脑膜炎奈瑟菌血清组X的新的合成寡聚体及其制备方法

摘要

本发明涉及合成新的高级寡聚体及其制备方法。特别地，本发明涉及脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)血清组X(下文中为Men‑X)寡聚体(更特别地四聚体)的化学合成。本发明提供从使用具有特定链长的经纯化糖的合成途径中获得的Men‑X荚膜寡聚体，并且提供所述新的寡聚体，作为用于开发针对由于Men‑X感染引起的细菌性脑膜炎的缀合物疫苗的候选物。

说明书

技术领域

本发明涉及合成新的寡聚体及其制备方法。特别地，本发明涉及脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)血清组X(serogroup X)(下文中为Men-X)寡聚体(更特别地四聚体)的化学合成，及其作为用于开发针对由于Men-X感染引起的细菌性脑膜炎的缀合物疫苗的候选物的用途。

背景技术

细菌性脑膜炎引起约1,70,000的年死亡数，在工业化国家中有至少5％-10％病死率，且在发展中国家有20％病死率。肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)b型(Hib)和脑膜炎奈瑟菌引起全世界大多数的细菌性脑膜炎病例。

目前已确定了脑膜炎奈瑟菌的总共13个不同血清组(即A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y和Z)，但感染中约90％是由血清组A、B、C、Y和W135。然而，脑膜炎奈瑟菌的血清组X(Men-X)最近逐渐成为对公共健康的实质性威胁。血清组X被报道出现在北美、欧洲、澳大利亚及西非。

疫苗接种被认为是控制感染性疾病扩散的最有效方式。有覆盖脑膜炎球菌血清组A、C、Y及W的数种脑膜炎球菌疫苗，然而目前市场中没有可以防护由血清组X引起的脑膜炎的许可疫苗。所以，存在开发能够提供覆盖血清组X的更广泛保护的更全面疫苗的需求。

目前开发了缀合物疫苗以提供针对多糖抗原的更强保护，其通过将弱(多糖)抗原与载体蛋白质(优选来自于相同的微生物)共价连接产生，从而通过T-细胞依赖性免疫应答将所述载体的免疫属性赋予所连接的抗原。

寡糖或多糖合成的进步以及生物学研究中开发的新技术已经打开了糖类疫苗设计的新途径。近年来已制备多种有希望的基于糖类的疫苗候选物，其包括天然糖类和合成产生的糖类两者。

天然糖类证明为疫苗形成中的重要组分，但其具有许多缺点。与天然糖类相关的主要缺点是本身非常具有挑战性的分离与纯化。另外，任何生物污染物或残留的工艺杂质带来多种质量保证问题。另外，多糖质量不一致性和多糖大小分布问题导致批次不合格。细菌多糖在可用于缀合前需要进行修饰，导致对表位不同程度的损伤。

然而，基于合成糖类的疫苗相对于天然糖类具有许多优势，包括其限定良好的化学结构。任何生物污染的机会也更少，并且因此提供更好的安全谱。另外，合成分子在合成期间可按需要进行修饰以提高在缀合期间的产率，并通过与寡糖分子连接的内置接头(in-built linker)使在缀合过程期间对免疫原性表位的损伤最小化。

鉴于Men-X疾病不断提高的发病率，已经有数种方法用于制备合成可模拟天然多糖的合成Men-X寡糖。例如，国际专利申请no.PCT/US2011/037364(题目为“Synthetic oligosaccharide for Neisseriameningitidis vaccine”)公开了用于寡糖及其缀合物的化学合成的方法。该发明还提供了用于诊断、治疗和预防由脑膜炎奈瑟菌引起的感染的免疫原性和免疫保护性组合物及其抗体。另外，题目为“Synthesis of Neisseriameningitidis X capsular polysaccharide fragments”的发表文献(LauraMorelli和Luigi Lay；2013卷，第2期，ARKIVOC)公开了三种可缀合Men-X荚膜多糖片段(capsular polysaccharide fragment)的合成。

目前用于寡糖合成的现存系统涉及用于合成细菌Men-X多糖的繁琐的生产和纯化工序。这些方法或者消耗时间或者会产生不同大小寡聚体的混合物。虽然有关于连续性寡糖制备的概括性陈述，但并没有关于Men-X四聚体和进一步更高级Men-X寡聚体的制备的可实现的公开。以上公开的现有技术教导了Men-X二聚体和三聚体荚膜多糖的化学合成。它们未公开四聚体的形成并且不能产生高产率的二聚体和三聚体。

报道于Beilstein J.Org.Chem.2014，10，2367-2376的三聚体缀合物不能提供良好的免疫原性。另外，现有技术在合成起始步骤中使用-40℃用于O-叔己基二甲基氯硅烷(O-thexyldimethylsilyl chloride，OTDS)脱保护，并且α-磷酸化需要8-9天，然而本发明在0℃至室温进行并且在远远更短的时间内完成。另外，现有技术公开了氢化反应为24-48小时，然而本发明需要更短的用于氢化反应的时间。

发明目的

因此本发明的主要目的是新的Men-X荚膜寡聚体(优选Men-X四聚体)的合成。

本发明的另一目的是提供用于新的Men-X荚膜寡聚体(优选Men-X四聚体)合成的方法。

然而本发明的另一目的是提供利用具有特定链长的经纯化糖的合成途径。

然而本发明的另一目的是提供能够用于具有增强效力的针对脑膜炎奈瑟菌的缀合物疫苗的合成Men-X荚膜寡聚体。

然而本发明的另一目的是提供达到纯度物理化学质量标准的合成Men-X荚膜寡聚体制备方法。

然而本发明的另一目的是其成本效率、增强的效力和改善的保质期。

发明概述

因此，本发明涉及新的Men-X荚膜寡聚体的合成，以及通过组合用以构建Men-X寡糖主链的两种构建单元(building block)来合成所述Men-X荚膜寡聚体的方法。所述两种构建单元命名为延伸单元(propagation unit)和末端单元(termination unit)。将所述延伸单元添加至末端单元，所述末端单元在任一端终止该链。

用于合成延伸单元的原料为糖单糖，包括葡糖胺盐酸盐，其为丰富且廉价的原料。

在一个实施方案中，此合成的关键步骤为制备α或β端基异构体(anomer)，优选糖膦酸酯(sugar phosphonate)的α端基异构体。

全部合成顺序在多克级(multigram)规模上进行优化，以该方式其只在几个步骤内包括柱纯化。该糖苷化导致与接头部分连接的α-端基异构体和β-端基异构体的形成。该端基异构体混合物利用柱色谱脱保护并分离，导致产生具α或β接头立体化学的末端基团。所述经纯化形式通过¹H-NMR分析确认。

该二聚体通过利用偶联试剂(如新戊酰氯(pivaloyl chloride))并随后使用碘进行氧化使延伸单元与末端单元相组合进行制备。为了从二聚体制备四聚体，将二聚体的保护基团(例如乙酸酯基团)脱保护，并利用与产生二聚体相似的条件使其与延伸单元偶联。

该迭代的乙酸酯脱保护和偶联将提供四聚体单元。最终步骤包括(如果需要的话)叠氮基团向NHAc的一步转化，随后通过碱处理进行保护基(例如乙酸酯、苄基和Cbz)的移除，以及氢化将提供期望的Men-X高级寡聚体，包括四聚体、五聚体、六聚体等(包含接头)。

本发明导致在非常短的时间段内合成所述新的高级寡聚体。

本发明使将6C接头与寡聚体连接成为可能，其导致通过在缀合期间提供灵活性使空间位阻最小化。

此外，本发明中的6C接头与糖环直接连接，而不是在现有技术情况中通过磷酸酯连接。如此安置接头使其得以适当地优化，导致免疫原性以及缀合物疫苗产率提高，并会为该化合物赋予更好的稳定性。

所有使用新方法设计成用于Men-X荚膜多糖的合成的举例说明性步骤导致寡聚体更好的产率、增强的抗原性(如图1所示)以及超过95％的纯度(如图7和图10中所示)。

附图简述

图1描述了在使用细菌多糖、带有α接头(1)的合成Men-X四聚体和带有α(1-TT)接头的合成Men-X四聚体-TT缀合物的抑制性ELISA中抗Men-X抗体与细菌多糖结合的百分比抑制的图示。

图2描述了具有α-接头(1)的Men-X四聚体的¹HMR谱。

图3描述了1的¹³C>

图4描述了1的DEPT-NMR谱。

图5描述了1的2D COSY>

图6描述了1的2D HSQC>

图7描述了1的HPLC色谱图。

图8描述了具有β-接头(1A)的Men-X四聚体的¹HMR谱。

图9描述了α-接头(1A)的¹³C>

图10描述了1A的HPLC色谱图。

发明详述

因此，本发明涉及脑膜炎荚膜寡糖(更具体地Men-X寡糖)的化学合成，其用于针对脑膜炎奈瑟菌的缀合物疫苗的开发，脑膜炎奈瑟菌常被称为脑膜炎球菌(meningococcus)，其为细菌性脑膜炎及其他形式脑膜炎球菌疾病(例如脑膜炎球菌血症(meningococcemia))的病原体之一。所述合成按以下步骤完成：

1.如方案1所示，合成半缩醛(化合物10)。

2.如方案2所示，合成延伸单元(化合物12)和末端单元(化合物14)。

3.如方案3所示，合成高级寡聚体。

在描述本发明优选实施方案之前，应该理解，该发明不限于所描述的具体材料，因为其可以变化。也应该理解，本文中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，且不旨在以任何方式限制本发明的范围。

必须注意的是，除非上下文中另有明确说明，没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。

术语“化合物(compond)”及“化合物(compd)”已可互换地使用。

半缩醛单元的合成：

在本发明的一个实施方案中，方案1描述了半缩醛(10)的合成。用于合成Men-X荚膜寡糖的原料为糖，其选自葡糖胺HCl，更具体地但不限于D(±)葡糖胺HCl化合物(化合物2)。

方案1.半缩醛单元(化合物10)的合成

4-O-乙酰基-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α，β-D-吡喃葡萄糖

在吡啶存在下，使葡糖胺HCl经受重氮基转移试剂(例如但不限于咪唑-1-磺酰叠氮化物、Na₂CO₃、CuSO₄.5H₂O)以获得化合物3。用于将化合物2转化为化合物3的有机溶剂选自但不限于甲醇或乙醇，或其中任一种与水的组合。在0℃至室温，将如此获得的化合物3与供体基团(如对甲苯硫酚、三氟化硼乙醚(boron>3.OEt₂)和无水二氯甲烷(DCM))反应3天至4天，以获得化合物4。用于将化合物3转化为化合物4的有机溶剂选自二氯甲烷、乙腈或氯仿。在0℃至室温，在选自甲醇或乙醇或其在水中的混合物的组合的有机溶剂存在下，将如此获得的化合物4经受脱乙酰化试剂(例如甲醇钠)3小时至7小时(优选4小时)，得到化合物5。将如此获得的化合物5通过在有机溶剂(选自但不限于乙腈或二氯甲烷)存在或不存在下与苯甲醛二甲缩醛[PhCH(OMe)₂]、对甲苯磺酸(p-TSA)、乙腈在室温下反应过夜来进行亚苄基(benzylidene)保护。该反应导致形成化合物6，随后使其在有机溶剂(选自但不限于二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜)存在下经受与苄基溴和氢氧化钠在室温下2小时至4小时(优选3小时)的苄基保护。以上反应导致形成化合物7。随后使化合物7在有机溶剂(选自但不限于无水二氯甲烷(DCM)、氯仿、四氢呋喃)存在下，在与三乙基硅烷(Et₃SiH)和三氟化硼乙醚(BF₃.OEt₂)在0℃下反应2小时至4小时(优选3小时)的同时经受区域选择性开环，产生化合物8。使化合物8在溶剂(选自但不限于吡啶、二氯甲烷和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(cat.))存在下，在与乙酸酐(Ac₂O)在0℃下反应3.5小时至5小时(优选4.5小时)的同时进行乙酰化，产生化合物9。使如此获得的化合物9在等摩尔比例的选自但不限于丙酮：H₂O、二氯甲烷：H₂O中与N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)在0℃下反应1小时至3小时(优选2小时)的同时经受硫代甲苯基脱保护以形成化合物10。

所述化合物10作为合成延伸单元(12)以及两种末端单元(即14和14A)的共同中间体。

制备传播和末端单元的示意图在如下方案2中示出。

方案2：延伸单元(化合物12)和末端单元(化合物14和化合物14A)的合成。

从方案1如此得到的化合物10经受亚磷酰化剂(phosphitylationagent)(不限于亚磷酸二苯酯吡啶)以及随后三乙胺(Et₃N-TEA)与H₂O的等摩尔混合物(1∶1)在室温下(85％)2小时(优选1小时)，用于取代末端氢以得到化合物11，其为包含α和β二者混合物的单体组件(monomeric>3PO₄)和乙腈在室温下反应4天，用于选择性且完全地接收化合物11的α端基异构体作为化合物12。如此得到的化合物12作为Men-X四聚体合成中的延伸单元。

化合物9在-5℃下在四氢呋喃中在N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)和三氟甲磺酸存在下用接头6-(Z-氨基)-1-己醇处理1小时，得到化合物13。所述化合物13通过在室温至50℃下与NaOMe、MeOH反应经受脱乙酰化，在连续的三个步骤中获得末端单元。如此获得的末端单元通过硅胶柱色谱进行分离，导致获得具有产生自α位的6C接头的化合物14(R¹＝-(CH₂)₆NHCbz，R²＝H)和具有产生自β位的6C接头的化合物14A(R¹＝H，R²＝-(CH₂)₆NHCbz)。

如此获得的化合物14和14A作为寡聚体合成的末端单元。

寡聚体合成：

一旦制备了延伸单元和末端单元，后续的寡聚体可于此后通过如下所述方法和如方案3所示制备。

通过使延伸单元12与末端单元14反应以生成化合物15(具有R¹＝-(CH₂)₆NHCbz，R²＝H，R³＝Ac的α端基异构体)来制备二聚体。相似地，通过使延伸单元12与末端单元14A反应以产生二聚体化合物15A(具有R¹＝H，R²＝-(CH₂)₆NHCbz，R³＝Ac的β端基异构体)。上述制备二聚体的反应如下进行：在偶联试剂(其不限于新戊酰氯偶联试剂)存在下，在吡啶中在室温下进行30分钟，随后在-40℃下利用碘进行氧化，在吡啶∶H₂O(9.72∶0.25)中，反应1.5小时(86％)，产生具有良好产率的二聚体化合物15和化合物15A(69％)。

方案3.高级寡聚体(二聚体、三聚体和四聚体)的合成

如此获得的化合物15和化合物15A通过与碱(例如甲醇钠)于甲醇中在0℃至55℃下反应1.5小时来脱乙酰化以分别获得化合物16(定量的)(具有R¹＝-(CH₂)₆NHCbz，R²＝H，R³＝H的α端基异构体)和化合物16A(78％)(具有R¹＝H，R²＝-(CH₂)₆NHCbz，R³＝H的β端基异构体)。

此后，如此获得的二聚体化合物(化合物16和化合物16A)利用相似的偶联试剂和条件再次与延伸单元12偶联以分别产生具有高产率的三聚体化合物17(具有R¹＝-(CH₂)₆NHCbz，R²＝H，R³＝Ac的α端基异构体)和化合物17A(具有R¹＝H，R²＝-(CH₂)₆NHCbz，R³＝Ac的β端基异构体)。

使所得的化合物17和化合物17A独立地经受脱酰化试剂，分别产生化合物18(具有R¹＝-(CH₂)₆NHCbz，R²＝H，R³＝H的α端基异构体)和化合物18A(具有R¹＝H，R²＝-(CH₂)₆NHCbz，R³＝H的β端基异构体)。

使如此获得的所得化合物18和18A经受迭代反应条件以获得高级合成寡聚体(X和XA)，其包括四聚体(1和1A)、五聚体、六聚体等，更优选化合物19(具有R¹＝-(CH₂)₆NHCbz，R²＝H的α端基异构体)和化合物19A(具有R¹＝H，R²＝-(CH₂)₆NHCbz的β端基异构体)的四聚体。

使如此获得的化合物19和19A经受：用(a)硫代乙酸和吡啶在室温下处理，导致叠氮基团转换为NHAc，随后(b)乙酸酯基团脱保护，以及(c)通过氢化进行苄基和Cbz脱保护，这产生包括四聚体(1和1A)、五聚体、六聚体等的高级合成寡聚体(X和XA)。Men-X寡聚体的这两种端基差向异构体均可通过按照上述方案推断出。

如此获得的四聚体(1)和(1A)在短时间段内迅速合成。合成所述四聚体(1)和(1A)所用时间为225小时至276小时，优选257小时。

如此获得的端基异构体寡聚物(即Men-X四聚体1和Men-X四聚体1A)中的任一种或二者均用作用于开发针对由于Men-X感染引起的细菌性脑膜炎的缀合物疫苗的潜在候选物。

Men-X四聚体1

Men-X四聚体1A

上述的方法详述通过非限制性实施例举例说明：

实施例：

实施例1：化合物3的合成：

1，3，4，6-四-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖(3)：

向搅拌中的在甲醇中的葡糖胺溶液(20gm，93mmol)添加1H-咪唑-1-磺酰叠氮化物(19.3gm，110mmol)，随后添加无水碳酸钠(19.7gm，186mmol)。使反应混合物在氮气氛下在室温(rt)下搅拌15min。向反应混合物添加CuSO₄.5H₂O(97mg，9.3mmol)并在室温下搅拌3h。在反应完成后(通过TLC监测)，反应混合物通过布氏漏斗过滤。以10％甲醇：乙酸乙酯(200mL)洗涤固体残留物。该粗制反应物料2-叠氮基-2-脱氧-D-葡萄糖(20g)原样用于下一步骤。

向搅拌中的在吡啶(120mL)中的2-叠氮基-2-脱氧-D-葡萄糖(20gm，97mmol)逐滴添加乙酸酐(80mL，776mmol)。使反应混合物在0℃搅拌1h，并在室温下搅拌2h。反应完成后(通过TLC监测)，将该反应混合物在减压下浓缩(以去除过量的吡啶)。将固体残留物以H₂O(200mL)稀释并以30％乙酸乙酯∶石油醚(pet>

实施例2：化合物4的合成：

4-甲基苯基3，4，6-三-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-1-硫代-α，β-D-吡喃葡糖苷(4)：

在氮气氛下在0℃下向搅拌中的在DCM(1.2升)中的1，3，4，6-四-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖(3)(120gm，321mmol)添加对甲苯硫酚(79.8gm，643mmol)。搅拌反应混合物5min，随后在氮气氛下经过30min逐滴添加BF₃.OEt₂(119mL，965mmol)。使反应在室温下搅拌72h。在耗尽最大量原料后(通过TLC监测)，将反应混合物冷却至0℃并以NaHCO₃(1L)稀释至pH中性。通过无水硫酸钠将抽提的有机层干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗制残余物通过快速凝胶柱色谱纯化，使用2％乙酸乙酯：石油醚用作洗脱剂以得到黄色糖浆状化合物(syrupcompound)4，80gm，60％产率。

实施例3：化合物5的合成：

4-甲基苯基2-叠氮基-2-脱氧-1-硫代-α，β-D-吡喃葡糖苷(5)：

在氮气氛下在0℃下，向搅拌中的MeOH(1升)中的过乙酰化硫代糖苷4(82gm，187mmol)溶液经30min逐份添加NaOMe(40.4gm，437mmol)。使反应混合物在室温下再搅拌3h。反应完成后(通过TLC监测)，向反应混合物中添加乙酸，直至反应混合物的pH变为中性。用乙酸乙酯(800mL)将该反应混合物抽提两次。通过无水硫酸钠将分离的有机层干燥，过滤并在减压下浓缩。110g粗制产物直接用于下一步骤。

实施例4：化合物6的合成：

4-甲基苯基2-叠氮基-4，6-O-亚苄基-2-脱氧-1-硫代-α，β-D-吡喃葡糖苷(6)：

向搅拌中的乙腈(1L)中的三醇硫代糖苷5(110gm，353mmol)溶液添加苯甲醛二甲缩醛(106mL，707mmol)，随后一次性添加PTSA(6.6gm，35.3mmol)。使反应混合物在室温下搅拌过夜。反应完成后(通过TLC监测)，以水(1L)将反应混合物稀释并以乙酸乙酯(1L)抽提两次。通过无水硫酸钠将合并的有机层干燥，过滤并在减压下浓缩。以DCM(500mL)将粗制物料稀释，随后添加石油醚(2L)导致产物沉淀(类白色固体)。通过布氏漏斗过滤沉淀，收集浅黄白色(buff white)残留物并干燥。分离到100gm 71％的纯产物6。

实施例5：化合物7的合成：

4-甲基苯基2-叠氮基-4，6-O-亚苄基-3-O-苄基-2-脱氧-1-硫代-α，β-D-吡喃葡糖苷(7)：

在氮气氛下在室温下，向搅拌中的DMF(300mL)中的亚苄基醇6(90gm，225mmol)溶液添加NaOH(22gm，563mmol)，随后添加催化量的TBAI(4.1gm，11.25mmol)。使反应混合物在室温下搅拌15min。随后经30min逐滴添加苄基溴(52.2mL，450mmol)。使反应混合物在室温下再搅拌3h。反应完成后(通过TLC监测)，以冰冷的水(900mL)将反应混合物稀释，其导致形成固体沉淀。通过Whatman滤纸将该固体物料滤出。以水(500mL)洗涤该固体物料，随后以石油醚(450mL)洗涤两次，在真空下干燥残留物。以91％的产率作为纯产物7获得的100g浅黄白色固体。

实施例6：化合物8的合成：

4-甲基苯基2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-1-硫代-α，β-D-吡喃葡糖苷(8)：

在氮气氛下在0℃下，向搅拌中的DCM(600mL)中的化合物7(30gm，61.27mmol)溶液添加三乙基硅烷(117mL，735mmol)。使反应混合物在0℃下搅拌15min，随后逐滴添加BF₃.OEt₂(11.6mL，91.9mmol)，并使其在相同温度下搅拌3h。反应完成后，在0℃下，该反应混合物以饱和碳酸氢钠溶液(300mL)稀释，并且通过抽提分离有机层。以DCM(300mL)将水层再抽提一次并分离。通过无水硫酸钠将所收集的有机层干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗制残余物通过快速硅凝胶柱色谱纯化，使用石油醚∶乙酸乙酯(7∶3)作为洗脱剂以得到28g白色固体化合物8，产率95％。

实施例7：化合物9的合成：

4-甲基苯基4-O-乙酰基-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-1-硫代-α，β-D-吡喃葡糖苷(9)：

在氮气氛下在0℃下，向搅拌中的吡啶(1L)中的二苄醇8(90gm，183mmol)溶液添加乙酸酐(34.5mL，366mmol)，随后添加DMAP(cat.)。使反应混合物在室温下再搅拌3h。反应完成后(通过TLC监测)，将该反应混合物在减压下浓缩(以去除过量的吡啶)。将残留物以水(900mL)稀释并以乙酸乙酯(900mL)抽提两次。通过无水硫酸钠将合并的有机层干燥，过滤并浓缩。未经纯化，获得85g(98％产率)的纯产物9。

实施例8：化合物10的合成：

4-O-乙酰基-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α，β-D-吡喃葡萄糖(10)：

在0℃下，向搅拌中的丙酮∶水(7∶1)(240mL)中的化合物9(10gm，18.7mmol)溶液逐份添加NBS(13.3mL，74.9mmol)。使反应混合物在相同温度下搅拌30min至1h。反应完成后(通过TLC监测)，将该反应混合物以饱和硫代硫酸钠(20mL)淬灭反应，并在减压下浓缩。以DCM(300mL)抽提反应物料3次。通过无水硫酸钠将合并的有机层干燥、过滤并浓缩。粗制物料利用石油醚中的10％乙酸乙酯通过二氧化硅纯化以获得作为淡黄白色固体的羟基化合物7g，85％产率。

实施例9：化合物12的合成：

4-O-乙酰基-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基氢膦酸酯(12)：

将半缩醛化合物10(4.5g，10.5mmol)溶解于吡啶(45mL)中，并以亚磷酸二苯酯(14.1mL，73.7mmol)缓慢处理。使所得反应混合物在室温下搅拌2h。将该反应混合物在0℃下以Et₃N∶H₂O(1∶1，40mL)稀释，并使其再搅拌30min。将该反应混合物在减压下浓缩，且然后将其利用甲苯共蒸发(coevaporate)两次。将残留物以饱和Na₂CO₃(50mL)稀释，并利用DCM(60＊2)抽提。将有机层过滤、通过无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。将残余物通过快速凝胶柱色谱纯化，使用MeOH∶DCM+1％TEA(05∶95)作为洗脱剂以得到暗淡黄色糖浆状膦酸酯(4g，81％)。上述获得的膦酸酯端基异构体混合物产物(4g，6.6mmol)和催化量的膦酸在室温下、在无水乙腈中搅拌4天。通过在0℃下添加三乙胺(2.5mL)淬灭反应，在真空下浓缩并以饱和Na₂CO₃(100mL)稀释，且在DCM中抽提(100mL＊2)。将有机层干燥(Na₂SO₄)并在减压下浓缩以产生粗制产物，其利用MeOH-DCM+1％Et₃N(3∶97)作为洗脱剂在快速二氧化硅上纯化以获得作为棕色浓稠糖浆状物的纯化合物12(2g，50％)。

实施例10：化合物14和14A的合成：

6-(苄氧羰基)氨基己基2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷(14)和6-(苄氧羰基)氨基己基2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷(14A)：

4-甲基苯基-4-O-乙酰基-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-1-硫代-α，β-D-吡喃葡糖苷(9)(6.8g，12.7mmol)、NIS(5.72gm，25.4mmol)和N-(6-羟基己基)氨基甲酸苄酯(3.8gm，15.2mmol)溶解于THF(80mL)中，搅拌并在-5℃下在惰性气氛中冷却。向上述混合物经5min逐滴添加三氟甲磺酸(0.05mL)，并将该反应混合物在相同温度下搅拌1h。完成后，将反应混合物以Na₂S₂O₃和NaHCO₃的饱和溶液(各200mL)稀释。将反应混合物以乙酸乙酯(100mL)抽提三次。通过无水硫酸钠将合并的有机层干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗制反应物料进一步用于脱乙酰化。将粗制反应物料溶解于甲醇(70mL)中并在室温下经10min逐份添加NaOMe(2.2gm)。在50℃下将反应混合物加热1h。完成后，将反应混合物冷却至室温并以Amberlite>

实施例11：化合物15和15A的合成：

6-(苄氧羰基)氨基己基(4-O-乙酰基-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷，三乙铵盐(15)

和

6-(苄氧羰基)氨基己基(4-O-乙酰基-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，三乙铵盐(15A)

α-H-膦酸酯12(2.87gm，4.84mmol)和醇14(1.5gm，2.42mmol)的混合物与无水吡啶在真空中共蒸发三次。将该混合物溶解于无水吡啶(50mL)中并在氮气氛下在室温下逐滴添加新戊酰氯(0.9mL，10mmol)并继续搅拌1/2小时。将反应混合物冷却至-40℃，经过15min添加吡啶∶H₂O(8mL；9.75∶0.25)中的I₂(1.2gm，4.85mmol)溶液并搅拌1h。利用Na₂S₂O₃.5H₂O水溶液(200mL，1M)淬灭反应混合物。将反应混合物以H₂O(200mL)稀释并利用DCM(300mL＊2)抽提。通过无水硫酸钠将分离的有机层干燥，过滤并在减压下浓缩。粗制产物利用MeOH-DCM+1％Et₃N(4∶96)作为洗脱剂在快速二氧化硅上纯化以获得作为浓稠液体的纯化合物15(2.5g，86％)。相似地，α-H-膦酸酯12与14A在相同条件下反应以69％的产率获得15A。

实施例12：化合物16和16A的合成：

6-(苄氧羰基)氨基己基(2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷，三乙铵盐(16)

和

6-(苄氧羰基)氨基己基(2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，三乙铵盐(16A)

将含有0.25M CH₃ONa的甲醇(25mL)中的二聚体化合物15(2.5g，2.04mmol)溶液在55℃下搅拌1.5h。将反应混合物冷却至室温并以Amberlite>+)树脂中和，通过Whatman滤纸过滤并浓缩。粗制产物利用MeOH-DCM+1％Et₃N(4∶96)作为洗脱剂在快速二氧化硅上纯化以获得棕色糖浆状物的纯化合物16(2.4g，定量)。相似地，使化合物15A与甲醇钠在相同条件下反应以78％的产率获得16A。

实施例13：化合物17和17A的合成：

6-(苄氧羰基)氨基己基(4-O-乙酰基-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷，双-三乙基铵盐(17)

和

6-(苄氧羰基)氨基己基(4-O-乙酰基-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷，双-三乙基铵盐(17A)

α-H-膦酸酯12(2.55gm，4.29mmol)与醇14(1.7gm，1.43mmol)的混合物与无水吡啶在真空中共蒸发三次。将残留物溶解于无水吡啶(40mL)并在室温下经10min逐滴添加新戊酰氯(1.07mL，8.58mmol)并搅拌30min。将反应混合物冷却至-40℃，经过15min添加溶于吡啶∶水(9.75∶0.25，10mL)中的I₂(2.1gm，8.58mmol，6eq.)溶液。冷却停止并使反应混合物再搅拌1h。通过添加饱和的Na₂S₂O₃.5H₂O溶液(50mL)淬灭反应。将反应混合物冷却至室温，稀释于水(100mL)并利用DCM(400mL)抽提两次。通过无水硫酸钠将分离的有机层干燥，过滤并在减压下浓缩。残留物使用MeOH-DCM+1％Et₃N(5∶96)作为洗脱剂通过快速硅胶柱色谱纯化，产出作为黄色糖浆状物的化合物17(1.5g，60％)。相似地，通过α-H-膦酸酯12与16A在相同条件下反应以88％的产率制备17A。

实施例14：化合物18和18A的合成：

6-(苄氧羰基)氨基己基(2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷，双-三乙基铵盐(18)

和

6-(苄氧羰基)氨基己基(2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷，双-三乙基铵盐(18A)：

将甲醇(20mL)中的0.25M CH₃ONa的三聚体化合物17(1.5g，0.85mmol)在55-60℃下搅拌2h。将反应混合物在室温下冷却，以甲醇(20mL)稀释，并以Amberlite>+)树脂中和，通过Whatman滤纸过滤并浓缩。粗制产物使用MeOH-DCM+1％Et₃N(5∶96)作为洗脱剂在快速二氧化硅上纯化以产生作为黄色浓稠糖浆状物的纯化合物18(1.3gm，89％)。相似地，通过与甲醇钠在相同条件下反应以69％的产率制备化合物18A。

实施例15：化合物19和19A的合成：

6-(苄氧羰基)氨基己基(4-O-乙酰基-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸酯)-(1→4)-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷，三-三乙基铵盐(19)

和

6-(苄氧羰基)氨基己基(4-O-乙酰基-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸酯)-(1→4)-2-叠氮基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷，三-三乙基铵盐(19A)

三聚体羟基化合物18(1.3gm，0.75mmol)与α-H-膦酸酯12(1.3gm，2.25mmol)的混合物与无水吡啶在真空中共蒸发三次。将混合物溶解于无水吡啶(30mL)并在惰性气氛中的室温下经10min逐滴添加新戊酰氯(0.65mL，5.25mmol)。将反应混合物搅拌30min。将反应混合物冷却至-40℃，经过15min添加吡啶：水(9.75∶0.25，3mL)中的I₂(1.3gm，5.25mmol)溶液。停止冷却并使反应混合物再搅拌1h。通过添加饱和Na₂S₂O₃.5H₂O溶液(50mL)淬灭反应。将反应混合物冷却至室温，用水稀释(100mL)并通过DCM(200mL)抽提两次。通过无水硫酸钠将分离的有机层干燥，过滤并在减压下浓缩。残留物使用MeOH-DCM+1％Et₃N(5∶96)作为洗脱剂通过快速硅胶柱色谱纯化，以产出作为黄色半固体的化合物19(0.9g，53％)。相似地，通过与α-H-膦酸酯12在相同条件下反应以80％的产率制备19A。

实施例16：化合物Men-X四聚体1和1A的合成：

6-(苄氧羰基)氨基己基(4-O-乙酰基-2-乙酰氨基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-乙酰氨基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-乙酰氨基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖磷酸酯)-(1→4)-2-乙酰氨基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷，三-三乙基铵盐(1)

和

6-(苄氧羰基)氨基己基(4-O-乙酰基-2-乙酰氨基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-乙酰氨基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-乙酰氨基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖磷酸酯)-(1→4)-2-乙酰氨基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷，三-三乙基铵盐(1A)

在惰性气氛下在室温下，向搅拌中的无水吡啶(10mL)中的四聚体叠氮化合物19(0.9g，0.4mmol)溶液中，经10min逐滴添加硫代乙酸(3.2mL，过量)。使反应混合物在相同气温下搅拌过夜。反应完成后(通过TLC监测)，以冰水(30mL)、随后以饱和碳酸氢钠溶液(20mL)稀释反应混合物。将反应混合物通过(70mL)DCM抽提两次。通过无水硫酸钠将分离的有机层干燥，过滤并在减压下浓缩。残留物通过最小体积的DCM(4mL)稀释，随后添加石油醚(40mL)，这导致产物固体沉淀。倒出有机层，将残留物使用5％-10％MeOH：DCM+1％TEA作为洗脱剂通过柱色谱纯化以得到作为棕色半固体的N-乙酰基四聚体化合物。分离产率：600mg，45％。相似地，在吡啶中使化合物19A与硫代乙酸在相同条件下反应以40％的产率获得用NHAC替代N₃的化合物。

6-(苄氧羰基)氨基己基(2-乙酰氨基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-乙酰氨基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-乙酰氨基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-2-乙酰氨基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷，三-三乙基铵盐6-(苄氧羰基)氨基己基(2-乙酰氨基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-乙酰氨基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-乙酰氨基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-2-乙酰氨基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷，三-三乙基铵盐：

在氮气氛下，向搅拌中的无水甲醇(20mL)中的来自上一步骤的N-乙酰基四聚体(600mg，0.253mmol)溶液中，经5min逐份添加NaOMe(600mg，过量)。将反应混合物加热至60℃，保持1.5h。将反应混合物冷却至室温并使用Amberlite IR-120树脂中和。将反应混合物通过Whatman滤纸过滤并将残留物用甲醇(50mL)洗涤2-3次。将所收集的滤液在减压下浓缩。将粗制反应物料使用10％MeOH：DCM+1％TEA作为洗脱剂通过快速凝胶柱纯化以产出四聚体羟基化合物(500mg，84％)。在相似条件下具有β接头的四聚体以76％的产率脱乙酰化。

6-氨基己基(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷，三钠盐(Men X四聚体1)和6-氨基己基(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷，三钠盐(Men X四聚体1A)：

在惰性气氛下在室温下，向甲醇∶水，1∶1(30mL)中的来自上一步骤中制备的四聚体羟基(300mg，0.128mmol)溶液中，添加Pd(OH)₂/C(20mol％，600mg)。将反应混合物在氢气氛下以104psi搅拌15h。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物通过硅藻土柱床(celite>2O洗涤三次。将分离的滤液在减压下浓缩。将粗制物料通过溶剂处理纯化。将残留物通过DCM洗涤，随后通过冷甲醇洗涤(5mL＊2)次。获得白色固体化合物。分离产率：120mg，86％，HPSEC纯度：98％。准确质量：1235.84。观测质量(M-Na)-1212.34。

IR：3436，2517，1632，1383，1443，1204.

¹H>2O)δ5.55-5.44(m，3H)，4.10-3.96(m，4H)，3.96-3.83(m，11H)，3.82-3.56(m，12H)，3.50(t，J＝9.8Hz，1H)，3.45-3.42(m，1H)，2.93(s，2H)，2.10-1.92(m，12H)，1.69-1.48(m，4H)，1.43-1.27(m，4H).

¹³C>2O)6174.5，174.4，174.2，171.0，96.4，94.4，94.3，94.1，94.0，74.4，74.3，73.8，73.7，73.0，72.0，71.2，70.8，70.7，70.1，69.9，69.4，68.0，60.3，60.2，60.0，53.7，53.6，53.5，53.4，39.4，28.2，26.7，25.3，24.8，22.1，22.0，21.8.

6-氨基己基(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖基磷酸酯)-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷，三钠盐(Men X四聚体1)：

在惰性气氛下在室温下，向甲醇∶水7∶3(30mL)中的的四聚体羟基化合物(100mg，0.042mmol)溶液中，添加Pd(OH)₂/C(20mol％)。将反应混合物在氢气氛下以60psi搅拌6h。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物通过硅藻土柱床过滤。将该硅藻土柱床以30mL的H₂O洗涤三次。将分离的滤液在减压下浓缩。将粗制物料通过溶剂处理纯化。将残留物通过DCM洗涤，随后通过冷甲醇洗涤(5mL＊2)次。随后将纯产物通过使其与水(5mL)中的Dowex>+形式(2g)在室温下反应6h经受Na离子交换。随后将反应物料通过Whatmann滤纸过滤。将滤液在减压下浓缩。将粗制物料在真空下干燥2h得到白色固体化合物。精确质量：1235.28；分离产率：38mg，71％，HPSEC纯度：98％。

IR：3434，2067，1634，1383，1221，1043.

¹H>2O)：δH>

¹³C>2O)：δc>

分析检测：

利用合成Men-X四聚体制备的寡聚体和缀合物(Men-X四聚体-TT缀合物)抗原性质的确定

将合成Men-X四聚体及其与破伤风类毒素的缀合物(Men-X四聚体-TT缀合物)的抗原性与涉及无抗原对照的细菌多糖在竞争性酶联免疫测定(ELISA)中进行比较。在该测定中，将八千倍稀释的兔抗脑膜炎奈瑟菌血清组X抗血清(228801；BD)与以10-1000μg寡糖/mL稀释于磷酸缓冲盐水(其含有0.1％v/v Brij 35和5％FBS)中的不同抗原(即细菌多糖、Men-X四聚体(1和1A)和利用合成Men-X四聚体制备的缀合物(1-TT和1A-TT))在96孔微孔板内(板A)中孵育1小时。单独的板(板B)以Men-X细菌多糖(PS)和甲基化人血清白蛋白(m-HSA)的混合物包被，并且在2-8℃下孵育过夜，随后用5％FBS封闭。对于该板B，添加来自于板A的抗血清-抗原混合物并在37℃下孵育1小时以及在室温下孵育1h。将该板以pH 7.4且含有0.1％Brij 35的磷酸缓冲盐水洗涤。将该板在室温下与过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体在PBS、0.1％Brij35和5％FBS中孵育60分钟。再次洗涤该板，并在室温下与100μl过氧化物酶底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺-H₂O₂在乙酸钠缓冲溶液中孵育10分钟。通过添加50μl的2M>2SO₄终止反应。在ELISA读取仪(Tecan微板读取仪)上记录A₄₅₀。抗血清中的抗体对每种抗原的百分比抑制如下计算：

抑制％＝(OD_NAC-OD_A)/(OD_NAC-OD_B)×100

其中，OD_NAC为无抗原对照组的光密度，OD_B为空白孔的光密度。受试抗原(Men-X四聚体和Men-X四聚体-TT缀合物)和阳性对照的光密度指代为OD_A。图1中，α端基异构体(1)的数据表示为一式三份进行的测量的平均值±SD，对于β端基异构体(1A)观测了相似的数据。

该抑制性ELISA结果示出了与“无抗原对照组”相比的基于合成Men X四聚体的TT缀合物的抗原性。如图1中所示，合成Men-X四聚体及其TT缀合物能够显著程度地中和存在于血清中的特异性针对脑膜炎奈瑟菌血清组X多糖的抗体(分别高达68％和89％)并抑制抗体与板上所包被的细菌Men-X多糖的结合。