一种自麦考酚酸菌株制备麦考酚钠的方法

摘要

本发明提供了一种自麦考酚酸菌株制备麦考酚钠的方法，包括：取麦考酚酸菌株产生菌孢子悬浮液，接种于种子培养基上在26～28℃下培养2～4天；种子培养基接种于发酵罐内并添加发酵培养基，26～28℃下发酵9～11天；向发酵液中添加酸使发酵液的pH呈3～4，然后向发酵液中添加氢氧化钠溶液使发酵液的pH呈8～9，脱色重结晶后得到麦考酚酸；将麦考酚酸与氢氧化钠或甲醇钠于醇类溶剂中合成麦考酚钠。在本发明中，将麦考芬酸菌株经过培养后得到的发酵液经过酸碱处理，并用氢氧化钠或者甲醇钠合成生成麦考酚钠，具有制备路线短，操作程序简单，制造成本较低的优点；同时，避免使用酮类有机溶剂，降低了对环境及人体的危害。

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种自麦考酚酸菌株制备麦考酚钠的方法。

背景技术

麦考酚钠又名霉酚酸钠，是一种从麦考酚酸通过合成得到的免疫抑制剂，分子式：C₁₇H₁₉NaO₆，分子量：342.3。麦考酚钠的化学结构式如下式(1)所示。

麦考酚钠(MPS)是麦考酚酸(MPA)的钠盐。麦考酚酸是一种选择性、非竞争性、可逆的次黄嘌呤单磷酸脱氢酶(IMPDH)抑制剂，能够抑制鸟嘌呤核苷酸的经典合成途径而不损伤DNA的合成。麦考酚钠适用于与环孢素和皮质类固醇合用，用于对接受同种异体肾移植成年患者急性排斥反应的预防。免疫抑制剂的研发和应用是器官移植发展史上的一个重要的里程碑，它促进和推动了临床肾移植数量的提高和质量的改善。使肾移植成为当今因为各种原发疾病引起肾功能衰竭的常规治疗方法。

目前，制备麦考酚钠主要包括固态发酵法与液态发酵法。但是固态发酵法存在合成稳定性低的缺陷。液态发酵法在培养后期，培养基会塌陷会塌缩变硬，不利于传质与传热。公告号CN101348810B的中国发明专利公开了“麦考芬酸的固态发酵法”，其需要使用非惰性载体。这种非惰性载体在产业化应用过车中会产生大量的废料，从而导致对环境造成一定的污染；另一方面该现有也无法直接制备得到终品“麦考酚钠”，从而导致合成路线较长。同时，在目前的液态发酵法中，微生物细胞的代谢产物及微生物环境也会对麦考酚钠的前体(即“麦考酚酸”)造成不良影响。

有鉴于此，有必要对现有技术中的麦考酚钠的制备方法予以改进，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于公开一种自麦考酚酸菌株制备麦考酚钠的方法，用以实现缩短合成路线，降低制造成本，降低制备麦考酚钠的过程中所产生的副产品对环境所造成的污染，并提高重现性。

为实现上述发明目的，本发明提供了自麦考酚酸菌株制备麦考酚钠的方法，包括以下步骤：

步骤(1)、取麦考酚酸菌株产生菌孢子悬浮液，接种于种子培养基上在26～28℃下培养2～4天；

步骤(2)、种子培养基接种于发酵罐内并添加发酵培养基，26～28℃下发酵9～11天，发酵完成后进行放罐以提取发酵液；

步骤(3)、向发酵液中添加酸使发酵液的pH呈3～4，然后向发酵液中添加氢氧化钠溶液使发酵液的pH呈8～9，板框过滤，滤液再用酸调至pH呈2～3，过滤，得到麦考酚酸粗品，将麦考酚酸粗品溶于醇类溶剂后脱色，重结晶后得到麦考酚酸；

步骤(4)、将麦考酚酸与氢氧化钠或甲醇钠于醇类溶剂中合成麦考酚钠，其中，反应温度为40～60℃，反应时间1～3小时；

步骤(5)、将步骤(4)得到的反应液浓缩后结晶，过滤，干燥。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(1)中的种子培养基的组成为：黄豆饼粉5～15g/L，乳糖40～60g/L，玉米浆干粉20～40g/L，硝酸铵1～3g/L，磷酸二氢钾1～3g/L，碳酸钙1～3g/L。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(2)中的发酵培养基的组成为：黄豆饼粉15～25g/L，玉米淀粉5～15g/L，葡萄糖45～65g/L，果糖70～90g/L，玉米浆干粉45～55g/L，碳酸钙1～3g/L，蛋氨酸2～4g/L，磷酸二氢钾0.5～1.5g/L。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(3)中的酸选自盐酸或硫酸，浓度为6～12mol/L，所述步骤(3)中的醇类溶剂选自乙醇或甲醇。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(4)中的醇类溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇或正丁醇。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(5)中的结晶方式为浓缩结晶或冷却结晶；其中，浓缩结晶的温度为40～60℃，冷却结晶的温度为0～10℃。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(5)中的干燥方式为真空干燥，真空干燥的温度为40～50℃，真空干燥的真空度为0.1～0.5MPa。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：在本发明中，麦考芬酸菌株经过培养后得到的发酵液经过酸碱处理，并用氢氧化钠或者甲醇钠合成生成麦考酚钠，具有制备路线短，操作程序简单，制造成本较低的优点；同时，避免使用酮类有机溶剂，降低了对环境及人体的危害。

具体实施方式

下面结合各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。

除非说明书中有特殊说明，本发明中的各个实施例中的组分、原料均采用分析纯级别。另外，各实施例中的“g”为重量单位“克”；“h”为时间单位“小时”；“ml”为体积单位“毫升”；“室温”为23℃；“HPLC”为“高效液相色谱法”。

实施例一：

该自麦考酚酸菌株制备麦考酚钠的方法包括以下步骤。

步骤(1)、取麦考酚酸产生菌孢子悬液，接种于种子培养基上，28℃下培养4天。该种子培养基中的各组分为(单位：g/L)：黄豆饼粉5，乳糖40，玉米浆干粉20，硝酸铵1，磷酸二氢钾1，碳酸钙1，余量为水。

步骤(2)、种子培养基接种于发酵罐内并添加发酵培养基，26℃培养10天。发酵培养基中的各组分(单位：g/L)：黄豆饼粉15，玉米淀粉5，葡萄糖45，果糖70，玉米浆干粉45，碳酸钙1，蛋氨酸2，磷酸二氢钾0.5，余量为水。发酵完毕后进行放罐以提取发酵液。

步骤(3)、向发酵液中添加酸使发酵液酸化至pH呈3.0，然后向发酵液中添加氢氧化钠溶液使发酵液的pH呈8.0。板框过滤，滤液再用酸调至pH呈2.0，过滤，得到麦考酚酸粗品；将麦考酚酸粗品溶于醇类溶剂后脱色，重结晶后得到麦考酚酸。本实施例中，所用的酸为质量浓度为10wt％的稀硫酸。

步骤(4)、将麦考酚酸与氢氧化钠于甲醇进行合成反应，以生成麦考酚钠，反应温度50℃，反应时间2小时。

步骤(5)、将步骤(4)所的反应液结晶，过滤，干燥，即得终品麦考酚钠。在本实施例中，结晶方式为0℃冷却结晶。干燥温度40℃。

本实施例所制得的固体(即“麦考酚钠”)经理化检测，熔点符合相关文献规定的189～191℃，且熔点为189.5～190.1℃，经HPLC检测，通过本方法制得的麦考酚钠的纯度为99.91％。

实施例二：

该自麦考酚酸菌株制备麦考酚钠的方法包括以下步骤。

步骤(1)、取麦考酚酸产生菌孢子悬液，接种于培养基上，26℃下培养3天；该种子培养基中的各组分为(单位：g/L)：黄豆饼粉10，乳糖50，玉米浆干粉25，硝酸铵2，磷酸二氢钾2，碳酸钙2，余量为水。

步骤(2)、种子培养基接种于发酵罐内并添加发酵培养基，26℃培养9天。发酵培养基中的各组分为(单位：g/L)：黄豆饼粉20，玉米淀粉10，葡萄糖50，果糖80，玉米浆干粉50，碳酸钙1，蛋氨酸3，磷酸二氢钾0.5，余量为水。发酵完毕后进行放罐以提取发酵液。

步骤(3)、向发酵液中添加酸使发酵液酸化至pH呈4.0，然后向发酵液中添加氢氧化钠溶液使发酵液的pH呈9.0。板框过滤，滤液再用酸调至pH呈3.0，过滤，得到麦考酚酸粗品；将麦考酚酸粗品溶于醇类溶剂后脱色，重结晶后得到麦考酚酸。本实施例中，所用的酸为质量浓度为5wt％的稀硫酸。

步骤(4)、将麦考酚酸与氢氧化钠于乙醇中进行合成反应以生产麦考酚钠，反应温度40℃，反应时间3小时。

步骤(5)、将步骤(4)得到的反应液浓缩，结晶，干燥，即得终品麦考酚钠。结晶方式为40℃浓缩结晶。真空干燥的温度为40℃，真空干燥的真空度为0.1MPa。

本实施例所制得的固体(即“麦考酚钠”)经理化检测，熔点符合相关文献规定189～191℃，熔点为189.9～190.5℃，经HPLC检测，通过本方法制得的麦考酚钠的纯度为99.83％。

实施例三：

该自麦考酚酸菌株制备麦考酚钠的方法包括以下步骤。

步骤(1)、取麦考酚酸产生菌孢子悬液，接种于培养基上，28℃下培养4天；该种子培养基中的各组分为(单位：g/L)黄豆饼粉15，乳糖60，玉米浆干粉40，硝酸铵3，磷酸二氢钾3，碳酸钙3，余量为水。

步骤(2)、种子培养基接种于发酵罐内并添加发酵培养基，28℃培养11天。发酵培养基中的各组分为(单位：g/L)：黄豆饼粉25，玉米淀粉15，葡萄糖65，果糖90，玉米浆干粉55，碳酸钙3，蛋氨酸4，磷酸二氢钾1.5，余量为水。发酵完毕后进行放罐以提取发酵液。

步骤(3)、向发酵液中添加酸使发酵液酸化至pH呈4.0，然后向发酵液中添加氢氧化钠溶液使发酵液的pH呈8.5。板框过滤，滤液再用酸调至pH呈2.5，过滤，得到麦考酚酸粗品；将麦考酚酸粗品溶于醇类溶剂后脱色，重结晶后得到麦考酚酸。本实施例中，所用的酸为质量浓度为10wt％的稀盐酸。

步骤(4)、得到的麦考酚酸与甲醇钠于甲醇中进行合成反应，以生成麦考酚钠，反应温度60℃，反应时间3小时。

步骤(5)、将步骤(4)所得的反应液浓缩，结晶，干燥，即得终品麦考酚钠。结晶方式为10℃冷却结晶。真空干燥的温度为50℃，真空干燥的真空度为0.5MPa。

本实施例所制得的固体(即“麦考酚钠”)经理化检测，熔点符合相关文献规定189～191℃，熔点为190.3～190.9℃，经HPLC检测，通过本方法制得的麦考酚钠的纯度为99.85％。

实施例四：

该自麦考酚酸菌株制备麦考酚钠的方法包括以下步骤。

步骤(1)、取麦考酚酸产生菌孢子悬液，接种于培养基上，26℃下培养3天。种子培养基中的各组分为(单位：g/L)：黄豆饼粉10，乳糖50，玉米浆干粉25，硝酸铵2，磷酸二氢钾2，碳酸钙2，余量为水。

步骤(2)、种子培养基接种于发酵罐并添加发酵培养基，26℃培养9天。发酵培养基中的各组分为(单位：g/L)：黄豆饼粉20，玉米淀粉10，葡萄糖50，果糖80，玉米浆50，碳酸钙1，蛋氨酸3，磷酸二氢钾0.5，余量为水。发酵完毕后进行放罐以提取发酵液。

步骤(3)、向发酵液中添加酸使发酵液酸化至pH呈3.0，然后向发酵液中添加氢氧化钠溶液使发酵液的pH呈9。板框过滤，滤液再用酸调至pH呈2.0，过滤，得到麦考酚酸粗品；将麦考酚酸粗品溶于醇类溶剂后脱色，重结晶后得到麦考酚酸。本实施例中，所用的酸为质量浓度为8wt％的稀盐酸。

步骤(4)、将麦考酚酸与甲醇钠在乙醇中进行合成反应，以生成麦考酚钠，反应温度40℃，反应时间3小时。

步骤(5)、将步骤(4)所得的反应液浓缩，结晶，干燥。结晶方式为60℃浓缩结晶。真空干燥的温度为50℃，真空干燥的真空度为0.2MPa。

本实施例所制得的固体(即“麦考酚钠”)经理化检测，熔点符合相关文献规定189～191℃，熔点为190.2～190.9℃，经HPLC检测，通过本方法制得的麦考酚钠的纯度为99.89％。

实施例五：

该自麦考酚酸菌株制备麦考酚钠的方法包括以下步骤。

步骤(1)、取麦考酚酸产生菌孢子悬液，接种于培养基上，26℃下培养3天。种子培养基中的各组分为(单位：g/L)：黄豆饼粉10，乳糖50，玉米浆干粉25，硝酸铵2，磷酸二氢钾2，碳酸钙2，余量为水。

步骤(2)、种子培养基接种于发酵罐并添加发酵培养基，26℃培养9天；发酵培养基中的各组分为(单位：g/L)：黄豆饼粉20，玉米淀粉10，葡萄糖50，果糖80，玉米浆干粉50，碳酸钙1，蛋氨酸3，磷酸二氢钾0.5，余量为水。发酵完毕后进行放罐以提取发酵液。

步骤(3)、向发酵液中添加酸使发酵液酸化至pH呈4.0，然后向发酵液中添加氢氧化钠溶液使发酵液的pH呈8.8。板框过滤，滤液再用酸调至pH呈2.2，过滤，得到麦考酚酸粗品；将麦考酚酸粗品溶于醇类溶剂后脱色，重结晶后得到麦考酚酸。本实施例中，所用的酸为质量浓度为5wt％的稀硫酸。

步骤(4)、将麦考酚酸与氢氧化钠在正丙醇中进行合成反应，以生成麦考酚钠。反应温度40℃，反应时间3小时。

步骤(5)、将步骤(4)所得的反应液浓缩，结晶，干燥，即得终品麦考酚钠。结晶方式为40℃浓缩结晶。真空干燥的温度为45℃，真空干燥的真空度为-0.15MPa。

本实施例所制得的固体(即“麦考酚钠”)经理化检测，熔点符合相关文献规定189～191℃，熔点为189.7～190.3℃，经HPLC检测，通过本方法制得的麦考酚钠的纯度为99.88％。

实施例六：

该自麦考酚酸菌株制备麦考酚钠的方法包括以下步骤。

步骤(1)、取麦考酚酸产生菌孢子悬液，接种于培养基上，28℃下培养4天；种子培养基组分(g/L)：黄豆饼粉15，乳糖60，玉米浆干粉40，硝酸铵3，磷酸二氢钾3，碳酸钙3。

步骤(2)、种子培养基接种于发酵罐并添加发酵培养基，28℃培养11天。发酵培养基中的各组分为(单位：g/L)：黄豆饼粉25，玉米淀粉15，葡萄糖65，果糖90，玉米浆干粉55，碳酸钙3，蛋氨酸4，磷酸二氢钾1.5，余量为水。发酵完毕后进行放罐以提取发酵液。

步骤(3)、向发酵液中添加酸使发酵液酸化至pH呈2.1，然后向发酵液中添加氢氧化钠溶液使发酵液的pH呈8.7。板框过滤，滤液再用酸调至pH呈2.6，过滤，得到麦考酚酸粗品；将麦考酚酸粗品溶于醇类溶剂后脱色，重结晶后得到麦考酚酸。本实施例中，所用的酸为质量浓度为5wt％的稀盐酸。

步骤(4)、将麦考酚酸与甲醇钠在正丁醇中进行合成反应，以生成麦考酚钠。反应温度60℃，反应时间3小时。

步骤(5)、将步骤(4)所的反应液浓缩，结晶，干燥。结晶方式为10℃冷却结晶。真空干燥的温度为42℃，真空干燥的真空度为0.32MPa。

本实施例所制得的固体(即“麦考酚钠”)经理化检测，熔点符合相关文献规定189～191℃，熔点为190.2～190.8℃，经HPLC检测，通过本方法制得的麦考酚钠的纯度为99.86％。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。