一种DNA分子及其在生产鲑鱼降钙素中应用

摘要

本发明公开了一种DNA分子及其在生产鲑鱼降钙素中应用。本发明所提供的DNA分子为序列表中序列1自5′末端起第22至120位核苷酸所示的DNA分子。实验证明，将该DNA分子插入出发质粒，得到的重组质粒转化油菜品种中双4号，得到转基因植物；待转基因植物成熟后收集种子，然后进行繁育和PCR检测，直至获得纯合种子。每10g纯合种子可产生0.2mg鲑鱼降钙素。可见，本发明所提供的DNA分子可用于生产鲑鱼降钙素，具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种DNA分子及其在生产鲑鱼降钙素中应用。

背景技术

鲑鱼降钙素是由鲑鱼后腮体分泌的由32个氨基酸组成的单链多肽。鲑鱼降钙素作为治疗骨质疏松症等代谢性骨病的防治药已被载入多国药典，并已在多国行销近30年。鲑鱼降钙素具有调节体内钙、磷代谢及骨骼代谢的重要生物学功能，可降低血钙水平，还具有抗组胺、抗胆碱、抑制胃酸和胰腺分泌的作用。临床上主要用于治疗骨质疏松症。鲑鱼降钙素的生产方法主要有提取法、化学合成法和基因工程法。提取法是以鲑鱼、鳗鱼的鳃为原料，提取获得天然鲑鱼降钙素(生物学活性达到4500U/mg)，但由于原料有限，因此获得的天然鲑鱼降钙素极少。基因工程法是在大肠杆菌或酵母中表达鲑鱼降钙素，但由于鲑鱼降钙素C端第32位氨基酸不能酰胺化，因此表达出的鲑鱼降钙素的生物学活性，仅为100-200U/mg。迄今为止，商业化销售的鲑鱼降钙素都是采用化学合成法生产的，化学合成法步骤多、得率低且价格昂贵，注射针剂中的鲑鱼降钙素为12000元/mg，原药价格也高达18000-20000元/g。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备鲑鱼降钙素。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种DNA分子。

本发明所提供的DNA分子，可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)具有序列表中序列1自5′末端起第22至120位核苷酸所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端起第22至120位所示的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有85％或85％以上同一性，且编码鲑鱼降钙素的前体的DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述鲑鱼降钙素的前体的DNA分子。

所述鲑鱼降钙素的前体可为氨基酸序列如序列表中序列5自N末端起第158至190位所示的蛋白质。

含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为将所述DNA分子插入出发质粒，得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为重组质粒pBO-sCT2301。所述重组质粒pBO-sCT2301为将载体pCAMBIA2301的限制性内切酶HindⅢ和EcoRI识别序列间的小片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子，得到的重组质粒。所述重组质粒pBO-sCT2301表达序列表中序列5所示的蛋白质。

所述重组载体具体可为重组质粒pBO-sCT2301-DZ。所述重组质粒pBO-sCT2301和所述重组质粒pBO-sCT2301-DZ的唯一不同在于：所述重组质粒pBO-sCT2301中鲑鱼降钙素的前体的编码基因(即sCT基因)为序列表中序列4自5′末端起第1363至1461位所示，所述重组质粒pBO-sCT2301-DZ中鲑鱼降钙素的前体的编码基因(即sCT-DZ基因)为序列表中序列7自5′末端起第22至120位所示。所述重组质粒pBO-sCT2301-DZ表达序列表中序列5所示的蛋白质。

所述重组微生物可为将所述重组载体导入出发微生物得到的重组菌。所述出发微生物可为根癌农杆菌。所述根癌农杆菌具体可为根癌农杆菌LBA4404。

所述重组微生物具体可为LBA4404/pBO-sCT2301。所述LBA4404/pBO-sCT2301为采用电击法将重组质粒pBO-sCT2301导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌。

所述重组微生物具体可为LBA4404/pBO-sCT2301-DZ。所述LBA4404/pBO-sCT2301-DZ为采用电击法将重组质粒pBO-sCT2301-DZ导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供方法，是将所述DNA分子导入受体植物，得到转基因植物；所述转基因植物可以生产鲑鱼降钙素和/或鲑鱼降钙素的前体。

上述方法中，所述受体植物可为油菜品种中双4号。

上述方法中，所述“将所述DNA分子导入受体植物”是通过将上述任一所述重组载体导入受体植物实现的。

所述DNA分子，或含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在生产所述鲑鱼降钙素的前体中的应用也属于本发明的保护范围。

所述DNA分子，或含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在制备用于生产所述鲑鱼降钙素的前体的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

所述DNA分子，或含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在生产鲑鱼降钙素中应用也属于本发明的保护范围。

所述DNA分子，或含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在制备用于生产鲑鱼降钙素的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

所述鲑鱼降钙素的前体在植物体内可自发形成鲑鱼降钙素。

实验证明，将本发明所提供DNA分子的插入出发质粒，得到的重组质粒转化油菜品种中双4号，得到转基因植物；待转基因植物成熟后收集种子，然后进行繁育和PCR检测，直至获得纯合种子。每10g纯合种子可产生0.2mg鲑鱼降钙素。可见，本发明所提供的DNA分子可用于生产鲑鱼降钙素，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1步骤二中6的实验结果。

图2为实施例1步骤二中7的实验结果。

图3为实施例1步骤二中7的实验结果。

图4为实施例1步骤二中7的实验结果。

图5为实施例1步骤二8中(1)的实验结果。

图6为实施例1步骤二8中(2)的实验结果。

图7为实施例1中步骤三的实验结果。

图8为实施例1中步骤四的实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

油菜品种中双4号记载于如下文献中：罗晓辉，叶明海.“中双4号”育苗移栽高产栽培 [J].上海农业科技，1999年05期.在下文中，油菜品种中双4号简称中双4号。

油菜品种青油14号记载于如下文献中：苏有志.甘蓝型春油菜新品种—青油14号[J].中国农技推广，1997年03期.在下文中，油菜品种青油14号简称青油14号。

豫芝4号记载于如下文献中：曹玉平.豫芝4号.农业科技通讯，1991年11期.

芝麻油体蛋白的GenBank号为AAB58402.1。油菜油体蛋白的GenBank号为X94225.1。

下述实施例中的光暗交替培养(即光照培养和暗培养交替)的条件为：25℃。光照培养时的光照强度为15000Lx。光暗交替培养的周期具体为：14h光照培养/10h黑暗培养。

MS₀培养基：将NH₄NO₃>3>2PO₄>4·7H₂O>2·2H₂O>4·7H₂O>2EDTA>4·4H₂O>4·7H₂O>3BO₃>2M_OO₄·2H₂O>4·5H₂O0.025mg、C_OCl₂·6H₂O>10.1mg、VB₆0.5mg、烟酸0.5mg、甘氨酸2.0mg和琼脂7g溶于1L蒸馏水，调节pH值至5.8。

载体pUC57为百奥迈科生物技术有限公司的产品，产品目录号为BK0033。载体pEASY-T1为北京全式金生物技术有限公司的产品，产品目录号为CT101。载体pCAMBIA2301为华越洋生物(北京)科技有限公司的产品，产品目录号为VECT0310。λDNA/EcoRI+HindⅢMarker为北京康润生物科技有限公司的产品，产品目录号为M125-01。粉碎机为绍兴市科宏仪器有限公司的产品，产品型号为EW-100。鲑鱼降钙素标准品为北京华大蛋白质研发中心有限公司合成。密钙息为Novartis Pharma Stein AG公司的产品。

载体pTΩ4a：将载体pUC19的限制性内切酶HindⅢ和EcoRI识别序列间的小片段替换为序列表中序列8所示的DNA分子得到的重组质粒。载体pUC19为TaKaRa公司的产品，货号为D3219。

实施例1、利用转基因油菜油体表达系统表达鲑鱼降钙素

一、重组质粒pBO-sCT2301的构建

1、人工合成序列表中序列1所示的双链DNA分子。序列表中序列1中，自5′末端起第1至6位为限制性内切酶BamHⅠ的识别序列，第7至21位为肠激酶的识别序列，第22至120位为鲑鱼降钙素的前体的编码基因(以下简称sCT基因)，第121至126位为两个终止密码子，第127至132位为限制性内切酶XhoⅠ的识别序列。

2、将步骤1合成的双链DNA分子连接至载体pUC57，得到重组质粒psCT。

3、提取豫芝4号开花后5周的种子的总RNA，然后该总RNA用M-MLV反转录出第一链cDNA，得到芝麻的cDNA。以芝麻的cDNA为模板，采用引物Olem5：

5′-CTGCAGATGCATCATCACCATCATCATGCGGACGAACC-3′(下划线为限制性内切酶PstI的识别序列)和引物Olem3：5′-ATGGGATCCCGGTCTTATTACATCTTGGCTTC-3′(下划线为限制性内切酶BamHI的识别序列)进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。反应条件为：94℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。

经测序，该PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表中的序列2所示。序列表中序列2中，自5′末端起第1至6位为限制性内切酶PstI的识别序列，第7至9位为起始密码子ATG(编码甲硫氨酸)，第10至27位为编码6×His标签的核苷酸序列，第28至456位为编码芝麻油体蛋白自N末端起第2至144位的核苷酸序列，第457至462位为限制性内切酶BamHI的识别序列。

4、将步骤3获得的PCR扩增产物连接至载体pEASY-T1，得到重组质粒甲。

5、用限制性内切酶PstI和BamHI双酶切重组质粒甲，回收465bp的DNA片段甲。

6、用限制性内切酶PstI和BamHI双酶切载体pTΩ4a，回收约2.7kb的载体骨架甲。

7、将DNA片段甲和载体骨架甲进行连接，得到中间载体甲。

8、用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒psCT，回收132bp的DNA片段乙。

9、用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切中间载体甲，回收约3.0kb的载体骨架乙。

10、将DNA片段乙和载体骨架乙进行连接，得到中间载体乙。

11、以油菜品种青油14的基因组DNA为模板，采用引物NP5：

5′-ATTCAAGCTTGTCGGATCATGACGTTTCCAG-3′(下划线为限制性内切酶HindⅢ的识别序列)和引物NP3：5′-GCTTCTGCAGAATTGAGAGAGATCGAAGAG-3′(下划线为限制性内切酶PstI的识别序列)进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。反应条件为：94℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。

经测序，该PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。序列表中的序列3中，自5′末端起第5至10位为限制性内切酶HindⅢ的识别序列，第11至885位为油菜油体蛋白的启动子的核苷酸序列，第896至901位为限制性内切酶PstI的识别序列。

12、用限制性内切酶HindⅢ和PstI双酶切步骤11获得的PCR扩增产物，回收905bp的DNA片段丙。

13、用限制性内切酶HindⅢ和PstI双酶切中间载体乙，回收约3.1kb的载体骨架丙。

14、将DNA片段丙和载体骨架丙进行连接，得到中间载体丙。

15、用限制性内切酶HindⅢ和EcoRI双酶切中间载体丙，回收约2.0kb的DNA片段丁。

16、用限制性内切酶HindⅢ和EcoRI双酶切载体pCAMBIA2301，回收约11.6kb的载体骨架丁。

17、将DNA片段丁和载体骨架丁进行连接，得到重组质粒pBO-sCT2301。

根据测序结果，对重组质粒pBO-sCT2301进行结构描述如下：将载体pCAMBIA2301的限制性内切酶HindⅢ和EcoRI识别序列间的小片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子。重组质粒pBO-sCT2301表达序列表中序列5所示的融合蛋白甲。

序列表中序列4中，自5′末端起第1至875位为油菜油体蛋白的启动子的核苷酸序列，第886至891位为限制性内切酶PstI的识别序列，第892至894位为起始密码子ATG(编码甲硫氨酸)，第895至912位为编码6×His标签的核苷酸序列，第913至1341位为编码芝麻油体蛋白自N末端起第2至144位的核苷酸序列，第1342至1347位为限制性内切酶BamHI的识别序列，第1348至1362位为肠激酶的识别序列，第1363至1461位为鲑鱼降钙素的前体的编码基因，第1462至1467位为两个终止密码子，第1468至1473位为限制性内切酶XhoⅠ的识别序列，第1474至1721位为Nos polyA终止子的核苷酸序列。

序列表中序列5中，自N末端起第1位为甲硫氨酸(起始氨基酸)，第2至7位为6×His标签，第8至150位为芝麻油体蛋白自N末端起第2至144位，第153至157位为肠激酶的识别位点，第158至190位为鲑鱼降钙素的前体。

二、油菜遗传转化

1、农杆菌侵染液的制备

(1)采用电击法将重组质粒pBO-sCT2301导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌，命名为LBA4404/pBO-sCT2301。

(2)将LBA4404/pBO-sCT2301的单克隆接种至5mL含100mg/L卡那霉素(Kanamycin，Kan) 和50mg/L利福平(Rifampicin，Rif)的YEB液体培养基，28℃、200rpm振荡培养12h，得到培养菌液1。

(3)将1mL培养菌液1接种至50mL含100mg/L Kan和50mg/L Rif的YEB液体培养基，28℃、200rpm振荡培养至OD_600nm值为0.3～0.4，得到培养菌液2。

(4)取步骤(3)得到的培养菌液2，4℃、5000rpm离心5min，收集菌体1。

(5)取步骤(4)收集的菌体1，用含1.0mg/L 6-BA的MS₀培养基重悬，然后4℃、5000rpm离心5min，收集菌体2。

(6)取步骤(5)收集的菌体2，用含100mg/L乙酰丁香酮(Acetosyringone，As)的MS₀培养基重悬，得到农杆菌侵染液。以含100mg/L>0培养基为参照，调整农杆菌侵染液的OD_600nm值至0.15～0.25。

2、中双4号的子叶的获得

取中双4号的种子，先用75％(v/v)的乙醇水溶液浸泡2min，然后用次氯酸钠水溶液(由1体积份次氯酸钠溶液(有效氯≥10.0)和4体积份水混合而成)浸泡10min，最后用无菌水反复冲洗，沥干后接种于MS₀培养基上，光暗交替培养5d，得到中双4号的材料。

取中双4号的材料，剪取子叶(尽量靠近生长点)，得到中双4号的子叶。

3、侵染

取步骤2获得的中双4号的子叶，置于离心管，然后加入农杆菌侵染液(OD_600nm值为0.2)浸泡10min。

4、共培养

完成步骤3后，将所述中双4号的子叶转移至共培养培养基上(子叶需正面朝上)共培养4d。

共培养培养基：含1.25mg/L NAA、5.0mg/L 6-BA和5.0mg/L AgNO₃的MS₀培养基。

共培养条件：25℃，暗培养。

5、选择培养

完成步骤4后，将所述中双4号的子叶转移至选择培养基上(子叶需正面朝上)，光暗交替培养4d。

选择培养基：含1.0mg/L NAA、3.0mg/L 6-BA和100mg/L头孢噻吩(cefalotin，Cf)的MS₀培养基。

6、分化培养

完成步骤5后，将所述中双4号的子叶转移至分化培养基上(子叶需正面朝上)，光暗交替培养4周，得到长约1cm的分化芽(见图1)。

分化培养基：含0.2mg/L NAA、2.0mg/L 6-BA、40mg/L Kan、100mg/L Cf的MS₀培养基。

7、生根培养

完成步骤6后，将所述分化芽转移至生根培养基上，光暗交替培养2周，获得拟转sCT基因油菜(见图2和图3)，然后将拟转sCT基因油菜移栽至营养土正常培养(见图4)。

生根培养基：含100mg/L Kan和100mg/L Cf的MS₀培养基。

随机选择6株拟转sCT基因油菜，依次命名为Siv1、Siv3、Siv4、Siv7、Siv11和Siv12。

8、分子检测

(1)PCR检测

分别提取步骤7获得的6株拟转sCT基因油菜叶片的基因组DNA并作为模板，以CT5：

5'-GCCGGTCTCATTCTTACC-3'和CT3：5'-CTCAGCCTCGAGTTACTATCC-3'为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。用等体积超纯水代替拟转sCT基因油菜的叶片的基因组DNA，作为阴性对照。用等体积重组质粒pBO-sCT2301的DNA代替拟转sCT基因油菜的叶片的基因组DNA，作为阳性对照。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保持。

PCR扩增反应完成后，取10μL PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。实验结果见图5(泳道1为λDNA/EcoRI+HindⅢMarker，泳道2为Siv1，泳道3为Siv3，泳道4为Siv4，泳道5为Siv7，泳道6为Siv11，泳道7为Siv12，泳道8为阳性对照，泳道9为阴性对照)。结果表明，如果以拟转sCT基因油菜的叶片的基因组DNA为模板，能够扩增出约433bp的条带，则该拟转sCT基因油菜即为转sCT基因油菜；阴性对照不能获得433bp的条带；阳性对照可以获得433bp的条带。

(2)RT-PCR检测

编码芝麻油体蛋白的基因(以下简称芝麻油体基因)是在种子中特异表达的基因，一般在开花后4-6周的种子中开始转录，9-11周的种子中mRNA的含量达到最高水平，种子的成熟后期的mRNA含量急剧降低。

(a)提取待测油菜(Siv1、Siv3、Siv4、Siv7、Siv11或Siv12)开花后9-11周的种子的总RNA，然后该总RNA用M-MLV反转录出第一链cDNA，得到待测油菜的cDNA。待测油菜的cDNA中，DNA浓度为500ng/μL。

(b)以步骤(a)得到的待测油菜的cDNA为模板，以CT5：5'-GCCGGTCTCATTCTTACC-3'和CT3：5'-CTCAGCCTCGAGTTACTATCC-3'为引物进行RT-PCR扩增，得到PCR扩增产物。用等体积超纯水代替待测油菜的cDNA，作为阴性对照。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保持。

PCR扩增反应完成后，取10μL PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。实验结果见图6(泳道1为λDNA/EcoRI+HindⅢMarker，泳道2为Siv1，泳道3为Siv3，泳道4为Siv4，泳道5为阴性对照)。结果表明，如果以拟转sCT基因油菜的cDNA为模板，能够扩增出约433bp的条带，则该拟转sCT基因油菜即为转sCT基因油菜，说明sCT基因已经整合到中双4号的基因组，并转录表达；阴性对照不能获得433bp的条带。

PCR检测和RT-PCR检测的结果完全一致。因此，Siv1、Siv3、Siv4、Siv7、Siv11和Siv12均为转sCT基因油菜。

待Siv1成熟后收集种子，然后进行繁育和PCR检测，直至获得纯合种子。将该纯合种子命名为Siv1种子，进行后续实验。

三、鲑鱼降钙素的提取和纯化

1、转sCT基因油菜油体的提取

提取缓冲液为含2.5mM EDTA和500mM NaCl的pH8.0、20mM Tris-HCl缓冲液。

(1)取5g步骤二收集的Siv1种子，用粉碎机粉碎(粉碎程度200目)，得到油菜籽粉。

(2)完成步骤(1)后，取离心管(规格为50mL)，加入油菜籽粉和30mL提取缓冲液，充分混匀，然后置于冰上30min。

(3)完成步骤(2)后，取所述离心管，4℃、15000g离心30min。离心后，液相体系呈现两层分层，上层为油体甲，下层为溶液甲。

(4)完成步骤(3)后，取一新的离心管(规格为50mL)，加入收集的油体甲和30mL提取缓冲液，充分混匀，4℃、15000g离心30min。离心后，液相体系呈现两层分层，上层为油体乙，下层为溶液乙。

(5)完成步骤(4)后，取一新的离心管(规格为50mL)，加入收集的油体乙和30mL提取缓冲液，充分混匀，4℃、15000g离心30min。离心后，液相体系呈现两层分层，上层为油体丙，下层为溶液丙。

收集油体丙，备用。

2、His-tag初步纯化

镍离子螯合磁珠的商品名称为BeaverBeads^TM>

Buffer A为含500mM NaCl和10mM咪唑的pH7.4、20mM磷酸钠缓冲液。

Buffer B为含500mM NaCl和50mM咪唑的pH7.4、20mM磷酸钠缓冲液。

Buffer C为含500mM NaCl和500mM咪唑的pH7.4、20mM磷酸钠缓冲液。

(1)取离心管，加入油体丙和30mL Buffer A，充分混匀，4℃、15000g离心30min。离心后，液相体系呈现两层分层，上层为油体丁，下层为溶液丁。

(2)取一新的离心管，加入油体丁和10mL Buffer A，充分混匀；然后加入1mL镍离子螯合磁珠，充分悬浮后置于旋转混合仪上温育60min；最后通过磁性分离，将所述镍离子螯合磁珠转移到新的离心管中。

(3)完成步骤(2)后，取装有所述镍离子螯合磁珠的离心管，加入10mL Buffer B，用移液器轻轻吹打数次，使所述镍离子螯合磁珠重新悬浮，然后通过磁性分离，将所述镍离子螯合磁珠转移到新的离心管中。

(4)重复步骤(3)两次。

(5)完成步骤(4)后，取装有所述镍离子螯合磁珠的离心管，加入5mL Buffer C，用移液器轻轻吹打数次，使所述镍离子螯合磁珠重新悬浮，然后通过磁性分离，收集上清液。

(6)将步骤(5)收集的上清液利用分子量为3kD的超滤管进行超滤浓缩，获得融合蛋白乙的浓缩液。

鲑鱼降钙素主要用于治疗骨质疏松症。通过基因工程法生产鲑鱼降钙素，主要是在大肠杆菌或酵母中表达鲑鱼降钙素，但由于鲑鱼降钙素C端第32位氨基酸不能酰胺化，因此表达出的鲑鱼降钙素的生物学活性仅为100-200U/mg；而天然的鲑鱼降钙素的生物学活性为4500U/mg。已有研究结果表明，鲑鱼降钙素的前体(氨基酸序列如序列表中序列5自N末端起第158至190位所示)通过植物自身的酰胺化系统，可转化为鲑鱼降钙素。

融合蛋白乙的氨基酸序列如序列表中序列6所示，且其C末端酰胺化。融合蛋白乙在转sCT基因油菜体内经过如下转化得到：转sCT基因油菜中首先表达融合蛋白甲，之后通过自身的酰胺化系统，将融合蛋白甲转化为C末端酰胺化的融合蛋白乙。

3、肠激酶酶切

(1)取融合蛋白乙的浓缩液，加入酶切buffer和肠激酶，得到酶切反应体系；酶切反应体系中，融合蛋白乙的浓度为1mg/mL，肠激酶的加入量为每100μg融合蛋白乙加入1U肠激酶。

酶切buffer和肠激酶均为大肠杆菌表达重组肠激酶中的组件；大肠杆菌表达重组肠激酶 具体可为上海翊圣生物科技有限公司的产品，产品目录号为20401ES80。

(2)完成步骤(1)后，取所述酶切反应体系，先21℃酶切16h，然后4℃、15000g离心20min，收集上清液。

4、阳离子交换纯化

将步骤3收集的上清液在AKTA蛋白纯化系统上经阳离子交换层析纯化，得到鲑鱼降钙素溶液。具体步骤如下：

(1)将1体积份步骤3收集的上清液和3体积份pH3.0、10mM柠檬酸钠缓冲液混合，得到混合液(电导率为7mS/cm)；然后将混合液用0.22μM的滤膜过滤，得到上样液。

(2)取SP-Sepharose fast flow(5×1mL)(美国GE公司的产品)，先用10个柱体积的pH3.0、10mM柠檬酸钠缓冲液预平衡(流速为1mL/min)。

(3)完成步骤(2)后，取步骤(1)得到的上样液，进行上样(流速为0.5mL/min)。

(4)完成步骤(3)后，用10个柱体积的pH3.0、10mM柠檬酸钠缓冲液洗脱(流速为1mL/min)至紫外检测基线平稳(检测波长为220nm)。

(5)完成步骤(4)后，用含400mM NaCl的pH3.0、10mM柠檬酸钠缓冲液进行洗脱(流速为0.5mL/min)，收集洗脱峰约5-10mL的洗脱溶液。

5、醋酸化

(1)取步骤4收集的洗脱溶液，先加入磷酸调节pH值至2.0，得到溶液1。

(2)取1体积份溶液1，加入3体积份浓度为333mM的醋酸钠水溶液，混合均匀，得到溶液2。

(3)取所述溶液2，室温放置60min，得到溶液3。

6、反相色谱脱盐及冻干

Amberchrom CG300md resin为北京慧德易科技有限责任公司的产品。

(1)取Amberchrom CG300md resin，用10个柱体积的0.1％(v/v)醋酸水溶液洗脱(流速为5mL/min)至电导率基线平稳。

(2)完成步骤(1)后，用10个柱体积的浓度为250mM醋酸钠水溶液洗脱(流速为5mL/min)至pH值基线平稳。

(3)完成步骤(2)后，取步骤5得到的溶液3，进行上样(流速2mL/min)。

(4)完成步骤(3)后，用10个柱体积的浓度为250mM醋酸钠水溶液洗脱(流速为5mL/min)至pH值基线平稳。

(5)完成步骤(4)后，用10个柱体积的0.1％(v/v)醋酸水溶液洗脱(流速为5mL/min)至电导率基线平稳。

(6)完成步骤(5)后，用40％(v/v)乙醇水溶液洗脱(流速为2mL/min)，收集洗脱峰约5-10mL的洗脱溶液。

(7)用冷冻干燥机将步骤(6)收集的洗脱溶液冻干至粉末，即鲑鱼降钙素粉末。-20℃备用。

取1mg鲑鱼降钙素粉末，加入1mL超纯水溶解，得到鲑鱼降钙素溶液。

将鲑鱼降钙素溶液和浓度为1mg/mL鲑鱼降钙素标准品水溶液进行SDS-PAGE。

实验结果见图7(1为蛋白Marker，2为鲑鱼降钙素标准品水溶液，3为鲑鱼降钙素溶液)。结果表明，鲑鱼降钙素溶液中含有鲑鱼降钙素，纯度约90％。每10g步骤二收集的Siv1种子产生0.2mg鲑鱼降钙素(以100％纯度计)。

四、鲑鱼降钙素的HPLC检测

使用配有Agilent Zorbax SB C18柱(5.0μm，150mm×2.1mm)的Agilent 1200液相色谱仪分析步骤三中的鲑鱼降钙素溶液和浓度为1mg/mL的鲑鱼降钙素标准品水溶液。进样量20μL。流动相由0.1％(v/v)三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)水溶液(A液)和0.1％(v/v)TFA乙腈溶液(B液)组成，流速为0.2mL/min，使用流动相中B液递增、A液递减的梯度洗脱条件进行梯度洗脱，具体如下(％均为体积百分比)：0-8min，流动相中B液的体积百分含量由10％匀速升至30％；8-50min，流动相中B液的体积百分含量由30％匀速升至55％；50-55min，流动相中B液的体积百分含量由55％匀速升至100％。检测波长为210nm。

实验结果见图8(A为鲑鱼降钙素标准品水溶液，B为步骤三中的鲑鱼降钙素溶液)：步骤三中的鲑鱼降钙素溶液与鲑鱼降钙素标准品水溶液的目的峰出峰时间基本一致(见图8中箭头标注，出峰时间约为6.0min)。结果表明，步骤三中的鲑鱼降钙素溶液中含有鲑鱼降钙素。

五、检测鲑鱼降钙素的生物学活性

Vr:CD1(ICR)小鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司的产品。钙测定试剂盒为北京中生北控生物科技股份有限公司的产品。

1、取30只体重为24-26g的健康Vr:CD1(ICR)小鼠，随机分成鲑鱼降钙素组、密钙息组和生理盐水组(每组10只，雌雄各半)，禁食10-12h(仅给蒸馏水)后，分别进行如下处理：

鲑鱼降钙素组：尾静脉注射步骤三中的鲑鱼降钙素溶液(注射剂量为0.1mL/只)；

密钙息组：尾静脉注射密钙息(注射剂量为0.5IU/只)；

生理盐水组：尾静脉注射0.9％(0.9mg/100mL)生理盐水(注射剂量为0.1mL/只)。

2、完成步骤1 60min后，每只小鼠先腹腔注射10％(10mg/100mL)水合氯醛水溶液(注射剂量为0.15mL/只)，再分别从眼眶取血，室温静置2h；最后3000g离心15min，上清液即为血清。

3、完成步骤2后，取血清，按照钙测定试剂盒的操作步骤，用全自动生化分析测定每只小鼠的血钙浓度。

实验结果见表1。结果表明，密钙息组小鼠的血钙浓度比生理盐水组降低20％，鲑鱼降钙素组小鼠的血钙浓度比生理盐水组降低23％，方差分析差异极显著。因此，使用步骤一至步骤三的方法获得的鲑鱼降钙素溶液具有降低血钙的生物学活性。

表1

实施例2、利用转基因油菜油体表达系统表达鲑鱼降钙素

按照实施例1步骤一至步骤三的方法，将步骤一中的重组质粒pBO-sCT2301替换为重组质粒pBO-sCT2301-DZ，其它步骤均不变，得到鲑鱼降钙素溶液；每10g油菜种子产生0.16mg鲑鱼降钙素(以100％纯度计)。

重组质粒pBO-sCT2301-DZ的构建方法为：按照实施例1步骤一的方法，将步骤1中“人工合成序列表中序列1所示的双链DNA分子”替换为“人工合成序列表中序列7所示的双链DNA分子”，其它步骤均不变，得到重组质粒pBO-sCT2301-DZ。重组质粒pBO-sCT2301-DZ也表达序列表中序列5所示的融合蛋白甲。

序列表中序列7中，自5′末端起第1至6位为限制性内切酶BamHⅠ的识别序列，第7至21位为肠激酶的识别序列，第22至120位为鲑鱼降钙素的前体的编码基因(以下简称sCT-DZ基因)，第121至126位为两个终止密码子，第127至132位为限制性内切酶XhoⅠ的识别序列。重组质粒pBO-sCT2301和重组质粒pBO-sCT2301-DZ的唯一不同在于：重组质粒pBO-sCT2301的鲑鱼降钙素的前体的编码基因(即sCT基因)为序列表中序列1自5′末端起第22至120位所示，重组质粒pBO-sCT2301-DZ的鲑鱼降钙素的前体的编码基因(即sCT-DZ基因)为序列表中序列7自5′末端起第22至120位所示。

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 一种DNA分子及其在生产鲑鱼降钙素中应用

<160> 8

<170> PatentInversion3.5

<210>1

<211>132

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

ggatccgatg atgacgataa gtgctcaaac ttgtctacct gtgttcttgg taagttgtct60

caggaacttc acaagttgca aacctaccca aggactaaca ctggttctgg aaccccagga 120

tagtaactcg ag 132

<210>2

<211>465

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ctgcagatgc atcatcacca tcatcatgcg gacgaacccc acgaccagcg ccccaccgac60

gtcatcaaga gctacctccc cgaaaagggt ccctccacct ctcaagtcct cgccgtcgtg 120

accctcttcc ccctcggcgc cgtcctcctc tgcctagccg gtctcattct taccgggacc 180

atcatcggcc tcgccgtcgc caccccgctc ttcgtcatct tcagccccat cttggtcccc 240

gccgccctaa ccatcgccct agccgtcacc ggtttcttga cctccggagc tttcggcatc 300

accgccctgt cctcgatttc gtggttgctg aactacgtta ggcgaatgcg ggggagcttg 360

ccagagcagc tggatcatgc acggcggcgc gtgcaggaga cggtgggcca gaagacaagg 420

gaggcggggc agagaagcca agatgtaata agaccgggat cccat 465

<210>3

<211>905

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

attcaagctt gtcggatcat gacgtttcca gaaaacatcg agcaagctct caaagctgac60

ctctttcgga tcgtactgaa cccgaacaat ctcgttatgc cccgtcgtct ccgaacagac 120

atcctcgtaa gtaggattgt cgacgaatcc atggctatac ccaacctccg tcttcgtcac 180

gcctggaacc ctctggtaag ccaattccgc tccccagaag caaccggcgc cgaattgcgc 240

gaattgctga ccaggcgaag gaacatcgtc gtcgggtcct tgtgcgattg cggaggaagc 300

cgccgggtcg ggttggggac gagacccgaa tccgagcctg gtgaataggt tgttcatcgg 360

agatttatag acggagatgg atcgagcggt tttggggaaa ggggaagtgg gtttggctct 420

tttggataga gagagtgcag ctttggcgag agactggaga ggtttagaga gagacacggc 480

ggagattacc ggaggagagg cgacgataga tagcattatc gaagggacgg gagaaagagt 540

gacgtggaga aataagaaac cgttaagagt cggatattta ttatattaaa agcccactgg 600

gcctaaaccc atttaaacaa gacaagataa atgggccgtg tgtgagtgtt aacgttcggt 660

ttcaaatgcc aacgccattg gaacaaaaca aacgtgtcct caagtaaacc cctgtcgttt 720

acacctcaat ggctgcatgg tgaagccatt aacacgtggc gtagaatgca tgacgacgcc 780

attgacacct gactctcttt ccttctcttc atatatctct aatcaattca acactcattg 840

tcatagctat tcggaaaata tatacacatc cttttctctt cgatctctct caattctgca 900

gaagc 905

<210>4

<211>1721

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

gtcggatcat gacgtttcca gaaaacatcg agcaagctct caaagctgac ctctttcgga60

tcgtactgaa cccgaacaat ctcgttatgc cccgtcgtct ccgaacagac atcctcgtaa 120

gtaggattgt cgacgaatcc atggctatac ccaacctccg tcttcgtcac gcctggaacc 180

ctctggtaag ccaattccgc tccccagaag caaccggcgc cgaattgcgc gaattgctga 240

ccaggcgaag gaacatcgtc gtcgggtcct tgtgcgattg cggaggaagc cgccgggtcg 300

ggttggggac gagacccgaa tccgagcctg gtgaataggt tgttcatcgg agatttatag 360

acggagatgg atcgagcggt tttggggaaa ggggaagtgg gtttggctct tttggataga 420

gagagtgcag ctttggcgag agactggaga ggtttagaga gagacacggc ggagattacc 480

ggaggagagg cgacgataga tagcattatc gaagggacgg gagaaagagt gacgtggaga 540

aataagaaac cgttaagagt cggatattta ttatattaaa agcccactgg gcctaaaccc 600

atttaaacaa gacaagataa atgggccgtg tgtgagtgtt aacgttcggt ttcaaatgcc 660

aacgccattg gaacaaaaca aacgtgtcct caagtaaacc cctgtcgttt acacctcaat 720

ggctgcatgg tgaagccatt aacacgtggc gtagaatgca tgacgacgcc attgacacct 780

gactctcttt ccttctcttc atatatctct aatcaattca acactcattg tcatagctat 840

tcggaaaata tatacacatc cttttctctt cgatctctct caattctgca gatgcatcat 900

caccatcatc atgcggacga accccacgac cagcgcccca ccgacgtcat caagagctac 960

ctccccgaaa agggtccctc cacctctcaa gtcctcgccg tcgtgaccct cttccccctc1020

ggcgccgtcc tcctctgcct agccggtctc attcttaccg ggaccatcat cggcctcgcc1080

gtcgccaccc cgctcttcgt catcttcagc cccatcttgg tccccgccgc cctaaccatc1140

gccctagccg tcaccggttt cttgacctcc ggagctttcg gcatcaccgc cctgtcctcg1200

atttcgtggt tgctgaacta cgttaggcga atgcggggga gcttgccaga gcagctggat1260

catgcacggc ggcgcgtgca ggagacggtg ggccagaaga caagggaggc ggggcagaga1320

agccaagatg taataagacc gggatccgat gatgacgata agtgctcaaa cttgtctacc1380

tgtgttcttg gtaagttgtc tcaggaactt cacaagttgc aaacctaccc aaggactaac1440

actggttctg gaaccccagg atagtaactc gaggctgagt aaggttaact ttgagtatta1500

tggcattgga aaagccattg ttctgcttgt aatttactgt gttctttcag ttttgttttc1560

ggacatcaag ttaaccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaat tttaccaaaa aaaaaaaaaa1620

aaaaaaaaaa atttccccaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atttaaagag ctcgaatttc1680

cccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat t1721

<210>5

<211>190

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

Met His His His His His His Ala Asp Glu Pro His Asp Gln Arg Pro

1 5 1015

Thr Asp Val Ile Lys Ser Tyr Leu Pro Glu Lys Gly Pro Ser Thr Ser

202530

Gln Val Leu Ala Val Val Thr Leu Phe Pro Leu Gly Ala Val Leu Leu

354045

Cys Leu Ala Gly Leu Ile Leu Thr Gly Thr Ile Ile Gly Leu Ala Val

505560

Ala Thr Pro Leu Phe Val Ile Phe Ser Pro Ile Leu Val Pro Ala Ala

65707580

Leu Thr Ile Ala Leu Ala Val Thr Gly Phe Leu Thr Ser Gly Ala Phe

859095

Gly Ile Thr Ala Leu Ser Ser Ile Ser Trp Leu Leu Asn Tyr Val Arg

100 105 110

Arg Met Arg Gly Ser Leu Pro Glu Gln Leu Asp His Ala Arg Arg Arg

115 120 125

Val Gln Glu Thr Val Gly Gln Lys Thr Arg Glu Ala Gly Gln Arg Ser

130 135 140

Gln Asp Val Ile Arg Pro Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys Cys Ser Asn

145 150 155 160

Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu

165 170 175

Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro Gly

180 185 190

<210>6

<211>189

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

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1 5 1015

Thr Asp Val Ile Lys Ser Tyr Leu Pro Glu Lys Gly Pro Ser Thr Ser

202530

Gln Val Leu Ala Val Val Thr Leu Phe Pro Leu Gly Ala Val Leu Leu

354045

Cys Leu Ala Gly Leu Ile Leu Thr Gly Thr Ile Ile Gly Leu Ala Val

505560

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65707580

Leu Thr Ile Ala Leu Ala Val Thr Gly Phe Leu Thr Ser Gly Ala Phe

859095

Gly Ile Thr Ala Leu Ser Ser Ile Ser Trp Leu Leu Asn Tyr Val Arg

100 105 110

Arg Met Arg Gly Ser Leu Pro Glu Gln Leu Asp His Ala Arg Arg Arg

115 120 125

Val Gln Glu Thr Val Gly Gln Lys Thr Arg Glu Ala Gly Gln Arg Ser

130 135 140

Gln Asp Val Ile Arg Pro Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys Cys Ser Asn

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Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu

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<212>DNA

<213>人工序列

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ggatccgatg atgacgataa gtgctctaac ctttctactt gcgttttggg aaagttgtct60

caagagcttc ataagcttca aacttaccca agaactaaca ccggatctgg aactccagga 120

tagtaactcg ag 132

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca 480

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