，供动物给药用。

2、阳性药

地奥心血康胶囊(以下简称心血康)：成都地奥制集团有限公司生产，规格100mg/粒，批号1306022。临用时以CMC-Na溶液配制成所需浓度的药液供动物给药。

单硝酸异山梨酯片(以下简称单硝酯)，商品名欣康，鲁南贝特制药有限公司生产，规格20mg，批号07130313。临用时研碎，以CMC-Na溶液配制成相应浓度的药液供大鼠灌胃给药用。

3、药盒与试剂

乳酸脱氢酶(LDH)分析试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司生产，批号130521。

大鼠肌酸激酶同工酶(CK-MB)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒，Bio-Swamp公司产品，批号201310。

大鼠乳酸脱氢酶(LDH)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒，Bio-Swamp公司产品，批号201310。

水合氯醛，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20120110。

4、动物

SD大鼠，SPF级，雄性，253.9±10.4(230～276)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(京)2012-0001。

5、模型制备

大鼠，在腹腔注射12％水合氯醛360mg/kg全麻的条件下，仰卧位固定于手术台上。胸部前外侧手术野去毛，常规消毒。切开皮肤、肌层，肌层行荷包缝合，左侧第四肋间隙开胸，以环形钩拉出心脏。在左心耳下方3～4mm处的冠脉前降支位置，以6/0无损伤丝线穿线，并置直径1.6mm尼龙线，连同冠状动脉前降支一起结扎，另一端留于体外备用。将心脏放回胸腔，排空胸腔内空气，关闭胸腔(假手术组动物仅在相应冠脉位置穿线，不进行结扎,其它手术过程与结扎动物相同)。结扎30min后小心移除尼龙线进行再灌注。缝合肌层及皮肤，肌注青霉素，每天一次，连续3天。

与正常II导联心电图(ECG-II)比较，冠脉结扎后10min，ECG-II的ST段抬高0.2mV以上者作为缺血成功；再灌注后10min，ECG-II中抬高的ST段下降30％以上者作为再灌注成功。不满足上述缺血或缺血再灌注标准的动物表明造型不成功，从实验中剔除。

6、分组及给药

选取造型成功的动物随机分为13组，每组10只。分别为假手术组、模型对照组、受试药物组，以及中药阳性药组、西药阳性药组。

造型成功后30min开始灌胃给药，每天1次，连续7天；每次给药体积为10ml/kg。假手术组和模型对照组给予溶剂对照液(CMC-Na溶液)；受试药组分别给予用本发明方法一、方法二、方法三、方法四、方法五制备的毛郁金有效部位及用本发明方法六制备的四个倍半萜单体化合物莪术二醇、原莪术醇、莪术二酮、zedoarondiol，剂量(按有效部位及单体有效成分的收率折算成相当的生药量)为9g生药/kg及西药单硝酸异山梨酯片，剂量为0.0062g(片重)/kg(相当于临床等效量)；心血康0.144g/kg(相当于临床等效量)。

7、梗死范围测量

实验结束后，取大鼠心脏，以生理盐水冲洗，-20℃进行冷冻处理。在结扎线下将心脏均匀切成2mm厚的切片，置2％TTC 37℃染色10min，经病理图像分析系统测定梗死区占左心室的百分比。

8、血清心肌酶检测

实验结束后，大鼠经腹主动脉取血，4℃，3000rpm×10min离心，取上层血清，Elisa法测定LDH、CK-MB。

9、统计学处理

所有数据均表示为均数±标准差表示，给药前后配对或两组间比较用student’s t-test，P<0.05为差异有统计学意义。

表6对大鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌梗死范围的影响(n＝10)

注：1.与假手术组比较：^△△△P<0.001；2.与模型组比较：^*P<0.05；3.与阳性药组比较：P>0.05.

10、对血清心肌酶的影响

模型组缺血再灌注后7天，血清LDH活性均明显升高。5种方法制备的毛郁金有效部位及分离的四个单体倍半萜类化合物(相当于9g生药/kg)治疗7d后，与模型组相比，均能显著降低LDH(P<0.05)。结果见表7。

表7对大鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌酶的影响(n＝10)

实验结果表明：药物可明显减小缺血所致大鼠心肌损伤心肌梗塞区范围，对冠脉结扎大鼠心肌缺血损伤具有明显的保护作用。