马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺

摘要

本发明公开了一种马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺，属于农业微生物领域。本发明依次通过TSA复苏冻干种子、在TSA琼脂斜面一级中培养、在TSB培养基进行二级种子培养、在无血清和葡萄糖的加富胰酪蛋白培养基中厌氧发酵，得到马链球菌兽疫亚种发酵高密度抗原。本发明通过不添加任何血清和葡萄糖、厌氧发酵培养的方法，进行工业放大生产研究，发酵抗原含量无降低，发酵过程中不用调整通气、控制溶氧，抗原含量高，工艺参数容易控制，减少补料；较现有发酵工艺稳定、生长速度快，易于实现马链球菌抗原的大规模高密度培养。同时提高菌株的免疫原性，提高疫苗的保护效果。

说明书

技术领域

本发明涉及农业微生物技术领域，特别涉及一种马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺。

背景技术

马链球菌兽疫亚种根据兰氏分群属于C群链球菌，该菌可引起多种动物感染，临床症状表现为败血症、脑膜炎、关节炎等，一般呈地方流行性。随着集约化养猪业的发展，中国猪链球菌病时有发生。流行病学调查表明，除猪链球菌2型外，马链球菌兽疫亚种仍是中国各地猪链球菌病的主要病原。目前控制该病的主要手段仍是疫苗，主要有弱毒疫苗、灭活苗。

马链球菌弱毒菌株ST171是生产链球菌弱毒活疫苗的专用菌株，对其培养及研究局限于大瓶培养和普通发酵活菌低的特点。马链球菌兽疫亚种为兼性厌氧型微生物，生长过程中需要血清和葡萄糖作为营养物质，但是这些异源物质的残存会使疫苗存在安全隐患。普通发酵工艺要随着发酵的进行不断调整通气量，控制溶氧，同时需要添加2~5%的血清和1%的葡萄糖。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺。本发明通过不添加任何血清和葡萄糖、厌氧发酵培养的方法，进行工业放大生产研究，发酵抗原含量无降低，发酵过程中不用调整通气、控制溶氧，抗原含量高，工艺参数容易控制，减少补料；较现有发酵工艺稳定、生长速度快，易于实现马链球菌抗原的大规模高密度培养。

本发明的技术方案为：

一种马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺，包括步骤：

1）取冻干的发酵种子菌用活化培养基活化，至单菌落长出；

2）挑取单菌落至一级种子培养基，培养12-16小时，得一级种子；

3）取一级种子并接种于二级种子培养基，培养至OD₆₀₀值达到0.4-0.6，得二级种子；

4）以1%-3%接种量将二级种子液转接至发酵罐中的发酵培养基进行发酵种子培养；调节pH至7.2±0.2，关闭进气阀和出气阀，保持罐体正压0.03-0.05Mpa，搅拌速度为50-150rpm；当OD₆₀₀­值达到一定数值时停止发酵，收获菌液，得到马链球菌兽疫亚种发酵高密度抗原；所述发酵培养基为加富胰酪蛋白培养基。

作为优选方案，还包括步骤5），将发酵种子培养收获的菌液以1%-3%的接种量接种至体积更大的发酵罐中进行扩大培养，扩大培养的培养基也为加富胰酪蛋白培养基，扩大培养的工艺条件为：pH 7.2±0.2，罐体正压0.03-0.05Mpa，搅拌速度为50-150rpm；当OD₆₀₀值达到1.5-1.9时停止发酵，收获菌液，得到马链球菌兽疫亚种发酵高密度抗原。

作为优选方案，步骤1）中，所述活化培养基为添加有3-8%成牛血清的TSA培养基。

作为优选方案，步骤2）中，所述一级种子培养基为添加有3-8%成牛血清的TSA培养基。

进一步地，步骤3）中，所述二级种子培养基为添加有3-8%成牛血清的TSB培养基。

进一步地，步骤3）中，以1-3 mL TSB液体洗涤一级种子培养基的琼脂斜面，将一级种子接种于二级种子培养基，然后于36-38℃，50-150rpm条件下，摇床震荡培养3-4h。

作为优选方案，所述发酵种子菌为马链球菌兽疫亚种ST171株。

作为优选方案，所述扩大培养所用发酵罐的体积为200-400L，所述发酵种子培养所用发酵罐的提交为8-20L。

本发明的有益效果为：

本发明通过不添加任何血清和葡萄糖、厌氧发酵培养的方法，进行工业放大生产研究，发酵抗原含量无降低，发酵过程中不用调整通气、控制溶氧，抗原含量高，工艺参数容易控制，减少补料；较现有发酵工艺稳定、生长速度快，易于实现马链球菌抗原的大规模高密度培养。同时提高菌株的免疫原性，提高疫苗的保护效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为普通发酵工艺与本发明发酵工艺发酵生长曲线对比图；曲线A代表本发明发酵工艺；曲线B代表普通发酵工艺。

具体实施方式

以下各实施例中所用TSA培养基以及TSB培养基购自美国BD公司；加富胰酪蛋白培养基购自山东阳谷蛋白侨润办事处 润鑫蛋白厂。

实施例1

一种马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺，包括步骤：

1）取冻干的马链球菌兽疫亚种ST171株发酵种子菌，在添加有5%成牛血清的TSA培养基活化12-16小时，至单菌落长出；

2）挑取单菌落至添加有5%成牛血清的TSA琼脂斜面，培养12-16小时，得一级种子；

3）以2 mL TSB液体洗涤添加有5%成牛血清的TSA琼脂斜面，将一级种子接种于添加有5%成牛血清的TSB培养基，然后于37℃，100rpm条件下，摇床震荡培养3-4h，培养至OD₆₀₀值达到0.4-0.6，得二级种子；

4）以2%（V/V）的接种量将二级种子液转接至10L发酵罐中的发酵培养基(加富胰酪蛋白培养基)进行发酵种子培养；采用10M的氢氧化钠调节pH至7.2±0.2，121℃灭菌30min，关闭进气阀和出气阀，保持罐体正压0.03-0.05Mpa，搅拌速度为100rpm；培养4小时后开始取样测定OD₆₀₀­值和活菌计数，5小时活菌数达到63亿cfu/mL；OD₆₀₀­值达到1.7时停止发酵，收获菌液，得到马链球菌兽疫亚种发酵高密度抗原。

实施例2

一种马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺，包括步骤：

1）取冻干的马链球菌兽疫亚种ST171株发酵种子菌，在添加有7%成牛血清的TSA培养基活化12-16小时，至单菌落长出；

2）挑取单菌落至添加有7%成牛血清的TSA琼脂斜面，培养12-16小时，得一级种子；

3）以3 mL TSB液体洗涤添加有7%成牛血清的TSA琼脂斜面，将一级种子接种于添加有7%成牛血清的TSB培养基，然后于38℃，100rpm条件下，摇床震荡培养3-4h，培养至OD₆₀₀值达到0.4-0.6，得二级种子；

4）以3%（V/V）的接种量将二级种子液转接至15L发酵罐中的发酵培养基(加富胰酪蛋白培养基)进行发酵种子培养；采用10M的氢氧化钠调节pH至7.2±0.2，121℃灭菌30min，关闭进气阀和出气阀，保持罐体正压0.03-0.05Mpa，搅拌速度为100rpm；培养4小时后开始取样测定OD₆₀₀­值和活菌计数，5小时活菌数达到62亿cfu/mL；OD₆₀₀­值达到1.8时停止发酵，收获菌液，得到马链球菌兽疫亚种发酵高密度抗原。

实施例3

一种马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺，包括步骤：

1）取冻干的马链球菌兽疫亚种ST171株发酵种子菌，在添加有5%成牛血清的TSA培养基活化12-16小时，至单菌落长出；

2）挑取单菌落至添加有5%成牛血清的TSA琼脂斜面，培养12-16小时，得一级种子；

3）以2 mL TSB液体洗涤添加有5%成牛血清的TSA琼脂斜面，将一级种子接种于添加有5%成牛血清的TSB培养基，然后于37℃，100rpm条件下，摇床震荡培养3-4h，培养至OD₆₀₀值达到0.4-0.6，得二级种子；

4）以2%（V/V）的接种量将二级种子液转接至10L发酵罐中的发酵培养基(加富胰酪蛋白培养基)进行发酵种子培养；采用10M的氢氧化钠调节pH至7.2±0.2，121℃灭菌30min，关闭进气阀和出气阀，保持罐体正压0.03-0.05Mpa，搅拌速度为100rpm；

5）当当步骤4）中发酵种子培养至OD₆₀₀­值达到0.4-0.6时，取步骤4）发酵罐中的菌液，以2%（V/V）的接种量转接至300L发酵罐中的发酵培养基(加富胰酪蛋白培养基)进行扩大培养；采用10M的氢氧化钠调节pH至7.2±0.2，121℃灭菌30min，关闭进气阀和出气阀，保持罐体正压0.03-0.05Mpa，搅拌速度为100rpm；培养4小时后开始取样测定OD₆₀₀­值和活菌计数，5小时活菌达到70亿cfu/mL；OD₆₀₀­值达到1.7时停止发酵，收获菌液，得到马链球菌兽疫亚种发酵高密度抗原。

对比例1

一种马链球菌兽疫亚种普通发酵工艺，包括步骤：

1）取冻干的马链球菌兽疫亚种ST171株发酵种子菌，在添加有5%成牛血清的TSA培养基活化12-16小时，至单菌落长出；

2）挑取单菌落至添加有5%成牛血清的TSA琼脂斜面，培养12-16小时，得一级种子；

3）以2 mL TSB液体洗涤添加有5%成牛血清的TSA琼脂斜面，将一级种子接种于添加有5%成牛血清的TSB培养基，然后于37℃，100rpm条件下，摇床震荡培养3-4h，培养至OD₆₀₀值达到0.4-0.6，得二级种子；

4）以2%（V/V）的接种量将二级种子液转接至10L发酵罐中的发酵培养基(加富胰酪蛋白培养基)进行发酵种子培养，添加5%成牛血清和1%的葡萄糖；采用10M的氢氧化钠调节pH至7.2±0.2，121℃灭菌30min，控制溶氧在10~50%，搅拌速度为100rpm；培养4小时后开始取样测定OD₆₀₀­值和活菌计数，6小时活菌数达到61亿cfu/mL；OD₆₀₀­值达到1.7时停止发酵，收获菌液，得到马链球菌兽疫亚种发酵高密度抗原。

实施例1（本发明发酵工艺）所得发酵抗原与对比例1（普通发酵工艺）所得发酵抗原分别配制疫苗进行21-28日龄仔猪免疫，免疫后28天按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》（2000年版）的《猪败血性链球菌病活疫苗制造及检验规程》进行效力检验，对照猪免疫相同剂量的铝胶生理盐水稀释液，结果如表1所示。

由表1可知，本发明发酵工艺所得抗原的免疫原性明显改善，提高了疫苗的保护效果。

实施例1（本发明发酵工艺）与对比例1（普通发酵工艺）发酵生长曲线对比图如图1所示；由图1可知，本发明发酵工艺较现有普通发酵工艺稳定、生长速度快，易于实现马链球菌抗原的大规模高密度培养。