一种斑点叉尾鮰致病性鲁氏耶尔森氏菌的保藏方法

摘要

本发明涉及一种斑点叉尾鮰致病性鲁氏耶尔森氏菌的保藏方法，所述保藏方法如下：1) 培养基准备：脑心浸出液琼脂培养基倒平板，将适量无菌磁性有序介孔介质均匀分布于平板上备用；2）鲁氏耶尔森氏菌的诱导培养：将鲁氏耶尔森氏菌接种于步骤1）的脑心浸出液琼脂培养基平板上，于25~28℃恒温培养12?36h；2) 鲁氏耶尔森氏菌的保藏：挑取适量上述培养结束的培养基连同无菌磁性有序介孔介质放入无菌具塞塑料离心管中，加入适量无菌蒸馏水和pH5.5?5.8的葡萄糖琼脂培养基于无菌具塞塑料离心管中，置于0?4℃恒温冰箱保藏。本发明的方法鲁氏耶尔森氏菌保藏18个月仍生长正常，而且形态特征未发生明显改变，与传代培养保藏法相比保藏期更长，与冷冻干燥保藏法相比，操作更简易，可靠性更高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种斑点叉尾鮰致病性鲁氏耶尔森氏菌的保藏方法。

背景技术

鲁氏耶尔森氏菌(Y.luCkelzEwingRoSSBrennerandfanning1978)为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)耶尔森氏菌属(YelsznzavanLoghem1944)能引起水产养殖动物感染发病的病原细菌,鲁氏耶尔森氏菌对斑点叉尾鮰的高密度养殖危害巨大，已经引起水产养殖研究者高度重视，开展鲁氏耶尔森氏菌高效保藏方法的研究对从事水产动物鲁氏耶尔森氏菌病原学与防治学的科学研究具有重要的意义。然而，从现有的文献资料来看，菌种的保藏大多是采用传代培养保藏法、冷冻干燥保藏法等一些常规的微生物保藏方法，而专门针对鲁氏耶尔森氏菌保藏的简易高效方法极其匮乏。本发明专门针对鲁氏耶尔森氏菌保藏建立了一种简易高效的方法，旨在提高其在保藏期间的存活率并延长保藏时间。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种斑点叉尾鮰致病性鲁氏耶尔森氏菌的保藏方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种斑点叉尾鮰致病性鲁氏耶尔森氏菌的保藏方法，所述保藏方法如下：

1)培养基准备：脑心浸出液琼脂培养基倒平板，将适量无菌磁性有序介孔介质均匀分布于平板上备用；

2）鲁氏耶尔森氏菌的诱导培养：将鲁氏耶尔森氏菌接种于步骤1）的脑心浸出液琼脂培养基平板上，于25~28℃恒温培养12-36h；

3)鲁氏耶尔森氏菌的保藏：挑取适量上述培养结束的培养基连同无菌磁性有序介孔介质放入无菌具塞塑料离心管中，加入适量无菌蒸馏水和pH5.5-5.8的葡萄糖琼脂培养基于无菌具塞塑料离心管中，置于0-4℃恒温冰箱保藏。

优选的，所述磁性有序介孔介质为磁性有序介孔炭或磁性有序介孔铁酸镍。

更优选的，所述磁性有序介孔介质为磁性有序介孔铁酸镍，其制备方法如下：

1）将Ni(NO₃)₂·6H₂O和Fe(NO₃)₃·9H₂O溶解于甲醇中，将适量多孔硅KIT-6放入盛有正己烷的聚四氟乙烯容器中，充分搅拌；

2）将溶液1）的原料逐滴加入步骤2）中，所形成的混合溶液充分搅拌，于50-60℃加热8-12h；

3）步骤2)所得固体于250-280℃下灼烧4-5h；

4）将步骤3）所得固体冷却至室温，经研磨后转移至盛有NaOH溶液的圆底烧瓶内，于40-50℃水浴条件下回流搅拌24-36h后离心回收；

5）将步骤4）所得固体分别用乙醇和去离子水反复清洗至中性后，经真空干燥即可。

本发明所采用的磁性有序介孔铁酸镍具备巨大的比表面积和丰富的三维孔隙结构，高比表面积有利于鲁氏耶尔森氏菌吸附储存；规整有序的开放性孔道、尺寸可调的孔径为鲁氏耶尔森氏菌提供了培养基的输送路径，有利于延长鲁氏耶尔森氏菌的保藏时间。

本发明的有益效果：经测定表明，0-4℃恒温冰箱保藏的无菌具塞塑料离心管中的斑点叉尾鮰致病性鲁氏耶尔森氏菌保藏18个月仍生长正常，而且形态特征未发生明显改变。本发明与传代培养保藏法相比保藏期更长，与冷冻干燥保藏法相比，操作更简易，可靠性更高。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

实施例1：

一种斑点叉尾鮰致病性鲁氏耶尔森氏菌的保藏方法，所述保藏方法如下：

1)培养基准备：脑心浸出液琼脂培养基倒平板，将适量磁性有序介孔炭均匀分布于平板上备用；

2）鲁氏耶尔森氏菌的诱导培养：将鲁氏耶尔森氏菌接种于步骤1）的脑心浸出液琼脂培养基平板上，于25℃恒温培养36h；

2)鲁氏耶尔森氏菌的保藏：挑取适量上述培养结束的培养基连同无菌磁性有序介孔介质放入无菌具塞塑料离心管中，加入适量无菌蒸馏水和pH5.5的葡萄糖琼脂培养基于无菌具塞塑料离心管中，置于0-4℃恒温冰箱保藏。

实施例2：

一种斑点叉尾鮰致病性鲁氏耶尔森氏菌的保藏方法，所述保藏方法如下：

1)培养基准备：脑心浸出液琼脂培养基倒平板，将适量磁性有序介孔铁酸镍均匀分布于平板上备用；

2）鲁氏耶尔森氏菌的诱导培养：将鲁氏耶尔森氏菌接种于步骤1）的脑心浸出液琼脂培养基平板上，于28℃恒温培养12h；

2)鲁氏耶尔森氏菌的保藏：挑取适量上述培养结束的培养基连同无菌磁性有序介孔介质放入无菌具塞塑料离心管中，加入适量无菌蒸馏水和pH5.8的葡萄糖琼脂培养基于无菌具塞塑料离心管中，置于0-4℃恒温冰箱保藏；

所述磁性有序介孔铁酸镍的制备方法如下：

1）将Ni(NO₃)₂·6H₂O和Fe(NO₃)₃·9H₂O溶解于甲醇中，将适量多孔硅KIT-6放入盛有正己烷的聚四氟乙烯容器中，充分搅拌；

2）将溶液1）的原料逐滴加入步骤2）中，所形成的混合溶液充分搅拌，于60℃加热8h；

3）步骤2)所得固体280℃下灼烧4h；

4）将步骤3）所得固体冷却至室温，经研磨后转移至盛有NaOH溶液的圆底烧瓶内，于50℃水浴条件下回流搅拌36h后离心回收；

5）将步骤4）所得固体分别用乙醇和去离子水反复清洗至中性后，经真空干燥即可。

实施例1和2保藏的鲁氏耶尔森氏菌各10组，其保藏效果评价如下：

每2个月从实施例1和2保藏的鲁氏耶尔森氏菌中分别随机取出一个无菌具塞塑料离心管，无菌操作用镊子从4℃恒温冰箱保藏的无菌具塞塑料离心管中取出适量菌种，接种于脑心浸出液琼脂培养基平板上，于25℃恒温培养，连续5天观察菌的生长情况及其形态，实验结果如下：

实验结果表明，0-4℃恒温冰箱保藏的无菌具塞塑料离心管中的鲁氏耶尔森氏菌保藏18个月仍生长正常，而且形态特征未发生明显改变，说明本实验的保藏方法可以有效保藏期至少18个月。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。