马齿苋中新生物碱化合物及其提取分离方法

摘要

本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋中提取、分离和鉴别出的新生物碱化合物及其提取分离方法。所述的新生物碱化合物，分子式依次为C

说明书

技术领域

本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋药材中提取、分离和鉴别出的新生物碱化合物及其提取分离方法。

背景技术

马齿苋(Portulaca oleracea L.)，又名长命菜、马苋菜，为马齿苋科植物。马齿苋耐旱耐涝，且耐光耐阴，分布广泛，资源丰富，作为药食两用的野生植物备受关注，2015版《中华人民共和国药典》中收载马齿苋的干燥地上部分入药，具有清热解毒、凉血止血、止痢等功效，用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血、崩漏下血等。

马齿苋现代药理学研究表明，其具有抗炎止痛、抗菌抗病毒、降血压、降血脂、抗氧化、抗癌、松弛骨骼肌和平滑肌、调节免疫功能等作用。研究表明马齿苋众多化学成分，为其多样的药理作用提供了物质基础，马齿苋主要化学成分包括黄酮类、香豆素、萜类、甾类、生物碱、氨基酸、各种色素类和矿物质类等。其中生物碱是马齿苋中一类主要的化学成分，目前已报道的生物碱类成分有去甲肾上腺素、多巴胺、少量多巴、腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤、N，N-二环己基脲、尿囊素、N-反式-阿魏酰基酪胺；还有环二肽生物碱和酰胺类生物碱：马齿苋酰胺A-I、K、L、N-S。

目前从马齿苋中分离出的化学成分大多数是已知的，且结构新颖性较低，因此，对马齿苋中新化合物的开发和分离是亟待需要的。

发明内容

针对上述问题，本发明提供从马齿苋中提取的两种新生物碱化合物，经研究发现本发明的新生物碱具有抗炎、抗肿瘤、神经保护的作用，同时提供一种针对本发明新生物碱化合物的简便、快速、环保、纯度高的提取分离方法。

为实现本发明的上述目的，本发明提供新生物碱化合物，分子通式分别为C₁₇H₂₆N₂O₃，C₁₇H₂₆N₂O₄，命名为oleraciamide>

为实现本发明的上述目的，本发明还提供一种马齿苋中新生物碱化合物的提取分离方法，具体步骤为。

步骤1、取马齿苋干燥药材，采用水煎煮提取，水提液滤过，合并滤液直接加热浓缩，放凉至室温，得药液备用；

步骤2、将步骤1中药液用乙酸乙酯反复萃取，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物；

步骤3、将步骤2中乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析分离，依次用石油醚-丙酮梯度洗脱得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，得到浓缩物备用；

步骤4、将步骤3中所得物再经预处理的ODS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料)层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将各显色的洗脱部位分别减压浓缩至干，得到浓缩物备用；

步骤5、将步骤4中所得各浓缩物经预处理的Sephadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶)层析分离，分别以甲醇-水梯度洗脱，得到来源于马齿苋的新生物碱化合物；

步骤6、将步骤5中所得新生物碱化合物通过高效液相色谱仪分离制备，以乙腈-水为流动相进行等度洗脱，最终得到本发明所述的新生物碱。

所述ODS和Sephadex LH-20凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。

与现有技术相比本发明的有益效果。

本发明中所述马齿苋新生物碱化合物的分离和药理活性研究未被现有论文期刊所报道；本发明提供来源于马齿苋的新生物碱化合物及一种针对本发明新化合物的提取分离方法，依次采用水煎煮提取、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、ODS中压柱、Sephadex LH-20及高效液相色谱仪进行分离纯化与制备，成功提取分离出两种新的生物碱化合物，该方法操作步骤仅为六步，操作方法简便及快速，提取分离过程主要采用水提取及乙酸乙酯萃取，工艺方法环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高均大于90％，此外经研究表明以上各化合物具有抗炎、抗肿瘤和神经保护作用，因此本发明两种新生物碱化合物及其盐和衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备抗炎、抗肿瘤和神经保护的药物。

附图说明

图1为本发明新生物碱化合物oleraciamide A和oleraciamide B的HPLC分离制备液相图。

图2为本发明新生物碱化合物oleraciamide A的HPLC纯度检测液相图。

图3为本发明新生物碱化合物oleraciamide B的HPLC纯度检测液相图。

图4为本发明新生物碱化合物oleraciamide A的紫外光谱图。

图5为本发明新生物碱化合物oleraciamide A的红外光谱图。

图6为本发明新生物碱化合物oleraciamide A的高分辨质谱图。

图7为本发明新生物碱化合物oleraciamide A ¹H-NMR光谱图。

图8为本发明新生物碱化合物oleraciamide A ¹³C-NMR光谱图。

图9为本发明新生物碱化合物oleraciamide A的核磁共振碳谱(DEPT)光谱图。

图10为本发明新生物碱化合物oleraciamide A的核磁共振¹H-¹HCOSY光谱图。

图11为本发明新生物碱化合物oleraciamide A的核磁共振HMBC光谱图。

图12为本发明新生物碱化合物oleraciamide A的核磁共振HSQC光谱图。

图13为本发明新生物碱化合物oleraciamide A的核磁共振NOESY光谱图。

图14为本发明新生物碱化合物oleraciamide B的紫外光谱图。

图15为本发明新生物碱化合物oleraciamide B的红外光谱图。

图16为本发明新生物碱化合物oleraciamide B的高分辨质谱图。

图17为本发明新生物碱化合物oleraciamide B ¹H-NMR光谱图。

图18为本发明新生物碱化合物oleraciamide B ¹³C-NMR光谱图。

图19为本发明新生物碱化合物oleraciamide B的核磁共振碳谱(DEPT)光谱图。

图20为本发明新生物碱化合物oleraciamide B的核磁共振¹H-¹HCOSY光谱图。

图21为本发明新生物碱化合物oleraciamide B的核磁共振HMBC光谱图。

图22为本发明新生物碱化合物oleraciamide B的核磁共振HSQC光谱图。

图23为本发明新生物碱化合物oleraciamide B的核磁共振NOESY光谱图。

具体实施方式

实施例1。

本发明提供两种新奇生物碱化合物，分子式为C₁₇H₂₆N₂O₃，C₁₇H₂₆N₂O₄，命名为oleraciamide>

所述两种新生物碱化合物根据结构命名为oleraciamide A和oleraciamide B，表1为该两种新奇生物碱化合物的核磁数据：¹H-NMR与¹³C-NMR在CDCl₃中。

表1：本发明新生物碱化合物oleraciamide A和oleraciamide B的核磁数据。

请参阅图4-13，本发明新生物碱化合物oleraciamide A的结构鉴定与推导。

Oleraciamide A：无色晶体，熔点74.5-75.5℃，易溶于氯仿和甲醇等，不溶、微溶于水。点样于硅胶薄层板后，喷稀碘化铋钾试液斑点显红棕色，提示该化合物为生物碱成分，UV(MeOH)λ_max:211，242，279nm，IRν_N-H3310，ν_C＝O1653，ν_C＝C1603，1528，1480，1430，ν_C-N1200，1040，ν_C-O1146，1118，778，687cm^-1。HRESI(+)TOFMS给出m/z:307.2038[M+H]⁺的准分子离子峰，分子量为306.2169。结合¹H-NMR，¹³C-NMR以及DEPT数据，推测该化合物可能的分子式为C₁₇H₂₆N₂O₃，不饱和度为6。¹³C-NMR谱和DEPT谱显示17个碳信号，分别为3个CH₃(δ：27.6，重叠)、6个CH₂(δ：66.9，重叠；65.8；57.6；54.1，重叠)、4个季碳(一个羰基碳，δ：176.6；一个连O的双键碳，δ：159.3；一个连N的双键碳，δ：139.3；一个脂肪碳，δ：39.7)。

¹H-NMR谱显示一个活泼H信号δ7.30(1H，bs)，表明可能存在一个氨基基团。3个重叠的甲基信号，为δ1.31(9H，s)，6个亚甲基信号(其中有两处重叠)，分别为δ3.73(4H，t，J＝4.50)，δ4.12(2H，t，J＝5.50)，δ2.80(2H，t，J＝5.50)，δ2.59(4H，t，J＝4.50)，四个次甲基信号分别为δ7.18(1H，t，J＝8.20)，δ6.89(1H，d，J＝8.20)，δ6.65(1H，dd，J＝8.20,2.05)，δ7.43(1H，s)。根据H-H>

HMBC谱相关峰表明H-3，4，5与C-1和C-2相关,说明有一个叔丁基与属于羰基的C-1相连。C-1'与H-2'，4'，5'和6'相关；C-2'与H-4'，5'和6'相关；C-3'与H-2'，4'，5'和6'相关；C-4'与H-2'，5'和6'相关；C-6'与H-2'，4'和5'相关，说明存在一个在C-1'和C-3'位有双取代的苯环，且C-1'和C-3'位于低场区，推测分别连有O或N原子。此外，还观察到活泼H(δH7.29)与C-1和C-2'相关，说明存在一个仲胺基团连接在羰基和苯环之间。鉴于¹H和¹³C-NMR都存在重叠的信号δC-3”'(5”')66.9和δC-2”'(6”')54.1；δH-3”'(5”')3.73和δH-2”'(6”')2.59，可确定本化合物包含一个对称的甘菊环结构。通过HMBC谱还观察到H-1”与C-2”和C-3'；H-2”与C-1”和C-2”'(C-6”')的相关峰，提示有一个-CH₂-CH₂-片段连接在取代苯环的O与属于甘菊环的N之间。根据以上信息，可确定此新生物碱为上述结构。

请参阅图14-23，本发明一种新生物碱化合物oleraciamide B的结构鉴定与推导。

Oleraciamide B：无色油状物，易溶于氯仿和甲醇等，不溶、微溶于水。如下所述的oleraciamide B的理化性质及常数以及光谱数据均表明oleraciamide B与oleraciamide A有着完全相似的部分结构，将oleraciamide B点样于硅胶薄层板进行稀碘化铋钾试液显色反应，结果呈阳性，斑点为橘红色，可断定该化合物为一种生物碱成分，UV(MeOH)λ_max:205，243，278nm，IRν_N-H3340，ν_C＝O1671，ν_C＝C1600，1535，1490，1434，ν_C-N1200，1040，ν_C-O1160，1138，1118，781，690cm^-1。HRESI(+)TOFMS给出m/z:323.1999[M+H]⁺的准分子离子峰，分子量为322.2164。结合¹H-NMR，¹³C-NMR以及DEPT数据，推测该化合物可能的分子式为C₁₇H₂₆N₂O₄，不饱和度为6，比oleraciamide>13C-NMR谱和DEPT谱显示17个碳信号，分别为3个CH₃(δ：27.6，重叠)、6个CH₂(δ：70.8；65.5，重叠；61.7，重叠；61.4)、4个季碳(一个羰基碳，δ：176.8；一个连O的双键碳，δ：158.2；一个连N的双键碳，δ：139.5；一个脂肪碳，δ：39.7)。

¹H-NMR谱显示一个活泼H信号δ7.40(1H，bs)，表明氨基的存在。3个重叠的甲基信号δ1.31(9H，s)，6个亚甲基信号，分别为δ3.65(2H，t，J＝3.90)，δ3.44(2H，dt，J＝11.50,3.30)，δ3.26(2H，d，J＝11.50)，δ4.42(2H，t，J＝11.50)，δ3.78(2H，d，J＝11.50)，四个次甲基δ7.21(1H，t，J＝8.15)，δ6.98(1H，d，J＝8.15)，δ6.65(1H，dd，J＝8.15,2.20)，δ7.44(1H，s)。由H-H>

HMBC谱相关峰进一步证明了Oleraciamide B与Oleraciamide A有着完全相似的部分结构，其中H-3，4，5与C-1和C-2；C-1'与H-2'，4'，5'和6'；C-2'与H-4'，5'和6'；C-3'与H-2'，4'，5'和6'；C-4'与H-2',5'和6'；C-6'与H-2'，4'和5'；活泼H(δH7.29)与C-1和C-2'，H-1”与C-2”和C-3'；H-2”与C-1”和C-2”'(C-6”')的相关峰均与Oleraciamide A完全吻合，说明除甘菊环外，Oleraciamide A的其他结构片段及连接方式均与Oleraciamide B完全相同。通过HMBC谱可观察到C-3”'与H-2”；C-4”'与H-3”'和6”'；C-6”'与H-4”'和H-7”'；C-7”'与H-6”'的相关峰，说明存在一个比甘菊环多一个O的七元环结构，由于H-2”只与C-3”'有HMBC相关，且与C-7”'无HMBC相关，故确定该多出的O连接在N和C-7”'之间。根据以上信息，可确定此新生物碱为上述结构。

本发明还提供上述新生物碱化合物的提取分离方法，具体步骤为。

步骤1：称取马齿苋干燥药材150kg，采用水煎煮提取，水用量为药材的8～16倍，煎煮提取两次，每次煎煮2h，水提液滤过，合并滤液直接加热浓缩，放凉至室温，得药液备用。

步骤2：将步骤1中所得药液，用乙酸乙酯反复萃取3次，乙酸乙酯与浓缩液的体积比例为1:1(v:v)，40℃以下减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物。

步骤3：将步骤2中所得乙酸乙酯萃取物干法上样，经硅胶柱层析分离，其中硅胶为200～300目，依次用石油醚-丙酮(1:1、1:2、1:3、1:5，v:v)梯度洗脱，共得到150个部位(即共得到150个瓶，每瓶400mL)，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的90～130洗脱部位(即合并显色的90～130瓶，弃去1～89瓶与131～150瓶)，将合并后的90～130部位经40℃以下减压浓缩至干，备用。

步骤4：将步骤3中所得物再经预处理的ODS中压柱层析分离，其中填料粒度为20～40μm，用甲醇-水(10/90，30/70，50/50，70/30，100/0，v/v)梯度洗脱(加压，使流速为1mL/min，温度为室温)，得到10个部位(即梯度洗脱得10个瓶，每瓶200mL)，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的部位分别合并，50℃以下减压浓缩至干，备用。所述ODS的预处理过程为甲醇浸泡过24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。

步骤5：将步骤4中所得各显色部位经预处理的Sephadex LH-20柱层析，分别以甲醇-水(70/30，v/v)等度洗脱，得到新生物碱化合物。所述Sephadex LH-20凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。

步骤6：将步骤5中所得新生物碱经HPLC分离制备，以乙腈：水(30％)作为流动相，检测波长为230，301nm，分离制备得到本发明两种新奇生物碱，归一法测定纯度均为90～99％(液相色谱图请参阅图1-3)。

本发明新生物碱化合物的抗炎作用。

1、主要材料。

1.1、药品和试剂：实验所用新生物碱化合物由上述方法制备，纯度为90～99％，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)；青霉素、链霉素(杭州四季青公司)；LPS(美国Sigma公司)；IL-6、TNF-α、PGE₂的ELISA试剂盒(美国Cayman公司)；细胞裂解液、Griess试剂(碧云天生物技术有限公司)。

1.2细胞株：RAW264.7巨噬细胞(美国ATCC细胞库)。

1.3分组：分为对照组、LPS组和实验组，各一组。

2实验方法。

2.1细胞培养，DMEM高糖培养基，加入l0％的胎牛血清，l％抗菌素(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，置于37.5％，CO₂培养箱中培养。

2.2MTT比色法测定细胞活力，上述三组分别取对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×104个/mL，每孔100μL，温度37℃，5％CO₂条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度的本发明两种新生物碱化合物oleraciamide>2条件下继续孵育4h后，终止培养，吸弃孔内液体，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，使细胞内结晶充分溶解，酶标仪570nm波长处测定各孔吸光值。

2.3利用格里斯(Griess)法测定NO的含量，考察本发明种两新生物碱化合物对LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7的NO产生量的抑制作用。小鼠巨噬细胞RAW264.7传代后在含10％胎牛血清的高糖细胞培养基DMEM中培养，实验组加入不同浓度的本发明两种新生物碱化合物oleraciamide A(1-20μM)或oleraciamide B(1-20μM)，在37℃，5％CO₂条件下孵育1h后用LPS(终浓度为1μg/mL)诱导炎症反应，24h后收集上清液，每组处理重复3孔。Griess法测定细胞上清液中NO的含量，根据不同浓度本发明两种新生物碱化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的影响，用以反映NO水平。

2.4ELISA法测定炎症因子IL-6、TNF-α和炎症介质PGE₂：将对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度为1×10⁵个/mL，每孔1mL，温度37℃，5％CO₂条件下培养过夜，实验组加入本发明两种新生物碱化合物oleraciamide>2的含量。

3实验结果。

实验结果表明本发明两种新奇生物碱化合物对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的增殖无影响，安全无毒；并可有效抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7所产生过量炎症细胞因子IL-6、TNF-α和炎症介质NO、PGE₂，且呈浓度依赖。

细胞相对存活率实验结果如表2所示。

表2：本发明对RAW264.7巨噬细胞相对存活率的影响。

注：^*P<0.05与对照组比较(高浓度组有显著性差异)。

利用格里斯(Griess)法测定NO的含量实验结果见表3。

表3：本发明对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的影响(均数±标准差，n＝3)。

注：^*P<0.05与对照组比较，^#P<0.05与LPS组比较。

ELISA法测定炎症因子IL-6、TNF-α和炎症介质PGE₂结果如表4所示。

表4：本发明对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌的IL-6、TNF-α和PGE₂含量的影响(均数±标准差，n＝3)。

注：^*P<0.05与对照组比较，^#P<0.05与LPS组比较。

本发明新生物碱化合物的抗肿瘤作用。

1主要材料。

1.1药品和试剂：实验所用新生物碱化合物由上述方法制备，纯度为90～99％，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)；青霉素、链霉素(杭州四季青公司)。

1.2细胞株：人结肠癌细胞Caco-2、人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞BGC-823、人肺腺癌细胞SPC-A1、人肝癌细胞BEL-7402、人宫颈癌细胞Hela-229、卵巢癌细胞Ho-8910、人类口腔表皮样癌细胞KB(以上细胞均来自中科院上海细胞库)。

1.3分组：分为对照组、实验组和调零组(含DMSO溶媒的培养液)。

2实验方法。

2.1细胞培养，DMEM高糖培养基，加入l0％的胎牛血清，l％抗菌素(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2.2MTI法检测细胞增殖，取对数生长期细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×10⁴个/mL，每孔100μL，温度37℃，5％CO₂条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度的本发明两种新生物碱化合物，每组设3个复孔，加药后置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。将含药培养液吸去，加入体积比为4：1的无血清培养液和MTT(终质量浓度为5mg/mL)共100mL，继续孵育4h，小心吸去上清液后，每孔加入DMSO>加药孔/A_对照孔)×100％，再应用SPSS软件处理数据，将抑制率对药物浓度作曲线，计算IC₅₀值。

3实验结果。

实验结果表明本发明两种新生物碱化合物对人结肠癌细胞Caco-2、人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞BGC-823、人肺腺癌细胞SPC-A1、人肝癌细胞BEL-7402、人宫颈癌细胞Hela-229、卵巢癌细胞Ho-8910、人类口腔表皮样癌细胞KB、的增殖具有抑制作用，且随药物浓度增大，抑制率也明显升高，即呈浓度依赖。本发明两种新化合物对上述八种肿瘤细胞IC₅₀值见表5。

表5 本发明两种新化合物对肿瘤细胞的抑制作用。

本发明新生物碱化合物的神经保护作用。

1主要材料。

1.1药品和试剂：实验所用新生物碱化合物由上述方法制备，纯度为90～99％，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)；青霉素、链霉素(杭州四季青公司)，磷酸盐缓冲液(PBS)，(武汉博士德有限公司)，ROS检测试剂盒(海门碧云天试剂公司)。

1.2细胞株：人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y、IMR-32)(中科院上海细胞。

1.3分组：分为对照组、H₂O₂损伤模型组和实验组。

2实验方法。

2.1细胞培养，DMEM高糖培养基，加入l0％的胎牛血清，l％抗菌素(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。

2.2MTT比色法测定细胞活力，上述三组分别取对数生长期SH-SY5Y细胞和IMR-32细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×10⁴个/mL，每孔100μL，温度37℃，5％CO2条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度的本发明两种新生物碱化合物oleraciamide>2O₂组和实验组分别加入终浓度为800μM/L的H₂O₂，另设调零组(含DMSO溶媒的培养液)，每组设3个复孔，考察加入药物后对细胞的影响。上述各组细胞培养24h后，在各孔细胞中加入5mg/mL>2条件下继续孵育4h后，终止培养，吸弃孔内液体，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，使细胞内结晶充分溶解，酶标仪450nm波长处测定各孔吸光值(A)值，计算细胞存活率，细胞存活率＝(AH₂O₂损伤－A空白)/(A对照－A空白)。

2.3DCFH-DA法检测SH-SY5Y细胞和IMR-32细胞内ROS，各组细胞给予相应物质后孵育24h，孵育结束前30min，各孔加入DCFH-DA，使终浓度为10μmol/L，于37℃继续孵育30min，收集细胞，PBS洗2次，细胞计数，将各组细胞制成相同浓度的细胞悬液。取100μL细胞悬液检测荧光强度，激发波长485nm，发射波长538nm。以对照组荧光强度为100％，其余各组与对照组荧光强度相比较，计算胞内ROS变化。

2.4INT显色反应法测定LDH的释放量，除上述对照组、H₂O₂损伤模型组和实验组外，另设立空白对照组(空白对照组不接种细胞)，各组细胞加入相应物质培养24h，取各孔上清120μL至新的96孔板中，加60μL配好的LDH检测工作液，避光室温孵育30min，在490nm处用多功能酶标仪测定A值，计算相对于对照管的LDH释放量百分率。LDH释放率＝(A给药－A空白)/(A对照－A空白)。

3实验结果。

细胞相对存活率实验结果如表6所示。

表6：对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y和IMR-32细胞相对存活率的影响。

注：^*P<0.05与H₂O₂损伤模型组比较。

SH-SY5Y细胞和IMR-32细胞内ROS量检测结果如表7所示。

表7 本发明对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y和IMR-32细胞内ROS量的影响。

注：^*P<0.05与对照组比较，^#P<0.05与H₂O₂损伤模型组比较。

SH-SY5Y细胞和IMR-32细胞内LDH释放的影响结果如表8所示。

表8 本发明对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y和IMR-32细胞内LDH释放的影响。

注：^*P<0.05与对照组比较，^#P<0.05与H₂O₂损伤模型组比较。

综上所述，本发明提供两种新奇生物碱化合物及其提取分离方法，依次采用水煎煮提取、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、ODS中压柱层析、及Sephadex LH-20柱层析，HPLC分离制备，成功的分离得到两种新生物碱化合物，该方法简便，快速，环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，由于所得两种化合物化学结构独特，从常用中药马齿苋中提取出来，其具有抗炎、抗肿瘤及神经保护作用，因此本发明两种新奇生物碱及其盐和衍生物可以作为天然产物开发中药新药，具有广阔的前景。