三萜2位α-羟化酶MAA45及其相关生物材料与它们在制备山楂酸和科罗索酸中的应用

摘要

本发明公开了三萜2位α‑羟化酶MAA45及其相关生物材料与它们在制备山楂酸和科罗索酸中的应用。本发明公开的三萜2位α‑羟化酶MAA45是如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，MAA45可以以齐墩果酸为底物制备山楂酸，还可以以乌索酸为底物制备科罗索酸，可以利用MAA45及其编码基因制备山楂酸和科罗索酸，还可以利用MAA45催化三萜2位α‑羟化。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中三萜2位α-羟化酶MAA45及其相关生物材料与它们 在制备山楂酸和科罗索酸中的应用。

背景技术

山楂酸(Maslinicacid)(式1)、科罗索酸(Corosolicacid)(式2)和积雪草 酸(Asiaticacid)(式3)等为代表的2位α-羟化药用三萜类活性成分均是山楂 (CrataeguspinnatifidaBunge)，枇杷(Eriobotryajaponica)，大花紫薇 (Lagerstroemiaspeciosa(L.)Pers.)和积雪草(Centellaasiatica(L.)Urb.) 等药用植物自身合成的微量次生代谢物，山楂酸与科罗索酸均为五环三萜酸，分属于 β-香树脂型或α-香树脂型五环三萜类化合物，山楂酸与科罗索酸为同分异构体，在植 物体内，二者常常共同存在。山楂酸、科罗索酸和积雪草酸在抗癌，抗艾滋病毒，美 容及肝脏保护等领域有广泛应用，已作为营养补充剂或化妆品在市场上流通。目前这 类化合物主要是从山楂，大花紫薇、枇杷等植物中分离提取得到，但这种方法有较多 的缺点，包括含量低和差异大，产品纯化难，植物生长周期长，对生物资源尤其野生 资源造成严重破坏等。

目前利用合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来生产天然产物已被国际认 为是一种最有潜力的方法，如在大肠杆菌中生产紫杉醇的前体紫杉二烯已达到 1000mg/L(ParayilKumaranAjikumaretal.,2010,Science,330:70-74)；银杏 内酯类(Ginkgolides)前体左旋海松二烯(Levopimaradiene)，在改造后的大肠杆菌 工程菌中达到700mg/L的产量(EffendiLeonardetal.,2010,PNAS,107(31): 13654–13659)；在酵母工程菌中生产青蒿素(Artemisinin)的前体青蒿酸 (Artemisinicacid)最高达到25g/L(PaddonCJetal.,2013,Nature,2013,496: 528-532)；目前国内在青蒿素，紫杉醇，人参皂苷和丹参酮等药物分子的生物合成方 面有相关研究。

然而，清晰的天然药物生物合成过程是应用合成生物学技术创建人工细胞工厂发 酵生产目标化合物的前提。目前在三萜化合物的生物合成途径研究方面已有相关进展， 包括形成各三萜基本骨架的环合酶和在基本骨架上进行6-，11-，16-，22-，23-， 24-，28-氧化的P450酶，但在2位发生α-羟化的酶(一种P450酶)还未挖掘。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备山楂酸和/或科罗索酸。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种具有羟化酶功能的蛋白质，其名称 为山楂酸/科罗索酸相关蛋白(MAA45)，MAA45是如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；

A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

其中，序列1由476个氨基酸残基组成。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序 列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL

上述A2)中的MAA45蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述A2)中的MAA45蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表 达得到。

上述A2)中的MAA45蛋白质的编码基因可通过将序列2的第795-2225位所示的 DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义 突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明还提供了与MAA45相关的生物材料，所述生物材料 为下述B1)至B10)中的任一种：

B1)编码MAA45的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因细胞系。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下1)或2)或3)所示的核酸分子：

1)编码序列是序列表中序列2的第795-2225位的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码MAA45的cDNA分 子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码MAA45的cDNA分子或基 因组DNA分子；

B2)所述表达盒可为序列表中序列2的第7-2450位所示的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分 子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列2的第1-6位与第2541-2546位均为SacII的识别序列，序列2的 第7-787位为PGK1启动子的序列，序列2的第788-794位为SexA的识别序列，序 列2的第795-2225位为MAA45基因的序列，编码序列1所示的MAA45，序列2的第 2226-2233位为AscI的识别序列，序列2的第2234-2540位为CYC1t终止子的序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码MAA45的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本 发明分离得到的MAA45的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码MAA45 且具有MAA45功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本 发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或 85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或 计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比 (％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂 交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗 膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条 件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，B2)所述的含有编码MAA45的核酸分子的表达盒(MAA45基因 表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达MAA45的DNA，该DNA不但可包括启动MAA45基 因转录的启动子，还可包括终止MAA45基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可 包括增强子序列。在本发明的一个实施例中，B2)所述表达盒具体为序列表中序列2 的第7-2540位所示的DNA分子。

可用现有的载体构建含有所述MAA45基因表达盒的重组载体。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体 可为pRS313或pRS314，或对pRS313或pRS314进行改造得到的载体。

B3)所述重组载体可含有序列2的第795-2225位所示的用于编码MAA45的DNA 序列。进一步所述重组载体具体可为pRS313-TRP-PGK1-MAA45-CYC1t或 pRS313-HIS-PGK1-MAA45-CYC1t。所述pRS313-HIS-PGK1-MAA45-CYC1t为在载体 pRS313的SacII的识别序列间插入序列2的第7-2540位所示的DNA片段，得到的 重组载体。所述pRS313-TRP-PGK1-MAA45-CYC1t为将所述 pRS313-HIS-PGK1-MAA45-CYC1t中序列3和序列4间的含有HIS的DNA片段替换为 载体pRS314中序列5和序列6间的含有TRP的DNA片段得到的重组载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，酵母可为酿酒 酵母Saccharomycescerevisiae，如酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeBY-OA 或酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeBY-OA-UA。

上述生物材料中，所述重组微生物可为将B1)所述核酸分子导入酿酒酵母 Saccharomycescerevisiae得到的表达MAA45的重组微生物，如将所述 pRS313-TRP-PGK1-MAA45-CYC1t导入酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeBY-OA或 酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeBY-UA得到的重组菌BY-OA-MAA45或重组菌 BY-OA-UA-MAA45。

上述生物材料中，所述转基因细胞系不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供了MAA45的制备方法，所述方法包括：培养 含有MAA45的编码基因的表达盒的重组微生物，使MAA45的编码基因表达，得到表达 MAA45的重组微生物培养物；从所述重组微生物培养物中得到所述蛋白质。

上述MAA45的制备方法中，所述MAA45的编码基因可为上述生物材料中B1)所述 核酸分子。

上述MAA45的制备方法中，所述含有MAA45的编码基因的表达盒可为上述生物材 料中B2)所述表达盒。

上述MAA45的制备方法中，所述重组微生物可为上述生物材料中所述重组微生物。

为解决上述技术问题，本发明还提供了山楂酸和/或科罗索酸的制备方法，所述方 法包括以齐墩果酸和/或乌索酸为底物用MAA45进行催化反应得到山楂酸和/或科罗索 酸。

为解决上述技术问题，本发明还提供了山楂酸和/或科罗索酸的制备方法，将该方 法命名为方法1，所述方法1包括：将含有MAA45的编码基因的表达盒导入能产生齐 墩果酸和/或乌索酸的受体生物细胞中，得到重组生物细胞；培养所述重组生物细胞， 使MAA45的编码基因表达，得到表达MAA45的细胞培养物；从所述表达MAA45的细胞 培养物中得到山楂酸和/或科罗索酸；所述受体生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非 人动物细胞。

上述方法1中，所述MAA45的编码基因可为所述生物材料中B1)所述核酸分子。

上述方法1中，所述含有MAA45的编码基因的表达盒可为所述生物材料中B2)所 述表达盒。

上述方法1中，所述受体生物细胞可为可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，酵母 可为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，如酿酒酵母Saccharomycescerevisiae BY-OA或所述酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeBY-UA。

在本发明的一个实施例中，所述重组生物细胞为将所述 pRS313-TRP-PGK1-MAA45-CYC1t导入所述酿酒酵母Saccharomycescerevisiae BY-OA或所述酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeBY-UA得到的重组菌 BY-OA-MAA45或重组菌BY-OA-UA-MAA45。

上述方法1中，所述方法还可包括除去所述含有山楂酸和/或科罗索酸的混合物中 的杂质得到山楂酸和/或科罗索酸。

为解决上述技术问题，本发明还提供了羟化酶制剂或三萜2位α-羟化酶制剂，所 述羟化酶制剂或所述三萜2位α-羟化酶制剂含有MAA45或所述生物材料。

所述羟化酶制剂或所述三萜2位α-羟化酶制剂可仅以MAA45或所述生物材料作为 其活性成分，还可以MAA45或所述生物材料与其他具有羟化酶或三萜2位α-羟化酶活 性的物质共同作为其活性成分。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：

X1、MAA45在作为羟化酶或三萜2位α-羟化酶中的应用；

X2、MAA45在制备羟化酶产品或三萜2位α-羟化酶产品中的应用；

X3、MAA45在生产山楂酸和/或科罗索酸中的应用；

X4、MAA45在降解齐墩果酸和/或乌索酸中的应用；

X5、所述生物材料在制备羟化酶或三萜2位α-羟化酶中的应用；

X6、所述生物材料在制备羟化酶产品或三萜2位α-羟化酶产品中的应用；

X7、所述生物材料在生产山楂酸和/或科罗索酸中的应用；

X8、所述生物材料在降解齐墩果酸和/或乌索酸中的应用；

X9、所述MAA45的制备方法在制备羟化酶或三萜2位α-羟化酶中的应用；

X10、所述MAA45的制备方法在制备羟化酶产品或三萜2位α-羟化酶产品中的应 用；

X11、所述山楂酸和/或科罗索酸的制备方法在降解齐墩果酸和/或乌索酸中的应用；

X12、所述羟化酶制剂或所述三萜2位α-羟化酶制剂在生产山楂酸和/或科罗索酸 中的应用；

X13、所述羟化酶制剂或所述三萜2位α-羟化酶制剂在降解齐墩果酸和/或乌索酸 中的应用。

本发明将从山楂中克隆得到的MAA45基因导入可产生齐墩果酸(OA)的酿酒酵母菌 后，重组菌可以产生山楂酸；将MAA45基因导入可产生齐墩果酸(OA)与乌索酸(UA)的 酿酒酵母菌中后，重组菌可以产生山楂酸和科罗索酸，而未导入该基因的菌株均不可 以产生山楂酸和科罗索酸，表明，MAA45可以以齐墩果酸为底物制备山楂酸，还可以 以乌索酸为底物制备科罗索酸。由于齐墩果酸(式4)与乌索酸(式5)均为三萜化合物， 齐墩果酸为β-香树脂(β-Amyrin)型，乌索酸为α-香树脂(α-Amyrin)型，与齐 墩果酸相比，山楂酸为仅在齐墩果酸2位发生α-羟化得到的产物，与乌索酸相比， 科罗索酸为仅在乌索酸2位发生α-羟化得到的产物，表明，MAA45为三萜2位α-羟 化酶。实验证明，可以利用MAA45及其编码基因制备山楂酸和科罗索酸，还可以利 用MAA45催化三萜2位α-羟化。

附图说明

图1为BY-OA-MAA45溶液的LC-MS分析结果。

图2为BY-OA-UA-MAA45溶液的LC-MS分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了 阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的pRS313(Sikorski,R.S.andHieter,P.1989,Genetics122 (1):19-27)，公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得。

下述实施例中的pRS314(Sikorski,R.S.andHieter,P.1989,Genetics122 (1):19-27)，公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得。

实施例1、MAA45可以用来制备山楂酸和科罗索酸

本发明提供了一种来自于山楂(CrataeguspinnatifidaBunge)蛋白质，其名 称为山楂酸/科罗索酸相关蛋白(MAA45)，MAA45可以催化三萜2位α-羟化，属于三 萜2位α-羟化酶，MAA45的氨基酸序列如序列表中序列1所示，可由序列2的第 795-2225位所示的MAA45基因编码。

1、重组载体的制备

利用限制性内切酶SacII，在载体pRS313的SacII的识别序列间插入序列2的第 7-2540位所示的DNA片段，保持载体pRS313的其他序列不变，得到重组载体，将该 重组载体命名为pRS313-HIS-PGK1-MAA45-CYC1t。

其中，序列2的第1-6位与第2541-2546位均为SacII的识别序列，序列2的 第7-787位为PGK1启动子的序列，序列2的第788-794位为SexA的识别序列，序 列2的第795-2225位为MAA45基因的序列，编码序列1所示的MAA45，序列2的第 2226-2233位为AscI的识别序列，序列2的第2234-2540位为CYC1t终止子的序列。

以pRS313-HIS-PGK1-MAA45-CYC1t为模板，利用引物对(V313-to-R： CTTTGCCTTCGTTTATCTTGC(序列3)；V313-to-F：TATATGTATACCTATGAATGTCAG(序列 4))进行PCR扩增，将得到的PCR产物命名为313-PGK1-MAA45-CYC1t。以载体pRS314 为模板，利用引物对(Bsp-TRP-F：TGGCGTCCGGAT4ACAATCTTGATCCGGAGCT(序列5)； Bsp-TRP-R：TGGCGTCCGGACACAAACAATACTTAAATAAATAC(序列6))进行PCR扩增，将 得到的PCR产物命名为TRP。将313-PGK1-MAA45-CYC1t与TRP进行平末端连接，得到 重组载体，将序列正确的重组载体命名为pRS313-TRP-PGK1-MAA45-CYC1t。与 pRS313-HIS-PGK1-MAA45-CYC1t相比，pRS313-TRP-PGK1-MAA45-CYC1t为仅将 pRS313-HIS-PGK1-MAA45-CYC1t中引物对(V313-to-R和V313-to-F)间的含有HIS的 DNA片段替换为载体pRS314中引物对(Bsp-TRP-F和Bsp-TRP-R)间的含有TRP的DNA 片段得到的重组载体。

以pRS313为模板，利用引物对(V313-to-R和V313-to-F)进行PCR扩增，将 得到的PCR产物命名为313。将313与上述TRP进行平末端连接，得到重组载体， 将序列正确的重组载体命名为pRS313-TRP。与pRS313相比，pRS313-TRP为仅将 pRS313中引物对(V313-to-R和V313-to-F)间的含有HIS的DNA片段替换为载体 pRS314中引物对(Bsp-TRP-F和Bsp-TRP-R)间的含有TRP的DNA片段得到的重组 载体。

2、重组菌的制备

将步骤1的pRS313-TRP-PGK1-MAA45-CYC1t导入出发菌酿酒酵母 SaccharomycescerevisiaeBY-OA(记载在中国专利ZL201310399947.X中)；以下 简称BY-OA，BY-OA可以产生齐墩果酸(OA)中，得到重组菌，将该重组菌命名为 BY-OA-MAA45；将步骤1的pRS313-TRP导入BY-OA中，得到重组菌，将该重组菌命 名为BY-OA-pRS313-TRP。

将步骤1的pRS313-TRP-PGK1-MAA45-CYC1t导入出发菌酿酒酵母 SaccharomycescerevisiaeBY-UA(以下简称BY-OA-UA，BY-OA-UA可以产生乌索 酸(UA))中，得到重组菌，将该重组菌命名为BY-OA-UA-MAA45；将步骤1的 pRS313-TRP导入BY-OA-UA中，得到重组菌，将该重组菌命名为 BY-OA-UA-pRS313-TRP。

其中，BY-OA-UA按照如下2.1-2.3制备：

2.1基因元件的质粒构建

(1)pM2-aAS质粒的构建

用SexA1和Asc1分别对p-aAS(公司合成，其序列为序列表中序列7)和质粒 pM2-tHMG1(记载在中国专利ZL201310399947.X中)进行双酶切；分别割胶纯化目 的基因aAS和载体片段pM2(约4kb)，并同时加入连接体系(各50ng)：2μl10XT4 ligationBuffer(NEB公司)、1μlT4ligase(NEB公司，400,000cohesiveend units/ml)，补充蒸馏水至20μl，室温反应2小时得到连接产物，转化，测序验证， 将得到的序列正确的载体命名为pM2-aAS。

(2)pM4-CYP15

用SexA1和Asc1分别对p-CYP15(公司合成，其序列为序列表中序列8)和质 粒pM11-AtCPR1(记载在中国专利ZL201310399947.X中)进行双酶切；分别割胶纯 化目的基因CYP15和载体片段pM4(约4kb)，并同时加入连接体系(各50ng)：2μl 10XT4ligationBuffer(NEB公司)、1μlT4ligase(NEB公司，400,000cohesive endunits/ml)，补充蒸馏水至20μl，室温反应2小时得到连接产物，转化，测序 验证，将得到的序列正确的载体命名为pM4-CYP15。

(3)pM3-ljCPR

用SexA1和Asc1分别对p-LjCPR(公司合成，其序列为序列表中序列9)和质粒 pM3-ERG9(记载在中国专利申请201210453416.X中)进行双酶切；分别割胶纯化 目的基因ljCPR和载体片段pM3(约4kb)，并同时加入连接体系(各50ng)：2μl10XT4 ligationBuffer(NEB公司)、1μlT4ligase(NEB公司，400,000cohesiveend units/ml)，补充蒸馏水至20μl，室温反应2小时得到连接产物，转化，测序验证， 将得到的序列正确的载体命名为pM3-ljCPR。

2.2BY-T3的构建

分别用引物表2描述的PCR模板(pTrp-HIS、pEHIS-ERG20、pM11-ERG1和 pM3-ERG9均记载在中国专利申请201210453416.X中)和引物进行PCR获得功能模 块：M1(Trp-HIS-up)，M2(P_PGK1-ERG20-T_ADH1)，M3(P_TDH3-ERG1-T_TPI1)，M4(P_TEF1-ERG9-T_CYC1)， M5(Trp-down)。扩增体系为：NewEnglandBiolabsPhusion5Xbuffer10μl、 dNTP(10mMeachdNTP)1μl、DNA模板20ng、引物(10uM)各1μl、Phusion High-FidelityDNAPolymerase(2.5U/μl)0.5μl、补加蒸馏水至总体积50μl。 扩增条件为98℃预变性1.5分钟(1个循环)；98℃变性10秒、退火10秒(退 火温度58℃)、72℃延伸均用2分钟(32个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)， 产物经割胶回收保存。

引物表2

按照中国专利申请201210453416.X中实施例2中感受态细胞的制备方法， 制备得到BY-T1感受态细胞，然后向BY-T1感受态细胞中加入转化用片段：M1， M2，M3，M4和M5基因模块共5μg(摩尔比＝1:1:1:1:1)。筛选培养的培养基为： 0.8％(质量百分比浓度)酵母选择培养基SD-His，2％(质量百分比浓度)葡萄 糖，0.01％(质量百分比浓度)Trp，0.01％(质量百分比浓度)Ura，0.005％(质 量百分比浓度)Leu；筛选培养的条件为：30度，培养36h以上。PCR鉴定出序 列正确的阳性克隆，命名为菌株BY-T3。

2.3BY-UA的构建

分别用引物表3描述的PCR模板(prDNA-Leu2记载在中国专利申请 201210453416.X中)和引物进行PCR获得功能模块：M1′(prDNA-Leu2-up)， M2′(P_PGK1-aAS-T_ADH1)，M3′(P_TDH3-CYP15-T_TPI1)，M4′(P_TEF1-ljCPR-T_CYC1)，M5′ (prDNA-Leu2-down)。扩增体系为：NewEnglandBiolabsPhusion5Xbuffer10μl、 dNTP(10mMeachdNTP)1μl、DNA模板20ng、引物(10uM)各1μl、Phusion High-FidelityDNAPolymerase(2.5U/μl)0.5μl、补加蒸馏水至总体积50μl。 扩增条件为98℃预变性1.5分钟(1个循环)；98℃变性10秒、退火10秒(退 火温度58℃)、72℃延伸均用2分钟(32个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)， 产物经割胶回收保存。

引物表3

按照中国专利申请201210453416.X中实施例2中感受态细胞的制备方法， 制备得到BY-T3感受态细胞，然后向BY-T3感受态细胞中加入转化用片段：M1′， M2′，M3′，M4′和M5′基因模块共5μg(摩尔比＝1:1:1:1:1)。筛选培养的培 养基为：0.8％(质量百分比浓度)酵母选择培养基SD-Leu-His，2％(质量百分 比浓度)葡萄糖，0.01％(质量百分比浓度)Trp，0.01％(质量百分比浓度)Ura； 筛选培养的条件为：30度，培养36h以上。PCR鉴定出序列正确的阳性克隆，命 名为菌株BY-OA-UA。

3、山楂酸和科罗索酸的制备

3.1摇瓶发酵：

分别在固体选择培养基1(固体选择培养基1由溶质和溶剂组成，溶剂为水， 溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％ 葡萄糖，0.01％Trp.和琼脂粉)中活化BY-OA，然后分别接种于液体选择培养基1 (液体选择培养基1由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其质量百分比浓度分 别为：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄糖，0.01％Trp.)中于 30℃，250rpm培养16h制备种子液，将种子液以1％的接种量接种于含15ml液体选 择培养基1的100ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养6天，得到BY-OA发酵液。

分别在固体选择培养基2(固体选择培养基2由溶质和溶剂组成，溶剂为水， 溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％ 葡萄糖，0.01％Trp.，0.01％Ura.和琼脂粉)中活化BY-OA-UA，然后分别接种于液 体选择培养基2(液体选择培养基2由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其质 量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄糖， 0.01％Trp.和0.01％Ura.)中于30℃，250rpm培养16h制备种子液，将种子液以 1％的接种量接种于含15ml液体选择培养基2的100ml三角瓶中，30℃，250rpm振 荡培养6天，得到BY-OA-UA发酵液。

分别在固体选择培养基3(固体选择培养基3由溶质和溶剂组成，溶剂为水， 溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％ 葡萄糖和琼脂粉)中活化步骤2的BY-OA-MAA45和BY-OA-pRS313-TRP，然后分别 接种于液体选择培养基3(液体选择培养基3由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质 及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄 糖)中于30℃，250rpm培养16h制备种子液，将种子液以1％的接种量接种于含15ml 液体选择培养基3的100ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养6天，分别得到 BY-OA-MAA45发酵液和BY-OA-pRS313-TRP发酵液。

分别在固体选择培养基4(固体选择培养基4由溶质和溶剂组成，溶剂为水， 溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基SD-Trp-Leu-His，2％葡萄 糖和琼脂粉)中活化步骤2的BY-OA-UA-MAA45和BY-OA-UA-pRS313-TRP，然后分 别接种于液体选择培养基4(液体选择培养基4由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶 质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基SD-Trp-Leu-His，2％葡萄糖) 中于30℃，250rpm培养16h制备种子液，将种子液以1％的接种量接种于含15ml液 体选择培养基4的100ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养6天，分别得到 4BY-OA-UA-MAA45发酵液和BY-OA-UA-pRS313-TRP发酵液。

3.2化合物提取：

按照如下方法分别提取步骤3.1中的六种发酵液中的化合物：

取6mL步骤3.1的BY-OA-MAA45发酵液于破碎管中，13000rpm离心1min，弃 上清液；沉淀用无菌水清洗后，13000rpm离心1min，弃上清液；向沉淀中加入玻璃 珠(直径0.5mm)和1ml萃取液(萃取液由甲醇和丙酮组成，甲醇与丙酮的体积比为 1:1)，震荡破碎5min，超声破碎30min，13000rpm离心2min，弃沉淀，将上清液 过0.22μm有机滤膜至液相瓶中得到溶液，将该溶液其命名为BY-OA-MAA45溶液。

按照上述方法，将BY-OA-MAA45发酵液替换为BY-OA-UA-MAA45发酵液，其他步 骤均不变，得到溶液，将其命名为BY-OA-UA-MAA45溶液。

按照上述方法，将BY-OA-MAA45发酵液分别替换为BY-OA发酵液、 BY-OA-pRS313-TRP发酵液、BY-OA-UA发酵液和BY-OA-UA-pRS313-TRP发酵液，其 他步骤均不变，分别得到BY-OA溶液、BY-OA-pRS313-TRP溶液、BY-OA-UA溶液和 BY-OA-UA-pRS313-TRP溶液。

3.3LC-MS定性分析：

按照如下方法分别对步骤3.2中的六种溶液进行LC-MS定性分析，标准品为山楂 酸(上海源叶生物科技有限公司)和科罗索酸(上海源叶生物科技有限公司)：

仪器：液相色谱-串联质谱(LC-MS)仪，由安捷伦1200高效液相色谱仪和 Bruker-micrOTOF-II质谱仪组成；MicroOTOFcontrolversion3.0/DataAnaysis Version4.0数据采集和处理系统。

LC条件：DAD检测器，检测波长203nm，WatersC18色谱柱(250mm×4.6 mm,5μm)，流动相A为0.1％乙酸铵，流动相B为乙腈，梯度洗脱，流速1mL/min，柱温 30℃。洗脱方式如下：

0～35min(包括35min)流动相A的体积百分比浓度为35％，流动相B的体积百分比 浓度为65％；

35～36min(包括36min)流动相B的体积百分比浓度为100％；

36～40min(包括40min)流动相B的体积百分比浓度为100％；

40～41min(包括41min)流动相A的体积百分比浓度为35％，流动相B的体积百分 比浓度为65％；

41～45min流动相A的体积百分比浓度为35％，流动相B的体积百分比浓度为65％。

MS条件：电喷雾电离源负离子模式(ESI^-)，喷雾电压(-4.5kV)，雾化气 流量(6L/min)，雾化器温度(180℃)，碰撞气为氮气，压力为1.0Bar，数 据采集频率1.0HZ：碰撞能量为8.0eV。

结果(图1)发现，BY-OA-MAA45溶液中含有山楂酸，BY-OA溶液和 BY-OA-pRS313-TRP溶液中均不含有山楂酸。图1中，A图为LC-MS结果， Standard+BY-OA为向BY-OA溶液中加入山楂酸和科罗索酸的LC-MS结果，BY-OA为 BY-OA溶液的LC-MS结果，BY-OA-MAA45为BY-OA-MAA45溶液的LC-MS结果，Maslinic acid表示山楂酸，Corosolicacid表示科罗索酸；B图为负离子模式下，样品 BY-OA-MAA45和阳性对照样品Standard+BY-OA同时出现相同的高分辨率山楂酸质谱离 子峰图。

结果(图2)发现，BY-OA-UA-MAA45溶液中含有山楂酸和科罗索酸，BY-OA-UA 溶液和BY-OA-UA-pRS313-TRP溶液中均不含有山楂酸和科罗索酸。图2中，A图为 LC-MS结果，Standard+BY-OA-UA为向BY-OA-UA溶液中加入山楂酸和科罗索酸的 LC-MS结果，BY-OA-UA为BY-OA-UA溶液的LC-MS结果，BY-OA-UA-MAA45为 BY-OA-UA-MAA45溶液的LC-MS结果，Maslinicacid表示山楂酸，Corosolicacid 表示科罗索酸；B图为负离子模式下，样品BY-OA-UA-MAA45和阳性对照样品 Standard+BY-OA-UA同时出现相同的高分辨率科罗索酸质谱离子峰图。

表明，将从山楂中克隆得到的MAA45基因导入可产生齐墩果酸(OA)的酿酒酵母菌 BY-OA后，重组菌可以产生山楂酸；将MAA45基因导入可产生齐墩果酸(OA)与乌索酸 (UA)的酿酒酵母菌BY-OA-UA中后，重组菌可以产生山楂酸和科罗索酸，而未导入该基 因的BY-OA和BY-OA-UA均不可以产生山楂酸和科罗索酸，表明，MAA45可以以齐墩果 酸为底物制备山楂酸，还可以以乌索酸为底物制备科罗索酸。由于齐墩果酸(式4)与 乌索酸(式5)均为三萜化合物，齐墩果酸为β-香树脂(β-Amyrin)型，乌索酸为 α-香树脂(α-Amyrin)型，与齐墩果酸相比，山楂酸为仅在齐墩果酸2位发生α- 羟化得到的产物，与乌索酸相比，科罗索酸为仅在乌索酸2位发生α-羟化得到的产 物，表明，MAA45为三萜2位α-羟化酶。