制备磷酸化丝氨酸膦酸模拟物的方法

摘要

本发明涉及制备磷酸化丝氨酸膦酸模拟物的方法，具体地，所述方法包括：(1)使式1所示化合物进行还原反应，以便获得式2所示化合物；(2)使所述式2所示化合物进行溴化反应，以便获得式3所示化合物；(3)使所述式3所示化合物与式4所示化合物进行接触，以便获得式5所示化合物；(4)使所述式5所示化合物脱保护基，以便获得式(I)所示化合物，其中，R为氢、苄基、邻硝基苄基、香豆素或烯丙基，R

说明书

技术领域

本发明属于生物化学合成领域，具体地，涉及制备磷酸化丝氨酸膦酸模拟物的方法及其应用。

背景技术

蛋白质的磷酸化是一种非常重要的翻译后修饰，它与细胞代谢、信号传导、免疫识别和细胞凋亡等都有密切的关系，与磷酸化有关的酶也常常作为药物分子的靶向目标。然而磷酸化蛋白的研究(特别是体内实验)往往比较困难，其主要原因是磷酸化蛋白难以获得以及在细胞中容易被水解。随着重组表达技术和多肽固相合成技术的发展，以及诸如自然化学连接(NCL)、表达蛋白连接(EPL)等新技术的不断出现，获取磷酸化蛋白正在变得越来越方便；而对于磷酸化蛋白容易水解的问题，前人也开发了一系列模拟物代替天然的磷酸基团，而这些模拟物中效果最好的是以磷碳键模拟磷酸酯键的膦酸类化合物。膦酸模拟物具有与磷酸基结构高度类似，且可以在不被水解的情况下与磷酸水解酶等蛋白结合的优势；通过将其整合到蛋白中磷酸化的位点，就可以通过蛋白质体外结合的方式发现新的蛋白-蛋白相互作用，或者通过微注射的方式观察蛋白在细胞内的稳定性和空间分布情况，从而获得一些其它磷酸化蛋白模拟物难以做到的结果。目前，用膦酸模拟物代替磷酸化氨基酸的磷酸化多肽或蛋白模拟物主要由多肽固相合成法进行化学合成，而灵活性高、与侧链保护基兼容性好的Fmoc策略则是现有的多肽固相合成法的主流策略。

然而，目前制备磷酸模拟物的方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种制备磷酸化丝氨酸膦酸模拟物的方法，包括：

(1)使式1所示化合物进行还原反应，以便获得式2所示化合物；

(2)使所述式2所示化合物进行卤化反应，以便获得式3所示化合物；

(3)使所述式3所示化合物与式4所示化合物进行接触，以便获得式5所示化合物；

(4)使所述式5所示化合物脱保护基，以便获得式(I)所示化合物，

其中，R为氢、苄基、邻硝基苄基、香豆素或烯丙基，R¹为苄基、邻硝基苄基、香豆素或烯丙基等正交保护基，

该方法主要是由保护的天然氨基酸N-叔丁氧羰基-天冬氨酸叔丁酯(Boc-Asp-OtBu)经过还原、溴代、亚磷酸酯取代和脱保护，从而获得磷酸化丝氨酸膦酸模拟物，该方法所采用的原料便宜、易得，反应路线步骤较少，整条路线的总收率在20％以上，可以制备获得高产率高质量的磷酸化丝氨酸膦酸模拟物。利用该方法制备获得的磷酸化丝氨酸膦酸模拟物可以通过多肽固相合成法得到含有磷酸化丝氨酸膦酸模拟物的多肽或蛋白质，可以在细胞内很好地模拟多肽或蛋白中磷酸化丝氨酸的行为而且不会被磷酸水解酶水解，在磷酸化蛋白质研究及抑制剂开发方面具有重要意义。

根据本发明的一些实施例，步骤(1)包括：

(1-1)在乙酸乙酯中，存在二环己基碳二亚胺的情况下，使所述式1所示化合物与N-羟基琥珀酰亚胺接触，以便获得式1所示化合物的N-羟基琥珀酰亚胺活化酯；

(1-2)在1,4-二氧六环中，使所述式1所示化合物的N-羟基琥珀酰亚胺活化酯与硼氢化钠接触，以便获得所述式2所示化合物。式1所示化合物的N-羟基琥珀酰亚胺活化酯中间体无需分离纯化，可以直接用于硼氢化钠还原。

根据本发明的具体实施例，步骤(1)包括：将式1所示化合物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于乙酸乙酯，并加入二环己基碳二亚胺(DCC)，室温下搅拌反应过夜得到式1所示化合物的NHS活化酯，过滤除去不溶物并浓缩滤液，剩余物溶于1,4-二氧六环并加入硼氢化钠，冰浴并滴加少量水引发反应后继续室温反应2小时，用饱和氯化铵溶液淬灭反应，浓缩除去二氧六环后用乙酸乙酯提取，有机相合并后用水和饱和食盐水洗涤，干燥后浓缩并用柱色谱分离，得到式2所示化合物。

根据本发明的具体实施例，步骤(1)中活化酯还原过程反应时间应依据TLC薄层色谱监测的结果进行相应调整，采用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液为展开剂时，式2所示化合物的Rf值约为0.7，其中，乙酸乙酯和环己烷混合溶液中乙酸乙酯和环己烷的体积比为1:1。

根据本发明的具体实施例，步骤(1)中柱色谱分离所采用的展开剂为乙酸乙酯和环己烷的混合溶液，其中乙酸乙酯和环己烷溶液中乙酸乙酯和环己烷的体积比为1:3。

根据本发明的一些实施例，步骤(2)中，所述卤化反应为碘化反应或溴化反应。

根据本发明的一些实施例，步骤(2)中采用Appel反应进行溴化反应，由此可以进一步地提高收率。

根据本发明的一些实施例，步骤(2)包括：

在二氯甲烷中，存在三苯基膦的情况下，使所述式2所示化合物与N-溴代琥珀酰亚胺接触，以便获得所述式3所示化合物。

根据本发明的具体实施例，步骤(2)包括：将所述式2所示化合物溶于二氯甲烷，加入N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)并搅拌分散均匀，在冰浴上向上述混合物中滴加三苯基膦的二氯甲烷溶液，加完后继续室温反应2小时。用水淬灭反应，分出有机相并用二氯甲烷提取水相，提取液与有机相合并后用水和饱和食盐水洗涤，干燥后浓缩并用柱色谱分离，得到所述式2所示化合物。

根据本发明的具体实施例，步骤(2)中采用无水处理后的二氯甲烷。由此，可以提高收率。

根据本发明的具体实施例，步骤(2)中反应时间应依据TLC薄层色谱监测的结果进行相应调整，使用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液作为展开剂时，式3所示化合物的Rf值约为0.6，其中，乙酸乙酯和环己烷的混合溶液中乙酸乙酯和环己烷的体积比为1:4。

根据本发明的具体实施例，步骤(2)中柱色谱分离所采用的展开剂为乙酸乙酯和环己烷的混合溶液，其中，乙酸乙酯和环己烷的混合溶液中乙酸乙酯和环己烷的体积比为1:7。

根据本发明的一些实施例，步骤(3)包括：于惰性气体条件下，在乙腈溶液中，存在DBU的情况下，使所述式3所示化合物与所述式4所示化合物进行接触，以便获得所述式5所示化合物。其中，需要说明的是，DBU为1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯。

根据本发明的具体实施例，步骤(3)包括：在惰性气体保护下，向亚磷酸二苄酯的无水乙腈溶液中加入式3所示化合物，然后在冰浴上搅拌滴加DBU，继续室温反应8小时。反应结束后，用环己烷洗去杂质，乙腈相浓缩并用柱色谱分离，得到2-(叔丁氧羰基氨基)-4-(二苄基膦酸基)丁酸叔丁酯((Boc-Pma(Bn)₂-OtBu)。

根据本发明的具体实施例，步骤(3)中反应需要在无水无氧的条件下进行。由此，可以提高收率。

根据本发明的具体实施例，步骤(3)中反应时间应依据TLC薄层色谱监测的结果进行相应调整，使用乙酸乙酯和环己烷混合溶液作为展开剂时，2-(叔丁氧羰基氨基)-4-(二苄基膦酸基)丁酸叔丁酯((Boc-Pma(Bn)₂-OtBu)的Rf值约为0.5，其中，乙酸乙酯和环己烷混合溶液中乙酸乙酯和环己烷的体积比为1:1。

根据本发明的具体实施例，步骤(3)中若使用亚磷酸二(邻硝基苄醇)酯代替亚磷酸二苄酯，得到2-(叔丁氧羰基氨基)-4-(二邻硝基苄基膦酸基)丁酸叔丁酯，并且反应和后处理过程中应避光。

根据本发明的具体实施例，步骤(3)中柱色谱分离使用的展开剂为乙酸乙酯和环己烷的混合溶液，其中，乙酸乙酯和环己烷的混合溶液中乙酸乙酯和环己烷的体积比为1:2。

根据本发明的一些实施例，步骤(4)包括：使所述式5所示化合物于三氟乙酸-水-三乙基硅烷混合体系中进行反应，以便获得所述式(I)所示化合物。

由此，根据本发明的具体实施例，本发明提出了以下合成路线，可以用于制备所述式(I)所示化合物，

根据本发明的一些实施例，R为苄基，在步骤(3)之后且在步骤(4)之前，进一步包括：对所述式5所示化合物进行脱苄基处理。

根据本发明的具体实施例，向2-(叔丁氧羰基氨基)-4-(二苄基膦酸基)丁酸叔丁酯(Boc-Pma(Bn)₂-OtBu)的乙酸乙酯溶液中加入少量5％钯-碳催化剂，用惰性气体置换出体系内的空气，然后用氢气置换出惰性气体，室温反应过夜。反应结束后过滤除去催化剂，然后在旋转蒸发仪上除去所有溶剂。剩余物用三氟乙酸-水-三乙基硅烷混合体系溶解，继续室温反应2小时。反应结束后，在旋转蒸发仪上除去所有溶剂，剩余物用水和1,4-二氧六环混合体系溶解，并加入碳酸氢钠调节pH至弱碱性，加入芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)并室温反应24小时。反应结束后在旋转蒸发仪上除去二氧六环，剩余水相用乙酸乙酯洗涤后加稀盐酸酸化，再用乙酸乙酯提取。提取液(不包括洗涤液)合并后用水和饱和食盐水洗涤，干燥后在旋转蒸发仪上除去所有溶剂，得到最终产物2-(芴甲氧羰基氨基)-4-膦酸丁酸(Fmoc-Pma)。

其中，需要说明的是，在本发明中，“式X所示化合物”与“化合物X”可以互换使用，X是1-5的整数。

根据本发明的再一个方面，本发明提出了一种磷酸化丝氨酸膦酸模拟物，其为式(I)所示化合物，

其中，R为苄基、邻硝基苄基、香豆素或烯丙基等正交保护基团。由此，可以利用灵活性高、与侧链保护基兼容性好的Fmoc策略多肽固相合成法，使用所述磷酸化丝氨酸膦酸模拟物代替磷酸化氨基酸合成磷酸化多肽或蛋白模拟物；此外，通过在膦酸基上添加邻硝基苄基和烯丙基等正交保护基，可以较容易地实现在膦酸基上的选择性脱保护，从而达到利用不同条件调控磷酸化蛋白模拟物活性的目的。

根据本发明的又一个方面，本发明提出了利用前面所述方法制备获得的磷酸化丝氨酸膦酸模拟物或前面所述磷酸化丝氨酸膦酸模拟物在制备磷酸化多肽和/或蛋白模拟物中的用途。可以利用Fmoc固相合成技术合成获得磷酸化多肽和/或蛋白模拟物。

根据本发明的具体实施例，本发明提出了以下合成路线，可以将氨基保护基团Fmoc或Alloc引入式(I)所示化合物中，从而合成获得磷酸化多肽和/或蛋白模拟物

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例

实施例1

N-叔丁氧羰基-高丝氨酸叔丁酯(Boc-HoSer-OtBu，化合物2)的合成

在100mL圆底烧瓶中加入2.89g N-叔丁氧羰基-天冬氨酸叔丁酯(Boc-Asp-OtBu，化合物1)和1.29g N-羟基琥珀酰亚胺，加入50mL乙酸乙酯使其溶解，然后在搅拌下加入2.26g二环己基碳二亚胺，室温下继续搅拌反应过夜。过滤除去不溶物并在旋转蒸发仪上旋出乙酸乙酯，剩余物在搅拌下溶于50mL 1,4-二氧六环并加入0.76g硼氢化钠，混合物在冰浴上冷却到0℃后缓慢滴加3mL水，然后撤去冰浴继续在室温下反应2小时。加入10mL饱和氯化铵溶液搅拌10分钟，在旋转蒸发仪上除去二氧六环后，剩余水相用100mL乙酸乙酯分4次提取；提取液合并后用20mL水和20mL饱和食盐水各洗两次，无水硫酸镁干燥，在旋转蒸发仪上旋干，然后用1:3乙酸乙酯/环己烷为展开剂进行柱色谱分离，得到2.00g N-叔丁氧羰基-高丝氨酸叔丁酯(Boc-HoSer-OtBu，化合物2)，收率约72％。

实施例2

2-(叔丁氧羰基氨基)-4-溴代丁酸叔丁酯(Boc-Abu(Br)-OtBu，化合物3)的合成

在50mL圆底烧瓶中加入1.95g N-叔丁氧羰基-高丝氨酸叔丁酯(Boc-HoSer-OtBu，化合物2)和1.60g N-溴代琥珀酰亚胺，加入15mL无水二氯甲烷混合均匀，在冰浴上冷却到0℃，并在搅拌下用恒压滴液漏斗缓慢滴加2.38g三苯基膦溶于10mL无水二氯甲烷的溶液，大约20min加完；然后撤去冰浴，继续在室温下反应2小时。反应结束后加入10mL水，分出有机相，剩余水相用75mL二氯甲烷分3次提取；有机相和提取液合并，并用20mL水和20mL饱和食盐水各洗两次，无水硫酸镁干燥，在旋转蒸发仪上旋干，然后用1:7乙酸乙酯/环己烷为展开剂进行柱色谱分离，得到1.71g 2-(叔丁氧羰基氨基)-4-溴代丁酸叔丁酯(Boc-Abu(Br)-OtBu，化合物3)，收率约70％。

实施例3

2-(叔丁氧羰基氨基)-4-(二苄基膦酸基)丁酸叔丁酯(Boc-Pma(Bn)₂-OtBu)的合成

在100mL三颈瓶中加入1.69g 2-(叔丁氧羰基氨基)-4-溴代丁酸叔丁酯(Boc-Abu(Br)-OtBu，化合物3)，用氩气交换数次以除去瓶内空气，然后加入1.50g亚磷酸二苄酯溶于10mL无水乙腈的溶液，搅拌混合均匀。反应体系在冰浴上冷却至0度，用注射器将1mL DBU缓慢滴加到瓶中。加完后撤去冰浴，并继续在室温下反应8小时。反应结束后，混合物的乙腈溶液用10mL环己烷洗涤3次，在旋转蒸发仪上旋干，然后用1:2乙酸乙酯/环己烷为展开剂进行柱色谱分离，得到1.68g 2-(叔丁氧羰基氨基)-4-(二苄基膦酸基)丁酸叔丁酯(Boc-Pma(Bn)₂-OtBu)，收率约65％。

实施例4

2-(芴甲氧羰基氨基)-4-膦酸丁酸(Fmoc-Pma)的合成

在50mL三颈瓶中，加入520mg 2-(叔丁氧羰基氨基)-4-(二苄基膦酸基)丁酸叔丁酯(Boc-Pma(Bn)₂-OtBu)和少量5％钯-碳催化剂，然后加入10mL乙酸乙酯并混合均匀。用氩气置换出体系内的空气，然后用氢气置换出氩气，室温下搅拌反应过夜。反应结束后过滤除去催化剂，然后在旋转蒸发仪上除去所有溶剂。剩余物用10mL三氟乙酸-水-三乙基硅烷混合溶液(95:2.5:2.5)溶解，继续室温反应2小时。反应结束后，在旋转蒸发仪上除去所有溶剂，剩余物用10mL水和10mL>

实施例5

2-(叔丁氧羰基氨基)-4-(二邻硝基苄基膦酸基)丁酸叔丁酯的合成

其中，R为邻硝基苄基。

在50mL三颈瓶中加入1.05g 2-(叔丁氧羰基氨基)-4-溴代丁酸叔丁酯(Boc-Abu(Br)-OtBu，化合物3)和1.58g亚磷酸二(邻硝基苄基)酯，用氩气交换数次以除去瓶内空气，加入10mL无水乙腈溶解，并搅拌混合均匀。反应体系在冰浴上冷却至0度，用注射器将0.5mL DBU缓慢滴加到瓶中。加完后撤去冰浴，并继续在室温下反应8小时。反应结束后，混合物的乙腈溶液用10mL环己烷洗涤3次，在旋转蒸发仪上旋干，然后用1:2乙酸乙酯/环己烷为展开剂进行柱色谱分离，得到0.67g 2-(叔丁氧羰基氨基)-4-(二邻硝基苄基膦酸基)丁酸叔丁酯(Boc-Pma(R)₂-OtBu)，收率约37％。

实施例6

2-(芴甲氧羰基氨基)-4-(二邻硝基苄基膦酸)丁酸的合成

其中，R为邻硝基苄基。

在25mL三颈瓶中，加入300mg 2-(叔丁氧羰基氨基)-4-(二邻硝基苄基膦酸基)丁酸叔丁酯，然后加入5mL三氟乙酸-二氯甲烷-水-三乙基硅烷混合溶液(50:45:2.5:2.5)搅拌均匀，室温下反应6小时。反应结束后，在旋转蒸发仪上除去所有溶剂，剩余物用5mL水和5mL 1,4-二氧六环混合体系溶解，并用碳酸氢钠调节pH至8～9，加入200mg芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)并室温反应24小时。反应结束后在旋转蒸发仪上旋出二氧六环，剩余水相用5mL乙酸乙酯洗涤两次后加稀盐酸酸化至pH为2～3，可见有白色固体析出；再用60mL乙酸乙酯分4次提取；提取液合并后用15mL水和15mL饱和食盐水各洗两次，无水硫酸镁干燥，在旋转蒸发仪上旋干，得到152mg 2-(芴甲氧羰基氨基)-4-(二邻硝基苄基膦酸)丁酸，收率约46％。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。