一种辽藁本愈伤组织的培养方法

摘要

本发明提供了辽藁本的组织培养方法，将新鲜辽藁本叶片，以MS为愈伤组织诱导培养的基础培养基，添加2,4‑二氯苯氧乙酸、6‑糖基氨基嘌呤、蔗糖、琼脂、肌醇作为培养基进行培养。以总培养基计，MS，2,4‑二氯苯氧乙酸、6‑糖基氨基嘌呤、蔗糖、琼脂、肌醇的重量组成比：1000g:0.2~0.5mg:0.04~0.08mg:6~9g：1.2~2g:0.01~0.03g。目前，有关辽藁本组织培养的文献报道未见报道，采用本发明得到的愈伤组织，在组合培养基上，不仅愈伤组织长得快且大，而且外观为嫩绿色，长势好。

说明书

技术领域：

本发明涉及辽藁本的愈伤组织的培养方法，属于中药的技术领域。

背景技术：

辽藁本(Ligusticum jeholense Nakai et Kitag)为伞形科藁本属多年生草本植物，是《中华人民共和国药典》收载的大宗常用中药藁本的主要来源之一，主要分布于辽宁、吉林、山西及山东地区。辽藁本味辛、温。具有祛风，散寒，除湿，止疼作用。用于风寒感冒，颠顶疼痛，风湿痹痛。现代药理研究表明其具有治疗风寒泄泻、周身疼痛、疥癣、腹痛等疾病。

由于没有规范化管理以及经济利益的驱使，多年来对野生资源不可持续的采挖，使辽藁本的产量不断下降，野生藁本资源遭到严重破坏。野生辽藁本的引种和人工栽培实践中，种群以无性更新为主。而以根茎进行抚育和移栽工作进展缓慢，为了保护这一野生资源，本发明对辽藁本进行了愈伤组织培养的研究，提出科学有效地恢复和扩大辽藁本种群的提供新途径。

发明内容：

本发明的目的在于提供辽藁本愈伤组织培养在获得辽藁本中的应用。

本发明的另一个目的是提供辽藁本愈伤组织培养的方法。

本发明是通过如下方案实现的：

取辽藁本嫩叶灭菌，以MS为愈伤组织诱导培养的基础培养基，添加2,4-二氯苯氧乙酸、6-糖基氨基嘌呤、蔗糖、琼脂、肌醇作为培养基进行培养。

所述的基础培养基为：MS培养基。

所述的MS培养基、2,4-二氯苯氧乙酸、6-糖基氨基嘌呤、蔗糖、琼脂、肌醇的重量组成比为：1000g:0.2～0.5mg:0.04～0.08mg:6～9g：1.2～2g:0.01～0.03g。

进一步地，所述的2,4-二氯苯氧乙酸的重量为：MS：2,4-二氯苯氧乙酸＝1000g：0.2～0.3mg。

所述的6-糖基氨基嘌呤的重量组成为：MS：6-糖基氨基嘌呤＝1000g：0.04～0.06mg。

所述的蔗糖的重量组成为：MS：蔗糖＝1000g：6～7.5g。

所述的琼脂的重量组成为：MS：琼脂＝1000g：1.2～1.5g。

所述的肌醇的重量组成为：MS：肌醇＝1000g：0.01～0.015g。

具体地，本发明的培养方法为：

将辽藁本的嫩叶进行灭菌，剪成0.5×0.5cm的小块，以1000gMS为愈伤组织诱导培养的基础培养基，添加2.0～2.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸10mL～15mL，0.4～0.5mg/L 6-糖基氨基嘌呤10～15mL，30～35g/L蔗糖20～25mL，6～8g/L琼脂20～25mL，0.1～0.15g/L肌醇10～15mL，调节PH＝5.8～6.0的组合培养基，每种培养基接种培养40～50个嫩叶小块，培养60～70天，即可。

本发明针对没有文献报道辽藁本的愈伤组织培养，采用组合培养基，进行辽藁本嫩叶的组织培养，从而得到外观为嫩绿色，长势好的愈伤组织。

具体实施方式：

实施例1：

①将采集的新鲜辽藁本的嫩叶去掉茎；放于磨口广口瓶中用自来水冲洗2小时，再用70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3次，2％次氯酸钠洗3分钟，无菌水洗6次，放入无菌培养皿中用滤纸吸干表面水；将已经灭菌的叶片切成0.5×0.5cm的小块，作为愈伤组织诱导培养的材料；

②以1000g MS为愈伤组织诱导培养的基础培养基，向其中添加2.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸10mL～15mL，0.4mg/L 6-糖基氨基嘌呤10mL～15mL，30g/L蔗糖20mL～25mL，6g/L琼脂20mL～25mL；

③调节组合培养基的P H＝5.8～6.0；

④培养基接种培养50个叶片小块，培养60～70天，结果愈伤组织外观为黄褐色，组织生长缓慢，长势不好。

实施例2：

①将采集的新鲜辽藁本的嫩叶去掉茎；放于磨口广口瓶中用自来水冲洗2小时，再用70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3次，2％次氯酸钠洗3分钟，无菌水洗6次，放入无菌培养皿中用滤纸吸干表面水；将已经灭菌的嫩茎切成0.5cm的小块，作为愈伤组织诱导培养的材料；

②以1000gMS为愈伤组织诱导培养的基础培养基，向其中添加0.4mg/L 6-糖基氨基嘌呤10mL～15mL，30g/L蔗糖20mL～25mL，6g/L琼脂20mL～25mL；0.1g/L 肌醇10～15mL；

③调节组合培养基的PH＝5.8～6.0；

④培养基接种培养50个叶片小块，培养60～70天，结果愈伤组织外观为黄褐色，组织生长较少，长势不好。

实施例3：

①将采集的新鲜辽藁本嫩叶去掉茎；放于磨口广口瓶中用自来水冲洗2小时，再用70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3次，2％次氯酸钠洗3分钟，无菌水洗6次，放入无菌培养皿中用滤纸吸干表面水；将已经灭菌的叶片切成0.5×0.5cm的小块，作为愈伤组织诱导培养的材料；

②以1000g MS为愈伤组织诱导培养的基础培养基，向其中添加2.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸10mL～15mL，30g/L蔗糖20mL～25mL，6g/L琼脂20mL～25mL，0.1g/L肌醇10～15mL；

③调节组合培养基的PH＝5.8～6.0；

④培养基接种培养50个叶片小块，培养60～70天，结果愈伤组织外观为黄褐色，组织生长较少，长势不好。

实施例4：

①将采集的新鲜辽藁本嫩叶去掉茎；放于磨口广口瓶中用自来水冲洗2小时，再用70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3次，2％次氯酸钠洗3分钟，无菌水洗6次，放入无菌培养皿中用滤纸吸干表面水；将已经灭菌的叶片切成0.5×0.5cm的小块，作为愈伤组织诱导培养的材料；

②以1000g MS为愈伤组织诱导培养的基础培养基，向其中添加2.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸10mL～15mL，0.4mg/L 6-糖基氨基嘌呤10mL～15mL，30g/L蔗糖20mL～25mL，6g/L琼脂20mL～25mL，0.1g/L肌醇10～15mL；

③调节组合培养基的PH＝7.0～7.5；

④培养基接种培养50个叶片小块，培养60～70天，结果愈伤组织外观为褐色，组织生长很缓慢几乎不生长，长势非常不好。

实施例5：

①将采集的新鲜辽藁本嫩叶去掉茎；放于磨口广口瓶中用自来水冲洗2小时，再用70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3次，2％次氯酸钠洗3分钟，无菌水 洗6次，放入无菌培养皿中用滤纸吸干表面水；将已经灭菌的叶片切成0.5×0.5cm的小块，作为愈伤组织诱导培养的材料；

②以1000g MS为愈伤组织诱导培养的基础培养基，向其中添加2.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸10mL～15mL，0.4mg/L 6-糖基氨基嘌呤10mL～15mL，30g/L蔗糖20mL～25mL，6g/L琼脂20mL～25mL，0.1g/L肌醇10～15mL；

③调节组合培养基的PH＝5.8～6.0；

④培养基接种培养50个叶片小块，培养60～70天，结果愈伤组织外观为嫩绿色，长得快且大，长势好。

实验结论：各种激素及PH值对辽藁本的愈伤组织生长影响较大，在各种激素适量及PH＝5.8～6.0时生长效果最好；在组合生长调节剂的培养基上，嫩叶不仅愈伤组织长得快且大，而且外观为嫩绿色，长势好。