液质联用检测血浆中表儿茶素及表儿茶巯代物含量的方法

摘要

本发明公开了一种液质联用法检测血浆中表儿茶素及表儿茶巯代物含量的方法，包括如下步骤：(1)含药血浆样品制备；(2)工作曲线样品的制备；(3)LC测定条件；(4)MS/MS条件：(5)采用内标法定量，以系列表儿茶素及表儿茶素巯代物在空白血浆的药物浓度为横坐标，表儿茶素及表儿茶素巯代物与内标物普萘洛尔的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，权重系数为1/x2，求得的直线回归方程，即为工作曲线，使用工作曲线,将含药血浆样品中的表儿茶素及表儿茶素巯代物的药物浓度计算出来。本发明的方法快速、专属、准确、灵敏度高。

说明书

技术领域

本发明属于医药检测技术领域，涉及一种检测血浆中表儿茶素及表儿茶巯代物含量的方 法。

背景技术

缩合鞣质具有抗氧化、抗病原微生物、抗炎、降血压、调血脂、降血糖等多方面的药理 活性，近10年来研究发现缩合鞣质在抗肿瘤、抗HIV、抗风湿等方面有很好的应用前景，金 荞麦缩合鞣质制成的威麦宁已在临床用作抗肿瘤药，乌药茎中寡聚缩合鞣质是抗HIV-1整 合酶的主要活性成分，也是其抗炎、抗风湿活性的主要物质基础。缩合鞣质有效成分缩合 单宁类化合物，其在血浆中不易被检测，目前尚无一种准确精密的方法来测定血浆中的缩和 单宁类化合物的含量。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种液质联用检测血浆中表儿茶素及表儿 茶巯代物含量的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种液质联用法检测血浆中表儿茶素及表儿茶巯代物含量的方法，包括如下步骤：

(1)含药血浆样品制备

取服用含有缩合鞣质药物后的动物血浆50μL，加入10μL甲醇、20μL100ng/mL普萘 洛尔溶液、50μL50mg/mL盐酸巯乙胺溶液，涡流混匀后，60℃水浴20min，再加入50μL甲 醇，涡流混匀后，离心，取上清50μL加入50μL体积浓度为50％的甲醇水溶液,供LC/MS/MS 测定；所述普萘洛尔溶液的溶剂为体积浓度为50％的乙腈-甲醇溶液；所述盐酸巯乙胺溶液的 溶剂为浓盐酸和甲醇按体积比为1：9配制而成。

(2)工作曲线样品的制备

①标准系列溶液的配制取表儿茶素和表儿茶素巯代物的标准品储备液母液，用甲醇配 置成表儿茶素和表儿茶素巯代物的浓度均为1mg/mL的储备液，再用甲醇分别稀释，得到儿 茶素和表儿茶素巯代物的浓度均为50、100、250、500、1000、2500，5000和10000ng/mL；

②取8份空白血浆50μL，分别加入步骤①配得的各个表儿茶素和表儿茶素巯代物的甲 醇溶液10μL，配制成相当于表儿茶素和表儿茶素巯代物在血浆中的浓度为10、20、50、100、 200、500，1000和2000ng/mL的样品，再分别加入20μL100ng/mL普萘洛尔溶液、50μL 50mg/mL盐酸巯乙胺溶液，涡流混匀后，60℃水浴20min，再加入50μL甲醇，涡流混匀后， 离心，取上清50μL加入50μL体积浓度为50％的甲醇水溶液,供LC/MS/MS测定；所述普萘 洛尔溶液的溶剂为体积浓度为50％的乙腈-甲醇溶液；所述盐酸巯乙胺溶液的溶剂为浓盐酸和 甲醇按体积比为1：9配制而成。

(3)LC测定条件

液相色谱柱：WatersBEHShieldRP18柱，2.1mm×100mm，1.7um

流动相：A：体积浓度0.1％的甲酸水溶液，B：体积浓度0.1％的甲酸乙腈溶液，梯度如下：

0-1分钟，流动相A从95％到90％，流动相B从5％到10％；

1-4.8分钟，流动相A从90％到84％，流动相B从10％到16％；

4.8-6.3分钟，流动相A从84％到60％，流动相B从16％到40％；

6.3-6.5分钟，流动相A从60％到5％，流动相B从40％到95％；

6.5-7.5分钟，流动相A保持5％，流动相B保持95％

7.5-7.51分钟，流动相A从5％到95％，流动相B从95％到5％；

7.51-10.0分钟，流动相A保持95％，流动相B保持5％.

流速：0.3mL/min；

柱温：35℃；

进样量：5μL。

(4)MS/MS条件：

离子源：电喷雾离子源；

毛细管电压：-3.2KV；

离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：350℃；

脱溶剂气流速：800L/Hr；

锥孔气流速：50L/Hr；

检测方式：正离子；

扫描方式：多重反应监测(MRM)；

定量离子对：表儿茶素：m/z291.15→139；表儿茶素巯代物：m/z366.25→289.15；内标 普萘洛尔：m/z260.15→116.19

(5)采用内标法定量，以系列表儿茶素及表儿茶素巯代物在空白血浆的药物浓度为横坐标，表 儿茶素及表儿茶素巯代物与内标物普萘洛尔的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行 回归运算，权重系数为1/x²，求得的直线回归方程，即为工作曲线，使用工作曲线,将含药血 浆样品中的表儿茶素及表儿茶素巯代物的药物浓度计算出来。

优点：

本发明通过硫解的方法得到主要成分表儿茶素的巯代物，然后测定血浆样品中表儿茶素 及表儿茶素巯代物浓度的液相色谱-质谱联用的分析方法，具有快速、专属、准确、灵敏度高 的特点。

附图说明

图1为特异性色谱图。

图2为定量限10ng/mL色谱图。

图3为标准曲线200ng/mL色谱图。

图4为比格犬口服威麦宁胶囊后表儿茶素、表儿茶素巯代物2小时后的血浆样品色谱图。

图5a为比格犬口服威麦宁胶囊后表儿茶素及表儿茶素巯代物血药浓度-时间曲线。

图5b为比格犬口服威麦宁胶囊后总表儿茶素(表儿茶素及表儿茶素巯代物中表儿茶素的 总和)的药物浓度-时间曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例并结合附图对本发明做进一步阐述，但不限制本发明。

实施例1检测方法的确定

1.1实验仪器和试剂

仪器：

液相色谱仪为WatersACQUITYUPLC(Waters公司)，配有BinarySolventManager， Column，PDA检测器；色谱柱：WatersBEHShieldRP18(2.1×100mm，1.7mm)；

质谱仪为QuattroPremierXE(Waters)，配有电喷雾电离离子源(ESI)和大气压化 学电离源(APCI)，MasslynxV4.1工作站，UltraSonicCleanerUSKType超声波清洗器；

FA604A电子天平(上海科天电子仪器有限公司)；

涡旋混合仪XW-80A(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)

TGL-16G高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)

移液枪(BIOHTPROLINE)20-200μl；10-1000μl

试剂：

表儿茶素，购于上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98％，批号：YA0402SC13；

表儿茶素巯代物，由中国中药公司提供，原纯度≥98％，现在HPLC纯度为93％；

盐酸普萘洛尔：美国SigmaAldrich公司，纯度≥99％，批号：16524AH；

威麦宁胶囊，由中国中药公司提供，批号130401；

盐酸巯乙胺：美国SigmaAldrich公司，纯度≥98％，批号MKBQ8406V；

甲醇、乙腈和甲酸为色谱纯，其它试剂为分析纯；

屈臣氏蒸馏水；

试剂配制：

标准品储备液母液的配制精密称取表儿茶素和表儿茶素巯代物各2mg，用1mL甲醇溶 解配成2mg/mL标准品储备液母液。

威麦宁溶液的配制精密称取威麦宁提取物100mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解， 并稀释至刻度，配制成10mg/mL的威麦宁溶液，现配现用。

标准系列溶液的配制取标准品储备液母液适量，用甲醇稀释，得到儿茶素和表儿茶素 巯代物的浓度均为50、100、250、500、1000、2500，5000和10000ng/mL。

内标的配制精密称取10mg普萘洛尔(propranolol)标准品，置10mL容量瓶中，加乙 腈-甲醇(50:50，v/v)溶解，并稀释至刻度，配制成1.0mg/mL的储备液，取适量普萘洛尔 储备液，用乙腈-甲醇(50:50，v/v)稀释至浓度为100ng/mL。

盐酸巯乙胺试剂的配制精密称取100mg的盐酸巯乙胺，加入200mL浓盐酸和1.8mL 甲醇充分溶解，配成50mg/mL溶液，现配现用。

实验动物：Beagle犬，体重9-10kg，购自北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司。选 取健康Beagle犬8只，体重(9±1.0)kg，实验前1天禁食12h以上，不禁水，给药4h后 统一进食。

1.2含药血浆样品制备(血浆样品分析方法)

取服用含有缩合鞣质药物(本实施例是以威麦宁胶囊为例)后的比格犬血浆50μL置1.5 mL塑料EP管中，分别加入10μL甲醇、20μL内标溶液、50μL盐酸巯乙胺溶液，涡流混 匀后，60℃水浴20min，待反应结束后，再加入50μL甲醇，涡流混匀后，离心10min(15000 rpm，4℃)，取上清50μL并用50μL甲醇-水(50:50，v/v)稀释后进样5μL进行LC/MS/MS 按如下条件进行分析；

1.2.1液相条件

色谱柱：WatersBEHShieldRP18柱(2.1×100mm，1.7μm)；流动相：A：水(含0.1％甲酸， v/v)，B：乙腈(含0.1％甲酸，v/v)梯度洗脱，洗脱条件见表1；流速：0.3mL/min；柱温：35℃； 进样量：5μL。

表1液相梯度洗脱程序

1.2.2质谱条件

离子源：电喷雾离子源；毛细管电压：-3.2KV；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流速：800L/Hr；锥孔气流速：50L/Hr；正离子方式检测；扫描方式为多重反 应监测(MRM)；表儿茶素、表儿茶素巯代物和内标普萘洛尔的锥孔电压(Cone)分别为： 22V、15V和35V；碰撞能量(Collision)分别为：16V、10V和18V；用于定量分析的 离子反应分别为m/z291.15→139(表儿茶素)、m/z366.25→289.15(表儿茶素巯代物)和 m/z260.15→116.19(内标：普萘洛尔)。

实施例2方法学验证实验

方法的专属性，线性和相关系数

方法的专属性分别取6只比格犬的空白血浆50μL，按“血浆样品分析方法”项下操作， 进样5μL，得特异性色谱图1；将一定浓度的表儿茶素标准溶液、表儿茶素巯代物标准溶液 和内标普萘洛尔溶液加入空白血浆中，依同法操作，得定量限10ng/mL色谱图，见图2，图 3(为标准曲线200ng/mL色谱图)；取受试犬给药后收集的血浆样品，依同法操作，得相应 色谱图4(见图4)。结果表明，空白血浆中的内源性物质不干扰表儿茶素、表儿茶素巯代 物和内标普萘洛尔的测定。

工作曲线的样品制备

①标准系列溶液的配制取表儿茶素和表儿茶素巯代物的标准品储备液母液，用甲醇配 置成儿茶素和表儿茶素巯代物的浓度均为1mg/mL的储备液，再用甲醇分别稀释，得到儿茶 素和表儿茶素巯代物的浓度均为50、100、250、500、1000、2500，5000和10000ng/mL；

②取8份空白血浆50μL，分别加入步骤①配得的各个表儿茶素和表儿茶素巯代物的甲 醇溶液10μL，配制成相当于表儿茶素和表儿茶素巯代物在血浆中的浓度为10、20、50、100、 200、500，1000和2000ng/mL的样品，再分别加入20μL100ng/mL普萘洛尔溶液、50μL 50mg/mL盐酸巯乙胺溶液，涡流混匀后，60℃水浴20min，再加入50μL甲醇，涡流混匀后， 在15000rpm，4℃条件下离心10min，取上清50μL加入50μL体积浓度为50％的甲醇水溶 液,供LC/MS/MS测定；

所述普萘洛尔溶液的溶剂为体积浓度为50％的乙腈-甲醇溶液；所述盐酸巯乙胺溶液的溶 剂为200uL浓盐酸和1.8mL甲醇配制而成；

取5μL进样，进行LC/MS/MS分析，记录色谱图；以系列表儿茶素及表儿茶素巯代物在 空白血浆的药物浓度为横坐标，表儿茶素及表儿茶素巯代物与内标物普萘洛尔的峰面积比值 为纵坐标，用加权(W＝1/x²)最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为工作曲 线。

血浆样品中表儿茶素典型工作曲线为y＝0.00265x-0.00621，线性范围为10-2000ng/mL。 相关系数R2＝0.990。血浆样品中表儿茶素巯代物典型工作曲线为y＝0.00179x+0.00341，线性 范围为10-2000ng/mL。相关系数R2＝0.997。满足定量检测要求。

线性范围根据标准曲线，血浆中表儿茶素和表儿茶素巯代物的线性范围均为10～2000 ng/mL，定量下限为10ng/mL。

方法的准确度，精密度

准确度与精密度实验，按“工作曲线的制备”项下操作，制备表儿茶素和表儿茶素巯代 物低、中、高三个浓度的质量控制(QC)样品，每个浓度进行6样本分析，连续测定三天， 根据当日的工作曲线，计算QC样品的测得浓度，根据QC样品结果计算本法的准确度与精 密度，结果见表2和表3。

表2血浆样品中表儿茶素LC/MS/MS测定方法准确度与精密度实验结果

表3血浆样品中表儿茶素巯代物LC/MS/MS测定方法准确度与精密度实验结果

从表2，表3可以看出LC/MS/MS测定血浆样品中表儿茶素及表儿茶素巯代物浓度的方法日 内相对标准偏差分别在3.62-6.95％和3.43-10.32％之间，日间相对标准偏差分别在 12.13-14.82％和2.53-3.64％之间，满足比格犬体内分析的要求。说明方法的准确度和精密度 较好，充分验证所建立方法的可操作性。

方法回收率及基质效应

方法回收率及基质效应实验，取空白血浆50μL，按“工作曲线的制备”项下操作，制备 低、中、高三个浓度的QC样品，每个浓度3样本，进行LC-MS/MS分析，得到峰面积A。 另取空白血浆50μL，加入50μL盐酸巯乙胺溶液，涡流混匀后，60℃水浴20min，待反应结 束后，离心10min(15000rpm，4℃)，取上清50μL加入表儿茶素和表儿茶素硫代物的混 合标准溶液5μL、内标溶液10μL和65μL甲醇-水(50:50，v/v)，配制成相应浓度，涡流 混合，取5μL进行LC/MS/MS分析，获得相应峰面积B。再另取50μL超纯水，加入10μL 标准溶液、20μL内标和50μL盐酸巯乙胺溶液，涡流混匀后，制备低、中、高三个浓度的无 血浆基质样品，取5μL进行LC/MS/MS分析，获得相应峰面积C。以峰面积A与峰面B进行 比较来评价表儿茶素、表儿茶素巯代物与内标回收率，计算公式为R＝A/B×100％；以峰面 积B与峰面C进行比较来评价表儿茶素、表儿茶素巯代物与内标基质效应，计算公式为M＝B/C ×100％，结果见表4和5。

表4表儿茶素、表儿茶素巯代物和内标提取回收率

表5表儿茶素、表儿茶素巯代物和内标基质效应

从表4以看出，表儿茶素低、中、高三个浓度的提取回收率分别为97.5±6.6％，94.4±8.3％， 89.5±6.7％，表儿茶素硫代物低、中、高三个浓度的提取回收率分别为83.8±7.3％，82.5±4.4％， 88.5±2.4％，都满足体内分析的要求。由表5知表儿茶素、表儿茶素巯代物和内标基质效应比 值均大于87.4％，表明选定的质谱和色谱条件有效地避免了基质效应，满足体内分析的要求， 充分验证所建立方法的可操作性。

实施例3实际样品的测定

血浆样品的采集

选取健康Beagle犬8只，体重(9±1.0)kg，实验前1天禁食12h以上，不禁水，给药4h 后统一进食。双周期交叉给药，清洗期两周。威麦宁胶囊口服给药8粒(200mg/粒)。实验 前抽取空白血，给药后分别于0，10，20，30min，1，2，4，6，8，12，24，36，48，60， 72和84h共16个时间点取前肢静脉血1mL，置于含肝素的离心管中，冰浴中放置，4℃下 于0.5hr内3000rpm离心10min收集上层血浆，‐80℃冰冻保存待测。

实际血浆样品的测定

将上述所得的血浆样品按照“含药血浆样品制备”处理血浆样品，按照实施例1中的液 相条件和质谱条件进行液质分析，每个分析批(一天内测试的同种样品)制备一条工作曲线， 同时制备低、中、高三个浓度的QC样品，每浓度双样本，且QC样品数量不少于每个分析批 中样品总量的5％。根据每一分析批的工作曲线计算QC样品和未知样品的浓度。上述质控样 品中最多允许两个不同样品的浓度超出理论值的15％(低浓度点为20％)，否则此批数据不 被接受。所得结果见表6。

表6比格犬口服威麦宁胶囊后表儿茶素药物与表儿茶素巯代物的血药平均浓度(ng/mL)(n＝8)

给药后比格犬体内药物浓度与时间的变化曲线绘制

根据表6的数据，分别绘制出表儿茶素、表儿茶素巯代物以及总表儿茶素给药后比格犬 体内药物浓度与时间的变化曲线，具体见图5a，5b所示，从图中可以看出表儿茶素、表儿茶 素巯代物以及总表儿茶素在比格犬体内的药物浓度变化，因此可用于威麦宁胶囊口服给药后 药代动力学的研究。

上述的液质联用定量检测比格犬血浆中表儿茶素和表儿茶素巯代物的线性范围均为10～ 2000ng/mL，定量下限为10ng/mL，在10～2000ng/mL范围内线性关系良好。检查方法对 表儿茶素的回收率为89.5～97.5％，日内标准偏差为3.62～6.95％，日间标准偏差为 12.13-14.82％；检查方法对表儿茶素巯代物的回收率为82.5～88.5％，日内标准偏差为3.43～ 10.32％，日间标准偏差为2.53～3.64％，满足比格犬体内表儿茶素及表儿茶素巯代物药物浓 度检测分析的要求。

综上所述，本发明的液质联用定量检测血浆中表儿茶素及表儿茶素巯代物含量的分析方 法能灵敏、准确、可靠的检测血样中药物浓度。

以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应 视为本发明的保护范围。