一种应用羊角月牙藻测试采油废水生物毒性的方法

摘要

本发明公开了一种应用羊角月牙藻测试采油废水生物毒性的方法。以采油废水为测试废水，以羊角月牙藻为测试生物，以96孔微孔板为载体；通过96孔微孔板加样分析方法，加样96h后采用多功能酶标仪测试681nm处羊角月牙藻的吸光值；利用实验组与对照组的吸光值来计算羊角月牙藻的生长抑制率，使用毒性单位分级评价法，判断采油废水的生物毒性。本发明方法操作简单，方便快捷，重现性好，能够广泛适用于测试采油废水的毒性。

说明书

技术领域

本发明属于废水生物毒性检测领域，特别涉及一种应用羊角月牙藻测试采油废水生物毒性的方法。

背景技术

采油废水是油田采油过程中，除作为回注、工艺回掺或其它用途等生产用水以外，需外排的废水。其中含石油类、表面活性剂等高分子难降解有机污染物；具有含盐度高，腐蚀性强，水温高等特点。现存的《污水综合排放标准》(GB 8978-1996)，其中规定了废水排放的理化指标限值，不涉及毒性的排放指标。目前废水生物毒性的检测方法有：发光菌毒性试验，藻类毒性试验，溞类毒性试验，鱼类毒性试验，鸟类毒性试验等。其中，藻类作为废水毒性检验的指示生物，具有快速简便，重现性好的优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用羊角月牙藻测试采油废水生物毒性的方法。

具体步骤为：

(1)将采回的浑浊采油废水用0.45μm滤膜过滤，制得处理后的采油废水，然后置于4℃冰箱保存待用，假设处理后的采油废水的浓度为单位1。

(2)培养羊角月牙藻使其达到对数生长期，得到羊角月牙藻藻液，将其作为工作藻液。

(3)将工作藻液加入到预先设置好采油废水浓度梯度的白色透明96孔微孔板中，制作采油废水和工作藻液的反应体系，每孔总体积为200μL，实验孔每孔含100μL工作藻液和100μL不同浓度的采油废水，空白对照孔每孔含100μL工作藻液和100μL超纯水，为防止产生边缘效应，周边孔每孔含200μL超纯水，相同条件下，每个采油废水浓度进行9次重复实验，并取平均值。

(4)96h后，采用多功能酶标仪测试在波长681nm下羊角月牙藻的吸光值RLU，利用实验组与对照组的吸光值来计算羊角月牙藻的生长抑制率，以采油废水的不同浓度为横坐标，以不同浓度对应的生长抑制率为纵坐标，利用Origin9.0中的Logistic函数对不同浓度采油废水与生长抑制率E进行非线性拟合。

式中：I₀为空白对照样的RLU平均值，I为各浓度9次平行样的RLU平均值；最后，利用毒性单位分级评价法，判断采油废水的综合毒性大小。

所述毒性单位分级评价法是指在毒性测试的基础上，将测试结果的EC₅₀转换成TU值以评价废水的毒性大小，具体如下：

则毒性等级和生物毒性分级标准为：当TU＜0.4，毒性等级为1，毒性级别为微毒或无毒，污染级别为基本无污染；当0.4≤TU＜1，毒性等级为2，毒性级别为低毒，污染级别为轻污染；当1≤TU＜10，毒性等级为3，毒性级别为中毒，污染级别为中污染；当10≤TU＜100，毒性等级为4，毒性级别为高毒，污染级别为重污染；当TU≥100，毒性等级为5，毒性级别为剧毒，污染级别为严重污染。

本发明方法操作简单，方便快捷，重现性好，能够广泛适用于测试采油废水毒性。

附图说明

图1为本发明实施例中使用的微孔板加样设计图，其中，b为对照组，100μL超纯水+100μL工作藻液；C₁～C₁₂依次为采油废水从高到低的12个浓度梯度；周边36个孔用于防止产生边缘效应，每孔为200μL超纯水。

图2为本发明实施例中各工艺段采油废水对羊角月牙藻生长抑制率的浓度-效应曲线及比较。

具体实施方式

实施例：

本实施例中的各待测废水样取自某石油涠洲终端处理厂各处理工艺段，五个取样点分别为：原水、ABR池水、ABR池出水、SBR池水、出水，对各取样点的样品进行如下试验：

(1)以各工艺段采油废水为测试废水并进行前处理：

采油废水中含石油类、表面活性剂等高分子难降解有机污染物；具有含盐度高，腐蚀性强，水温高，处理难度大等特点。为了避免浑浊废水对实验结果的影响，将待测样品用0.45μm滤膜过滤后放入4℃冰箱保存待用，假设处理后的采油废水的浓度为单位1。

(2)培养羊角月牙藻使其达到对数生长期，得到羊角月牙藻液，将其作为工作藻液。

(3)以白色透明96孔微孔板为载体，制作采油废水和藻液的反应体系：

羊角月牙藻购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库(FACHB)，编号FACHB-271。收到藻种后，在已紫外消毒10min的超净工作台中，将藻种按1:1比例转接到培养基中培养。

培养基采用BG11培养基，配方见下表。经灭菌锅121℃、101KPa灭菌20min，冷却后，在超净工作台内无菌接种，然后放入人工恒温光照培养箱进行培养，设定温度22℃，光照度约3000lux，光暗周期12h:12h。

每隔5～7d按1:1比例转接藻种，扩大培养，在藻类细胞代谢最旺盛时期接种(上午10～11时)。毒性试验前，转接处于对数生长期的藻种至新鲜培养基培养，培养2d后进行实验。

将达到对数生长期的羊角月牙藻藻液加入到预先设置好废水浓度梯度的白色透明96孔微孔板中，每孔总体积为200μL(实验孔每孔含100μL工作藻液和100μL不同浓度的采油废水，空白对照孔每孔含100μL工作藻液和100μL超纯水，为防止产生边缘效应，周边孔每孔含200μL超纯水)，为减少实验误差，相同条件下，每个采油废水浓度进行9次重复实验，并取平均值。

(4)96h后，采用瑞士Tecan M200PRO多功能酶标仪测试在波长681nm下羊角月牙藻的吸光值RLU，利用实验组与对照组的吸光值来计算羊角月牙藻的生长抑制率，以采油废水的不同浓度为横坐标，以不同浓度对应的生长抑制率为纵坐标，利用Origin9.0中的Logistic函数对不同浓度采油废水与生长抑制率E进行非线性拟合。

式中：I₀为空白对照样的RLU平均值，I为各浓度9次平行样的RLU平均值；最后，根据实验结果及毒性单位分级评价法，某石油涠洲终端处理厂各处理工艺段废水毒性分别为：原水(2.17)、ABR出水(3.89)、ABR池(3.19)、SBR池(2.30)、出水(2.30)，均为中毒。毒性大小为：ABR出水>ABR池>SBR池≈出水>原水。根据结果分析，该处理工艺为ABR+SBR。废水含油率经处理从原水至出水逐级降低。ABR工艺段将原水中烃类及其他大分子有机物氧化分解为小分子的有机物，故其生物毒性增大。经ABR处理后的废水进入SBR工艺后，是将小分子有机物进一步分解并将其作为能源去除。因此该工艺段废水生物毒性低于ABR工艺段。

本实施例显示出显著的测试效果：运用指示生物—羊角月牙藻测试采油废水毒性，计算不同工艺段废水的生长抑制率，利用毒性单位分级评价法，可以判断废水的综合毒性大小，方便快捷，重现性好。