检测阿尔兹海默病相关代谢小分子的核磁共振模型及构建

摘要

本发明提供一种用于检测阿尔兹海默病相关代谢小分子标志物的核磁共振模型及其制备方法。本发明采用核磁共振波谱仪测定阿尔茨海默病患者和健康人血清样本的代谢小分子，并将传统统计学与现代生物信息学方法相结合进行数据处理，筛选出3种相应的阿尔茨海默病相关代谢小分子标志物，从而制备检测阿尔茨海默病相关代谢小分子标志物的核磁共振模型，为寻找新的更理想的阿尔茨海默病标志物提供了基础和资源。在体外对阿尔茨海默病进行的发现和检测，其准确率为97.5％、敏感度为95.0％。

说明书

技术领域

本发明涉及一种核磁共振模型及其构建方法，尤其是涉及一种检测阿尔兹海默病相关代谢小分子的核磁共振模型及构建。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是一种非常严重的神经退行性疾病^[1]。流行病学调查显示，阿尔茨海默病发病率与年龄呈正相关，其中，75～80岁的人群中，阿尔茨海默病的发病率约为2-3％，而85-90岁的人群中，阿尔茨海默病发病率升为12％。最新的研究表明：阿尔茨海默病是老年期痴呆的主要类型，占全部痴呆病例的60％～70％^[2-4]。在我国，超过60岁的人群中，阿尔茨海默病的发病率高达12.7％。阿尔茨海默病高发病率，给阿尔茨海默病患者家庭经济与精神带来沉重的负担。临床上，阿尔茨海默病以记忆障碍、失语、失用、视觉空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征^[5-6]。

长期以来，阿尔茨海默病的早期诊断存在着很多的困难，其主要原因是患者“无症状”期生物学标志物的变化与“有症状”期的临床表现之间存在着很大的异质性^[7,8]。目前阿尔茨海默病的临床诊断依然沿用1984年美国国立神经病学-语言障碍研究所和阿尔茨海默病及相关疾病学会发布的阿尔茨海默病临床诊断标准。由此可见，研究阿尔茨海默疾病的临床诊断指标，对早期诊断阿尔茨海默病，早期干预、治疗具有重要的临床价值^[9,10]。

核磁共振波谱法(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，缩写为NMR)，是对各种有机和无机物的成分、结构进行定性分析的工具。其原理主要是：在强磁场中，某些元素的原子核和电子能量本身所具有的磁性，被分裂成两个或两个以上量子化的能级。吸收适当频率的电磁辐射，可在所产生的磁诱导能级之间发生跃迁。在磁场中，这种带核磁性的分子或原子核吸收从低能态向高能态跃迁的两个能级差的能量，会产生共振谱，可用于测定分子中某些原子的数目、类型和相对位置。研究阿尔兹海默病相关代谢小分子是阿尔兹海默病临床诊断的突破口之一。如何筛选阿尔兹海默病相关代谢小分子，以及如何检测这些代谢小分子，是亟待解决的问题。迄今为止尚未见通过核磁共振波谱法构建的模型能够用于阿尔兹海默病相关代谢小分子的筛选和检测。

发明内容

本发明提供一种用于检测阿尔兹海默病相关代谢小分子的核磁共振模型，解决了阿尔兹海默病相关代谢小分子的筛选和检测的问题，从而为阿尔兹海默病临床诊断提供了突破口，以及为抗阿尔兹海默病药物的筛选提供了有力武器。

本发明提供一种检测阿尔兹海默病相关代谢小分子的核磁共振模型，包括所述阿尔茨海默病相关代谢小分子、所述阿尔茨海默病相关代谢小分子的核磁共振波谱检测条件和判断公式；所述阿尔茨海默病相关代谢小分子包括：次黄嘌呤、甲醇、乙醇；所述阿尔茨海默病相关代谢小分子的核磁共振波谱检测条件是使用CPMG序列采集小分子信息，谱宽为15～25ppm，等待时间为1～3s，90°脉宽为10～12μs，采样点数为28～34K，FID累加次数为60～68次，回波演化时间为300～400us，回波循环为90～110，总回波时间为60～80ms；

所述判断公式是Y＝Xi×Fi+C

其中，Y为是否具有阿尔茨海默病的判别指标，取值0或1，0表示未患病，1表示阿尔茨海默病患者；Xi为通过核磁共振波谱检查到的所述阿尔茨海默病相关代谢小分子的浓度；Fi为系数，Fi＝{0.064，0.469，0.025}，Fi对应的小分子分别为次黄嘌呤、乙醇和甲醇；C为常量-0.438。将数值带入后所述判断公式展开来即为Y＝X次黄嘌呤×0.064+X乙醇×0.469+X甲醇×0.025-0.438。

进一步地，所述阿尔茨海默病相关代谢小分子是次黄嘌呤、甲醇、乙醇；所述阿尔茨海默病相关代谢小分子的核磁共振波谱检测条件是使用CPMG序列采集小分子信息，谱宽为20ppm，等待时间为2s，90°脉宽为11.6μs，采样点数为32K，FID累加次数为64次,回波演化时间为350us，回波循环为100，总回波时间为70ms。

本发明还提供一种如上所述的检测阿尔兹海默病相关代谢小分子的核磁共振模型的构建方法，包括以下步骤：

步骤一：收集多例阿尔茨海默病患者血清和健康人的血清分别作为病例组和对照组血清样本，进行低温冷冻备用；

步骤二：对所述血清样本进行核磁共振波谱前预处理；

步骤三：对预处理过的两组血清样本进行核磁共振波谱检测，并收集数据；

步骤四：对于核磁共振波谱检测到的代谢小分子，使用百分比差异度进行评估，找出百分比差异度得分最大的代谢小分子；

步骤五：应用Mann-Whitney U test检验方法对核磁共振波谱检测到的代谢小分子进行差异性检验，选择假设检验P值小于0.05，FC值大于2，且与糖酵解代谢无关的差异代谢小分子，所述差异代谢小分子在病例组中表达量显著高于在对照组中的表达量，确定所述差异代谢小分子即所述阿尔茨海默病相关代谢小分子；

步骤六：使用多远线性逻辑回归的方法，对于每一个所述阿尔茨海默病相关代谢小分子，将其作为自变量Xi，将是否具有阿尔茨海默病作为因变量Y，构建所述判断公式，从而得到所述检测阿尔兹海默病相关代谢小分子的核磁共振模型。

进一步地，所述步骤一中病例组和对照组血清样本的获得是通过将从所述病例组和所述对照组取得的全血样本离心，去血细胞，保留血清，得到的。

进一步地，所述步骤一中低温冷冻前先将得到的所述血清样本以1倍到5倍体积的生理盐水稀释。

进一步地，所述步骤二中的预处理包括将所述血清样本与Na+/K+缓冲液混匀后离心取上清液，以备核磁共振波谱检测用。

本发明还涉及一种如上所述的检测阿尔兹海默病相关代谢小分子的核磁共振模型在筛选抗阿尔兹海默病药物中的应用。

以及一种如上所述的检测阿尔兹海默病相关代谢小分子的核磁共振模型在阿尔茨海默病诊断或监测中的应用。

本发明还提供一种上所述的检测阿尔兹海默病相关代谢小分子的核磁共振模型的准确性判断方法，即使用ROC曲线的方法验证阿尔茨海默病诊断的准确性，其方法是：

1)利用判断公式Y＝Xi×Fi+C对阿尔茨海默病患者和对照人群的测定结果来计算截断点，所述截断点为准确率达到最大时的测定值；

2)计算出所有所述截断点的敏感性、特异性和准确率；

3)以敏感性为纵坐标代表真阳性率，1-特异性为横坐标代表假阳性率，作图绘成ROC曲线，合并所述阿尔茨海默病相关代谢小分子对应的ROC曲线，得出阿尔茨海默病诊断的准确率、敏感度和特异度。

进一步地，所述测定结果包括测定值的上下限、组距。

有益效果

本发明与其它阿尔茨海默病的检测方法相比，具有以下优点：

1)本发明方法使用利用血清对阿尔茨海默病进行检查，利用血清检测，具有临床上的优势，主要是取样快速、创伤小。另外，国内外尚无阿尔茨海默病血液小分子标志物的报道，利用血清标志物可以实现对阿尔茨海默病的快速诊断，并实现对阿尔茨海默病的预警，这具有临床应用的意义。

2)相较于其他的筛查方法，本方法的成本较低，适于方法的大范围推广。

3)具有较高的敏感性和特异性。在体外对阿尔茨海默病进行的发现和检测，其准确率为97.5％、敏感度为95.0％。

4)可以对阿尔茨海默病进行早期的预警，具有重要的临床意义。

专业术语解释：

1)代谢小分子：是值在生命体中新陈代谢中存在的小分子，一般是指相对分子质量小于1000的小分子物质。

2)NMR：核磁共振波谱法(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)，将核磁共振现象应用于测定分子结构的一种谱学技术。

3)百分比差异度(percentage-difference value，PDV)：是一种评价某个特征分布于特定集合的度量值^[11]。对于二分类，如果某个特征的PDV大于0，表明更多阳性集的样本具有该特征，反之，则表明更多阴性集的样本具有该特征。

4)Mann-Whitney U test：该方法用于检验这两个总体的均值是否有显著的差别。

5)代谢组学：是指研究代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。

附图说明

图1是实施例一中3种差异代谢小分子的对比图。

图2是实施例一中ROC曲线。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步的描述。

实施例一

一、核磁共振模型及其制备方法

步骤一：样本选择

使用的样本来源于973课题(2010CB933900)中所收集的阿尔茨海默病患者血清样本。收集的血清样本必须满足如下条件：1)临床诊断为阿尔茨海默病的患者；2)排除有其他脑病的患者，如帕金森疾病等；3)排除具有其他代谢性疾病的阿尔茨海默病患者，主要包括糖尿病患者。

最终，收集了20例阿尔茨海默病患者血清及其20例健康人群血清作为研究样本。另外，所使用的20例阿尔茨海默病血清样本和20例健康人群血清样本中，阿尔茨海默病人年龄的平均值为73岁，健康人群年龄平时值为68岁。性别男女分布也分别为7:13和10:10。经过检验，年龄和性别在胃癌与健康人群中均无明显差别，因此，不会导致分析结果中偏差的出现。

步骤二：样本处理

全血样本使用3000rpm的离心机进行5分钟的离心，而后在-80℃的冰箱进行保存。使用前，进行不超过20min的室温解冻，并混合生理盐水，一般为200uL样本：400uL生理盐水(在10％D₂O/90％H₂O中含有0.9％NaCl)，12000×g离心5min，吸取550uL进行-80℃冷藏，而后进行分析。

对于每一个血清样本，抽取200uL作为检测对象，加入400uL Na+/K+缓冲液(45mM)(pH＝7.49，K₂HPO₄·3H₂O：0.830g；NaH₂PO₄·2H₂O：0.139g；D₂O：100ml；NaCl：0.9g)，涡旋震荡30s混匀后，离心(4℃，11180g，10min)得上清液。

步骤三：核磁共振波谱检测

取上述所得上清液550uL至5mm核磁管，混匀后进行核磁检测。其中，NMR的条件为：使用CPMG序列[RD-90°-(τ-180°-τ)n-ACQ]采集小分子信息。谱宽(SW)为20ppm，等待时间(RD)为2s，90°脉宽为11.6μs，采样点数为32K，FID累加次数为64次。回波演化时间(d20)为350us，回波循环(L4)为100，总回波时间(2nτ)为70ms。

共检测到26种代谢小分子，包括氨基酸、酸、醇、糖、胆碱等。具体为：

a)氨基酸：异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、甘氨酸、组氨酸和苯丙氨酸；

b)酸：3-羟基异丁酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、肌酸和甲酸；

c)醇：甲醇、乙醇和鲨肌醇；

d)肌酐：肌酸酐；

e)糖：alpha-D-葡萄糖和beta-D-葡萄糖；

f)其他：次黄嘌呤、丙酮、胆碱、蛋白糖基,。

步骤四：数据评估

对于NMR检测到的26种代谢小分子，使用百分比差异度(percentage-difference value，PDV)进行评估，并对26种代谢小分子进行差异性检验，检验的方法为Mann-Whitney U test，选择假设检验P值小于0.05，fold change(倍性变化，缩写为FC)大于2或小于0.5的差异代谢小分子，结果显示：

alpha-D-葡萄糖(P＝0.000，FC＝0.431)、beta-D-葡萄糖(P＝0.000，FC＝0.457)、乳酸(P＝0.000，FC＝2.387)、乙醇(P＝0.000，FC＝2.110)、甲醇(P＝0.000，FC＝2.338)和次黄嘌呤(P＝0.000，FC＝4.220)在阿尔茨海默病患者和对照组中存在明显差异；这些小分子都在病例组中表达量过高。选择在病例组中高表达的小分子，即FC值大于2的小分子，并且与糖酵解代谢无关的小分子，因此，得到次黄嘌呤、甲醇和乙醇三种小分子作为建模用的阿尔茨海默病相关代谢小分子。如图1所示，纵坐标为三种小分子在血清中的归一化浓度值，其中，小分子归一化浓度值＝小分子浓度测定值/(阴性样本中该小分子浓度均值)。

步骤五：使用多远线性逻辑回归的方法，对于每一个阿尔茨海默病相关代谢小分子，将其作为自变量Xi，将是否具有阿尔茨海默病作为因变量Y，构建判断公式，从而得到检测阿尔兹海默病相关代谢小分子的核磁共振模型。判断公式是Y＝Xi×Fi+C

其中，Y为是否具有阿尔茨海默病的判别指标，取值0或1，0表示未患病，1表示阿尔茨海默病患者；Xi为通过核磁共振波谱检查到的所述阿尔茨海默病相关代谢小分子的浓度；Fi为系数，Fi＝{0.064，0.469，0.025}，Fi对应的小分子分别为次黄嘌呤、乙醇和甲醇；C为常量-0.438。

二、检测阿尔兹海默病相关代谢小分子的核磁共振模型准确性判断

使用ROC曲线的方法验证阿尔茨海默病诊断的准确性，其方法是：

1)利用判断公式Y＝Xi×Fi+C对阿尔茨海默病患者和对照人群的测定结果，包括测定值的上下限、组距，来计算截断点。其中，截断点为准确率达到最大时的测定值。

2)计算出所有截断点的敏感性、特异性和准确率。敏感性＝真阳性/(真阳性+假阴性)；特异性＝真阴性/(真阴性+假阳性)；准确率＝(敏感性+特异性)/2。

3)以敏感性为纵坐标代表真阳性率，1-特异性为横坐标代表假阳性率，作图绘成ROC曲线，如图2所示。合并所述阿尔茨海默病相关代谢小分子对应的ROC曲线，得出阿尔茨海默病诊断的准确率、敏感度和特异度。

结果显示：采用检测阿尔兹海默病相关代谢小分子的核磁共振模型对上述20例阿尔茨海默病患者及20例健康人群进行判断，得到阿尔茨海默病诊断的准确率为97.5％，敏感度为95.0％、特异度为100.0％。

主要参考文献

1.Nie,H.W.,Y.Xu,B.Liu,et al.,The prevalence of mild cognitive impairment about elderly population in China:a meta-analysis.International Journal of Geriatric Psychiatry,2011.26(6):p.558-563.

2.Yu,S.,Y.P.Liu,Y.H.Liu,et al.,Diagnostic utility of VEGF and soluble CD40L levels in serum of Alzheimer's patients.Clin Chim Acta,2016.453:p.154-9.

3.Tarawneh,R.,G.D'Angelo,E.Macy,et al.,Visinin-like protein-1:diagnostic and prognostic biomarker in Alzheimer disease.Ann Neurol,2011.70(2):p.274-85.

4.Fleisher,A.S.,The value of biomarker comparisons between autosomal dominant and late-onset Alzheimer disease.JAMA Neurol,2014.71(9):p.1087-8.

5.Lin,X.,G.Bai,L.Lin,et al.,Vaccination induced changes in pro-inflammatory cytokine levels as an early putative biomarker for cognitive improvement in a transgenic mouse model for Alzheimer disease.Hum Vaccin Immunother,2014.10(7):p.2024-31.

6.Bush,A.I.and D.Strozyk,Serum copper:a biomarker for Alzheimer disease？Arch Neurol,2004.61(5):p.631-2.

7.Schjeide,B.M.,C.Schnack,J.C.Lambert,et al.,The role of clusterin,complement receptor 1,and phosphatidylinositol binding clathrin assembly protein in Alzheimer disease risk and cerebrospinal fluid biomarker levels.Arch Gen Psychiatry,2011.68(2):p.207-13.

8.Lo,R.Y.,W.J.Jagust,and I.Alzheimer's Disease Neuroimaging,Predicting missing biomarker data in a longitudinal study of Alzheimer disease.Neurology,2012.78(18):p.1376-82.

9.Florkowski,C.M.,Preanalytical variables and Alzheimer disease biomarker concentrations in cerebrospinal fluid.Clin Chem,2015.61(5):p.686-8.

10.Takeda,S.,N.Sato,H.Rakugi,et al.,Plasma beta-amyloid as potential biomarker of Alzheimer disease:possibility of diagnostic tool for Alzheimer disease.Mol Biosyst,2010.6(10):p.1760-6.

11.Cheng,S.L.,B.F.Lian,J.Liang,T.Shi,L.Xie,and Y.L.Zhao,Site selectivity for protein tyrosine nitration:insights from features of structure and topological network.Molecular Biosystems,2013.9(11):p.2860-2868.

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。