一种玉米大斑病菌产孢培养基及其应用

摘要

本发明提供一种玉米大斑病菌产孢培养基及其应用，所述的玉米大斑病菌产孢培养基每升中含有以下原料组分：甘露醇20~25 g、蛋白胨3~5 g、新鲜玉米叶40~60 g、高粱粒30~50 g、琼脂粉14~16 g。玉米大斑病菌在该产孢培养基25℃黑暗培养10~15 d，用灭菌毛笔沾无菌水刷去玉米大斑病菌表层气生菌丝，25℃光暗交替培养72 h，即产生大量形态一致、成熟度一致的分生孢子。利用该培养基培养产生的玉米大斑病菌分生孢子进行玉米品种抗病性鉴定，可评价玉米品种资源对大斑病的抗性水平，这将对玉米大斑病的防控起到积极作用。

说明书

技术领域

本发明涉及植物病原真菌研究技术领域，具体地说，涉及一种玉米大斑病菌（Exserohilum>）产孢培养基及其应用。

背景技术

玉米大斑病（Northern Corn Leaf Blight）又称为叶斑病、枯叶病、条斑病，是世界各地玉米重要的叶部病害，是由玉米大斑病菌（Exserohilum>（Pass.）Leonard et Suggs）（又称玉米大斑凸脐孺孢菌）引起的。玉米大斑病菌主要以菌丝或分生孢子附着在病残组织内越冬，翌年初借气流传播到植株上。在气温20~25℃条件下，从孢子两端长出芽管、附着孢和侵入丝，从表皮细胞或表皮细胞间直接侵入，6~12 h即可完成，3~4 d即可形成病斑，之后病斑产生分生孢子，随气流和雨水传播，对田间的玉米进行反复侵染，造成病害爆发流行。目前防治该病害主要以种植抗病品种为主，科学合理的品种布局，减少初侵染源，化学防治等综合技术措施。而在病菌致病性测定、品种抗病性鉴定及防治药剂筛选试验中往往需要大量人工培养的分生孢子作为研究试验材料，如何快速获得大量分生孢子在很大程度上决定着研究的进展和成败。

现有技术常采用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基进行玉米大斑病菌产孢培养，但由于产孢量少，限制了抗病品种选育和抗性资源筛选等研究工作的深入研究。因此，寻找一种简便的适合玉米大斑病菌快速大量产孢的培养基具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种玉米大斑病菌的产孢培养基，综合利用碳源、氮源和维生素，提高玉米大斑病菌的产孢量。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案提供一种玉米大斑病菌的产孢培养基，所述的玉米大斑病菌产孢培养基每升中含有以下原料组分：甘露醇20~25 g、蛋白胨3~5 g、新鲜玉米叶40~60 g、高粱粒30~50 g、琼脂粉14~16 g。

作为优选的技术方案，所述的玉米大斑病菌的产孢培养基每升中含有以下原料组分：甘露醇25 g、蛋白胨4 g、新鲜玉米叶50 g、高粱粒50 g、琼脂粉15 g。

将所述的高粱粒用料理机粉碎备用，新鲜玉米叶清水洗净后加玉米叶质量20倍的清水煮沸30~40 min后过滤，上清液中加入粉碎的高粱粒、甘露醇、蛋白胨和琼脂粉，加热溶解，加水定容，调节pH值至7.0，121 ℃高压灭菌20 min，冷却得到玉米大斑病菌大量产孢培养基。

病原菌采集自福建三明、南平等地玉米叶片（采集时间为2014~2015年），采用柯赫氏法则验证，即观察分离纯化后的病原菌形态特征，并用PDA培养基培养所得的分生孢子接种玉米植株，观察其发病症状，镜检分离病原菌。同时，将我们测得的Exserohilum>（Pass.）Leonard et Suggs DNA-ITS序列（GenBank登录号为KX266811）在Genbank中进行比对，与Setosphaeria>菌株（登录号为KR263032）的同源性为99%。因此，将病原菌鉴定为玉米大斑病菌[Exserohilum>（Pass.）Leonard et Suggs]。

本发明还提供所述的玉米大斑病菌产孢培养基的产孢方法，具体方法为：将活化好的玉米大斑病菌，用直径5 mm打孔器从其边缘打取菌碟，然后转移至所述的玉米大斑病菌产孢培养基表面，25℃下黑暗培养10~15 d，用灭菌毛笔沾无菌水刷去玉米大斑病菌表层气生菌丝，25℃光暗交替培养72 h，即产生大量形态一致、成熟度一致的分生孢子。

本发明还提供用所述的玉米大斑病菌产孢培养基在玉米品种抗大斑病鉴定中的应用，具体方法为：用灭菌毛笔和无菌水将玉米大斑病菌产孢培养基表面的玉米大斑病菌分生孢子刷下，过滤后配制成每毫升1~5×10⁵个孢子的分生孢子悬浮液，在玉米品种5~10叶期进行玉米植株喷雾接种，病情稳定后调查发病情况，鉴定玉米品种的抗病性。

本发明提供的玉米大斑病菌的产孢培养基配料简单，取材方便，可操作性强，分别以甘露醇为碳源，蛋白胨为氮源，提供了玉米大斑病菌产孢所需要的碳、氮元素，加入的生长因子—高粱粒中的维生素调节微生物正常代谢，加入的玉米叶促进了玉米大斑病菌的产孢。本发明提供的玉米大斑病菌的产孢培养基平板菌落长势良好、产孢能力明显优于常规的PDA培养基，产孢量为等量的PDA培养基产孢量的4.3~23.1倍。本发明提供的玉米大斑病菌的产孢培养基可用于后续的抗病品种选育和抗性资源筛选等研究工作。

附图说明

图1为玉米大斑病菌在不同培养基上的菌落生长情况，其中图A为PDA培养基，图B为配比一，图C为配比二，图D为配比三，图E为配比四，图F为配比五；

图2为玉米大斑病菌在不同培养基上的产孢情况，其中图A为配比一，图B为配比二，图C为配比三，图D为配比四，图E为配比五，图F为PDA培养基；

图3为玉米大斑病菌在优化的产孢培养基上的菌落形态、菌丝形态、分生孢子和分生孢子梗形态，其中图A为菌落形态，图B为菌丝形态，图C为分生孢子形态，图D为分生孢子梗形态；

图4为玉米大斑病菌产孢培养基产生的分生孢子接种后玉米发病情况，其中图A为清水对照，图B为配比四的分生孢子悬浮液接种，图C为病斑局部照片。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修饰或替换，均属于本发明的范畴。

实施例1：

（1）用清水配制如下配方的玉米大斑病菌产孢培养基（配比一），每升中含有以下原料组分：甘露醇20 g、蛋白胨3 g、新鲜玉米叶40 g、高粱粒30 g、琼脂粉14 g。

（2）将所述的高粱粒用料理机粉碎备用，新鲜玉米叶清水洗净后加玉米叶质量20倍的清水煮沸30 min后过滤，上清液中加入粉碎的高粱粒、甘露醇、蛋白胨和琼脂粉，加热溶解，加水定容至1 L，调节pH值至7.0，121 ℃灭菌20 min，冷却得到玉米大斑病菌大量产孢培养基。

（3）将保存在4℃冰箱中的玉米大斑病菌取出，转接到PDA培养基（PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，水1 L）上活化，再将活化好的玉米大斑病菌用直径5 mm打孔器从其边缘打取菌碟，然后将菌碟转移至所述的玉米大斑病菌产孢培养基表面，处理设置3次重复，以PDA培养基为对照，25℃黑暗培养13 d（图1-B），用灭菌毛笔沾无菌水刷去玉米大斑病菌表层气生菌丝，25℃光暗交替培养72 h，每皿加入20 mL的无菌水，用灭菌毛笔将玉米大斑病菌产孢培养基表面的玉米大斑病菌分生孢子刷下，统计产孢量，其产孢量为PDA培养基的4.3倍，如图2-A所示。

实施例2：

（1）用清水配制如下配方的玉米大斑病菌产孢培养基（配比二），每升中含有以下原料组分：甘露醇25 g、蛋白胨5 g、新鲜玉米叶60 g、高粱粒50 g、琼脂粉16 g。

（2）将所述的高粱粒用料理机粉碎备用，新鲜玉米叶清水洗净后加玉米叶质量20倍的清水煮沸40 min后过滤，上清液中加入粉碎的高粱粒、甘露醇、蛋白胨和琼脂粉，加热溶解，加水定容至1 L，调节pH值至7.0，121 ℃灭菌20 min，冷却得到玉米大斑病菌大量产孢培养基。

（3）将保存在4℃冰箱中的玉米大斑病菌取出，转接到PDA培养基（PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，水1 L）上活化，再将活化好的玉米大斑病菌用直径5 mm打孔器从其边缘打取菌碟，然后将菌碟转移至所述的玉米大斑病菌产孢培养基表面，处理设置3次重复，以PDA培养基为对照，25℃黑暗培养10 d（图1-C），用灭菌毛笔沾无菌水刷去玉米大斑病菌表层气生菌丝，25℃光暗交替培养72 h，每皿加入20 mL的无菌水，用灭菌毛笔将玉米大斑病菌产孢培养基表面的玉米大斑病菌分生孢子刷下，统计产孢量，其产孢量为PDA培养基的12.7倍，如图2-B所示。

实施例3：

（1）用清水配制如下配方的玉米大斑病菌产孢培养基（配比三），每升中含有以下原料组分：甘露醇20 g、蛋白胨5 g、新鲜玉米叶40 g、高粱粒40 g、琼脂粉15 g。

（2）将所述的高粱粒用料理机粉碎备用，新鲜玉米叶清水洗净后加玉米叶质量20倍的清水煮沸35 min后过滤，上清液中加入粉碎的高粱粒、甘露醇、蛋白胨和琼脂粉，加热溶解，加水定容至1 L，调节pH值至7.0，121 ℃灭菌20 min，冷却得到玉米大斑病菌大量产孢培养基。

（3）将保存在4℃冰箱中的玉米大斑病菌取出，转接到PDA培养基（PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，水1 L）上活化，再将活化好的玉米大斑病菌用直径5 mm打孔器从其边缘打取菌碟，然后将菌碟转移至所述的玉米大斑病菌产孢培养基表面，处理设置3次重复，以PDA培养基为对照，25℃黑暗培养12 d（图1-D），用灭菌毛笔沾无菌水刷去玉米大斑病菌表层气生菌丝，25℃光暗交替培养72 h，每皿加入20 mL的无菌水，用灭菌毛笔将玉米大斑病菌产孢培养基表面的玉米大斑病菌分生孢子刷下，统计产孢量，其产孢量为PDA培养基的6.5倍，如图2-C所示 。

实施例4：

（1）用清水配制如下配方的玉米大斑病菌产孢培养基（配比四），每升中含有以下原料组分：甘露醇25 g、蛋白胨4 g、新鲜玉米叶50 g、高粱粒50 g、琼脂粉15 g。

（2）将所述的高粱粒用料理机粉碎备用，新鲜玉米叶清水洗净后加玉米叶质量20倍的清水煮沸40 min后过滤，上清液中加入粉碎的高粱粒、甘露醇、蛋白胨和琼脂粉，加热溶解，加水定容至1 L，调节pH值至7.0，121 ℃灭菌20 min，冷却得到玉米大斑病菌大量产孢培养基。

（3）将保存在4℃冰箱中的玉米大斑病菌取出，转接到PDA培养基（PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，水1 L）上活化，再将活化好的玉米大斑病菌用直径5 mm打孔器从其边缘打取菌碟，然后将菌碟转移至所述的玉米大斑病菌产孢培养基表面，处理设置3次重复，以PDA培养基为对照，25℃黑暗培养14 d（图1-E），用灭菌毛笔沾无菌水刷去玉米大斑病菌表层气生菌丝，25℃光暗交替培养72 h，每皿加入20 mL的无菌水，用灭菌毛笔将玉米大斑病菌产孢培养基表面的玉米大斑病菌分生孢子刷下，统计产孢量，其产孢量为PDA培养基23.1倍，如图2-D、图3所示。

实施例5：

（1）用清水配制如下配方的玉米大斑病菌产孢培养基（配比五），每升中含有以下原料组分：甘露醇23 g、蛋白胨4 g、新鲜玉米叶50 g、高粱粒40 g、琼脂粉15 g。

（2）将所述的高粱粒用料理机粉碎备用，新鲜玉米叶清水洗净后加玉米叶质量20倍的清水煮沸35 min后过滤，上清液中加入粉碎的高粱粒、甘露醇、蛋白胨和琼脂粉，加热溶解，加水定容至1 L，调节pH值至7.0，121 ℃灭菌20 min，冷却得到玉米大斑病菌大量产孢培养基。

（3）将保存在4℃冰箱中的玉米大斑病菌取出，转接到PDA培养基（PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，水1 L）上活化，再将活化好的玉米大斑病菌用直径5 mm打孔器从其边缘打取菌碟，然后将菌碟转移至所述的玉米大斑病菌产孢培养基表面，处理设置3次重复，以PDA培养基为对照，25℃黑暗培养15 d（图1-F），用灭菌毛笔沾无菌水刷去玉米大斑病菌表层气生菌丝，25℃光暗交替培养72 h，每皿加入20 mL的无菌水，用灭菌毛笔将玉米大斑病菌产孢培养基表面的玉米大斑病菌分生孢子刷下，统计产孢量，其产孢量为PDA培养基12.9倍，如图2-E所示。

实施例6：

将实施例4获得的分生孢子配制成每毫升1~5×10⁵个孢子的分生孢子悬浮液，待玉米长至5~10叶期时进行喷雾接种，接种后覆膜黑暗保湿培养24>

上述所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，所作出的修改与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。

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