分离的微生物菌株格氏乳杆菌MCC2 DSM 23882及其用途

摘要

本发明涉及新的微生物菌株格氏乳杆菌MCC2及其作为抗氧化剂蛋白水解成分用于产生食物产品和膳食补充剂中的用途。包含格氏乳杆菌MCC2的食物产品和膳食补充剂是低变应原性的，减少乳变态反应和伴随良性前列腺增生的下尿道的刺激症状和氧化应激以及与其相关的炎症。

说明书

本申请是申请日为2012年02月23日，申请号为201280020352.2，发明名称为“分离的微生物菌株植物乳杆菌(LACTOBACILLUSPLANTARUM)MCC1DSM23881和格氏乳杆菌(LACTOBACILLUSGASSERI)MCC2DSM23882及其用途”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于生物技术领域并将用于食品工业中。更准确地，本发明涉及微生物菌株植物乳杆菌(L.plantarum)MCC1和格氏乳杆菌(L.gasseri)MCC2及其在减少乳变态反应和伴随良性前列腺增生的下尿道的刺激症状和氧化应激以及与其相关的炎症中的用途。

背景技术

乳杆菌，已经被广泛用于制备健康食物产品很长时间了，例如作为起子培养物。最常见的方式是乳杆菌在功能性食品中的使用。功能性食品是这样的食物产品，其除了具有普通的饮食价值外，还具有有益影响生物的一些功能或降低疾病风险的额外天然组分。

在制备食物产品中已经较少使用这样的方法，其包括通过巴氏消毒在后续技术阶段杀死的目的性生物选择的活乳杆菌。这表示最终产品中不含活的乳酸细菌，但利用预处理、合适的技术方案和必要的添加剂添加剂，所产生的产品具有目的性的生物效应。

乳变态反应反应并缓解它

感染、炎症、变态反应和氧化应激相关的问题，例如食物变态反应、尿道症状(例如与前列腺疾病相关的排尿障碍)在经济上对社会的负担变得更重。例如，至多达4%的人口正遭受食物变态反应的痛苦，并且在美国，100-200例死亡直接由食物变态反应引起。食物变态反应(包括对牛乳的变态反应)对婴儿而言是尤其严重的问题。乳产品在婴儿中的使用对保证其正常生长和发育至关重要。食物变应原性问题的解决是非常复杂的，因为不可能产生完全没有变态反应但同时却具有非常高的良好生物品质的产品。UN、FAO和WHO中的最后讨论已经声明-无变应原：澄清的时候到了；陈述：没有实际的法规来声明不含所有变应原。因此：产生更多低变应原产品的任何技术思路/解决方案会被高度评价，所述低变应原产品会减少具有变应性应答的婴儿数量至少一些百分比。从结论/更长久观点上来看，变应性应答降低的每个百分比都非常重要，因为变态反应领域中降低食物产品变应原性的任何成功都具有显著的社会经济产出(包括在儿童和成人中改善生活质量和降低治疗成本)。

乳产品的变应原性通过蛋白质来测定，但是却难以产生一种所谓的主要过敏原(EncyclopediaofFoodSciencesandNutrition(EFSN)AP,2003,Wal,J.M.(2004)Bovinemilkallergenicity.Ann.AllergyAsthmaImmunol.,93,S2-11)。然而，酪蛋白和β-乳球蛋白引起同等比例的变态反应。牛乳的变态反应主要与α-酪蛋白和β-乳球蛋白相关(HostA.(2002).Frequencyofcow'smilkallergyinchildhood.AnnAllergyImmunol89(Suppl1):33-7;EFSN,2003。具有乳变态反应的许多儿童对α-酪蛋白有反应(HillD.J,FirerM.A,SheltonM.J等(1986)Manifestationofmilkallergyininfancy:clinicalandimmunologicfindings.JPediatr109:270-6;EFSN,2003,VandenplasY,BruetonM,DupontC,HillD,IsolauriE,KoletzkoS,OranjeAP,StaianoA.(2007)Guidelinesforthediagnosisandmanagementofcow'smilkproteinallergyininfants.ArchDisChild.92:902-908)。

酪蛋白由以下亚基组成：α-S1(主要变应原)、α-S2、β-和κ-酪蛋白，其中α-S1和β-酪蛋白是主要的。乳蛋白质的酶促水解降低了其变应原性。在乳蛋白质的部分水解过程中形成大的肽，更完全的水解产生大的肽和小的肽以及氨基酸的混合物。即使彻底的胃蛋白酶-胰蛋白酶水解也不产生无变态反应的结果，因为变态反应可能由可忽略量的天然蛋白质的免疫反应物组分引起。因此，仅基于彻底水解的方法已经创造了一些可能性，但不提供最终的解决方案，即使在乳清蛋白质的水解产物的情况下(BusincoL,CantaniA,LonghiMA,GiampietroPG.(1989)Anaphylacticreactionstoacow'smilkwheyproteinhydrolysate(Alfa-Ré,Nestlé)ininfantswithcow'smilkallergy.AnnAllergy.62(4):333-5.;SampsonHA,JamesMJ,Bernhisel-BroadbentJ.(1992)Safetyofanamino-derivedinfantformulainchildrenallergictocowmilk.Pediatrics.90,463-465)。因此，需要减少牛乳变态反应的新方法，因此利用给予产品额外价值的微生物菌株对引起变态反应的乳蛋白质进行定向水解是用于显著减少变态反应问题有希望的趋势。

先前已经描述了在乳酸细菌和添加剂添加剂的帮助下对乳蛋白质的水解。在专利EE03424(专利申请WO9700078,ValioOy)中，描述了鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)ATCC53103(LGG)菌株用于产生蛋白质水解产物制剂的用途，其中利用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解所述蛋白质。在NestecSA的若干发明中考虑了LGG用于降低变态反应风险的用途。在专利EP1296694中，描述了LGG用于降低儿童中特应性疾病风险的用途。在专利申请WO2008116907中，描述了双歧杆菌和LGG、鼠李糖乳杆菌CGMCC1.3724、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)ATCC55730和副干酪乳杆菌(L.paracasei)CNCMI-2116用于降低利用剖腹产出生的婴儿中变态反应风险的用途，包括利用部分(2-20%)水解的蛋白质。在NestecSA的专利申请WO03099037中，描述了乳酸细菌和含有乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)ATCC27536的食物产品的蛋白水解系统，其中用于减少食物变态反应，同时细菌可以是灭活的或死亡的。在专利EE04724(专利申请WO9929833,ArlaFoods)中，描述了副干酪乳杆菌副干酪亚种(L.paracaseisubsp.paracasei)的用途，包括用于缓解儿童中的特应性问题。在专利EP1175156(BiofermeOY)中，描述了巴氏消毒的含有微生物的谷物饮料。在专利请求CN101427782(MinZhao)中，描述了含有双歧杆菌的玉米饮料，其在发酵的帮助下产生并且其中所述细菌在发酵产品中是灭活的。在乳清蛋白质浓缩物(WPC)中，最高实现的β-乳球蛋白的水解已经是21%(M.Pescuma等(2007),HydrolysisofwheyproteinsbyL.acidophilus,StreptococcusthermophilusandL.delbrueckiissp.bulgaricusgrowninachemicallydefinedmedium,JournalofApplMicrobiol,103,5,1738-1746)。在欧洲专利EP1383394(NewZealandDairyBoard)中描述了为了获得具有良好味觉性质的产品，通过两种微生物对乳蛋白质进行水解(2-32%)，其中一种提出的微生物是巨型球菌(Macrococcus)、微球菌(Micrococcus)、肠道球菌(Entercoccus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、短杆菌(Brevibacterium)、节杆菌(Anthrobacter)或棒状杆菌(Corynebacterium)，优选溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)，以及其它微生物乳酸细菌乳球菌(Lactococcus)、乳杆菌、片球菌(Pediococcus)或明串珠菌(Leuconostoc)，并通过去除或杀死所述微生物来终止发酵。在日本专利申请JP7203844(MorinagaMilkIndustryCo)中，描述了在衍生自微生物枯草杆菌(Bacillussubtilis)的酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的帮助下对乳清的部分水解(30%)。

前列腺疾病及缓解它们

前列腺可引起若干疾病：尿路梗阻和刺激以及小骨盆区域中的疼痛或不适。前列腺疾病，尤其是与排尿相关的那些疾病非常常见并且降低了许多男人的生活质量。据估计，前列腺增生(良性前列腺增生-BPH)在约一半50岁的男人以及约70%超过70岁的男人中发生。伴随良性前列腺增生的下尿道症状(LUTS)包括使用国际前列腺症状评分(IPSS)评估的刺激和梗阻(排泄)症状。每种缓解男人尿困难的非药学可能性都将是有价值的，并且如果新的食物产品具有这种功效，则最好。

在几份专利申请中，已经描述了治疗组合物中的乳酸细菌用于治疗和缓解泌尿生殖感染(包括前列腺感染)的用途，然而所述组合物含有一种或若干种乳酸细菌(US2008274162,NessaJeffreyBryan等,2007)。

乳酸细菌的组合可用作膳食补充剂或药物组合物用于治疗和预防感染和炎症，包括尿道炎(EE04620,ActialFarmaceuticaLda,2000)，在所述乳酸细菌的组合中一种组分含有卷曲乳杆菌(L.crispatus)、唾液乳杆菌(L.salivarius)和干酪乳杆菌(L.casei)，而其他组分含有短乳杆菌(L.brevis)、格氏乳杆菌和发酵乳杆菌。乳酸细菌嗜粪乳杆菌(L.coprophilus)PL9001(KCCM-10245)已经用于预防和治疗泌尿生殖感染(KR20040067161,PLBIOCoLtd.,2003)。在泌尿学中用于局部治疗的药物组合物可含有乳酸细菌干酪乳杆菌、格氏乳杆菌作为活性物质(EP353581,SilvanaTosi等,1993)。

这显示，乳变态反应和前列腺疾病缓解，包括利用部分水解和乳酸细菌的帮助已经被研究了很长时间。

尽管如此，市场上没有足够量的减少乳变态反应和前列腺疾病的食物产品和膳食补充剂可用。因此，需要生产和使用可靠的经过测试证明的具有健康性质的食物产品和膳食补充剂。

发明内容

本发明涉及新的分离的抗氧化剂微生物菌株植物乳杆菌MCC1DSM23881和格氏乳杆菌MCC2DSM23882、含有一种或两种菌株的组合物、所提及的微生物作为抗氧化剂蛋白水解成分用于产生食物产品和膳食补充剂的用途、微生物用于产生减少乳变态反应和伴随良性前列腺增生的下尿道的刺激症状和氧化应激以及与其相关的炎症的食物产品和膳食补充剂中的用途，和用于产生减少上述疾病的食物产品和膳食补充剂的方法。

通过逐步生物选择来发现部分水解乳蛋白质的乳酸细菌(其为本发明的目标)。目标是发现具有多价生物潜能的菌株，所述菌株的多价性允许有益的生物效应(更多低变应原的、更少变应性应答、炎症和氧化应激减少效应)的协同使用，以获得具有预期性质的食物产品。本发明的实现思想(approachideology)不是实现蛋白质的完全水解。已经尝试了完全水解，但产生了新的问题，包括产品非常严重的器官感觉不愉快。选择具有所需技术程序的多生物潜能的菌株的使用和适当的健康的额外粗产品的使用作为本发明的思想。植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2是多生物潜能的并且具有协同效应-它们能够有目地(部分)水解乳蛋白质(酪蛋白)，它们具有显著的氧化抗性，它们产生共轭亚油酸、NO和其他组分。因此，本发明在生物技术整体解决方案的帮助下使其可能产生具有减少乳变态反应和尿道疾病的潜能的食物产品。

植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2的描述

在儿童微生物区系的Estonian-Swedish比较研究过程中从健康儿童的粪便中分离本发明的目标，植物乳杆菌MCC1DSM23881和格氏乳杆菌MCC2DSM23882。通过平板接种1岁儿童粪便的连续稀释物(在具有0.04%巯基乙酸(thioglycolicacid)pH7.2的磷酸盐缓冲液中10^-2-10^-7)来分离菌株植物乳杆菌MCC1和菌株格氏乳杆菌MCC2。将稀释物涂平板到新鲜制备的MRS琼脂培养基(Oxoid,UK)上并在37℃微好氧环境中进行培养。基于乳杆菌亚种特征性的菌落和细胞形态来分离作为本发明目标的菌株。这之后是下文描述的暂时的并且此后更为精确的鉴定。

植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2在2010年8月5日分别以号DSM23881和DSM23882保藏在德意志微生物保藏中心(德国)(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH；地址：德国布伦瑞克市因霍芬街7B，38124)的培养物保藏中。

培养物-形态学特征

在MRS琼脂和液体(Oxoid)培养基中培养后确定培养物-形态学特征。

为了培养植物乳杆菌MCC1，MRS培养液在微好氧环境中24-48小时是合适的，此后在所述培养液中看到均一的混浊生长。在37℃微好氧环境中MRS琼脂培养基上培养48小时后，植物乳杆菌MCC1的菌落具有2-2.5mm的直径，白色，凸状，有光泽并具有规则的边缘。细胞在具有部分平行位置的链中呈短棒状。最适生长温度是37℃；所述菌株还在15℃和45℃下繁殖。最适生长环境的pH是6.5。植物乳杆菌MCC1是过氧化氢酶和氧化酶阴性的，兼性异型发酵的，在葡萄糖发酵过程中不水解精氨酸或产生气体。

基于API50CHL系统(bioMérieux,France)测试试剂盒将植物乳杆菌MCC1鉴定为植物乳杆菌(与模式株一致：极好的,ID%-99.9,T指数0.83)。

基于16SrRNA序列对植物乳杆菌MCC1进行的分子鉴定显示了与模式株植物乳杆菌Lp-01的同源性(BLASThttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/sequence-analysis/)。基于APICHL50，植物乳杆菌MCC1的碳水化合物发酵概况如下。该菌株发酵下列：核糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙酰-葡糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七叶苷、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖(trechalose)、松三糖(melecitose)、D-棉子糖、L-阿拉伯糖、甲基-αD-吡喃甘露糖苷、D-松二糖、蜜二糖、山梨糖醇和甘露醇。

根据APIZYM(bioMérieux,France)测试试剂盒，植物乳杆菌MCC1已经获得了亮氨酸芳基酰胺酶、缬氨酸芳基酰胺酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶活性。

在厌氧环境中24-48小时内的MRS培养液适合于格氏乳杆菌MCC2的培养，然后在所述培养液中看到均一的混浊生长。在37℃厌氧环境(CO₂/H₂/N₂:5/5/90)中的MRS琼脂培养基上培养48小时后，格氏乳杆菌MCC2的菌落具有1.5-2mm的直径，灰白色，粗糙且具有不规则的边缘。细胞呈短棒状至球棒状，具有中等厚度。最适生长温度是37℃；所述菌株还在45℃下繁殖。最适生长环境的pH是6.5。格氏乳杆菌MCC2是过氧化氢酶和氧化酶阴性的，专性同型发酵(OHOL)的，在葡萄糖发酵过程中不水解精氨酸并且不产生气体。

基于API50CHL系统(bioMérieux,France)测试试剂盒将格氏乳杆菌MCC2鉴定为德氏乳杆菌德氏亚种(L.delbrueckiissp.delbrueckii)(与模式株一致：良好,ID%-94.6,T指数0.35)。基于16SrRNA序列对格氏乳杆菌MCC2进行的分子鉴定显示了与模式株格氏乳杆菌IDCC3102的同源性(BLASThttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/sequence-analysis/)。

基于APICHL50，格氏乳杆菌MCC2的碳水化合物发酵概况如下。该菌株发酵下列：乳糖、蔗糖、海藻糖(trechalose)和七叶苷。

根据APIZYM(bioMérieux,France)测试试剂盒，格氏乳杆菌MCC2已经获得了亮氨酸芳基酰胺酶、缬氨酸芳基酰胺酶、α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶活性。

安全性

来自健康儿童消化道的微生物菌株的起源证明了其GRAS(公认为安全)状态或者所述微生物菌株对人而言是安全的并且适合用于经口施用。乳杆菌的种-植物乳杆菌和格氏乳杆菌也已经进入了具有EFSA(EFSA.IntroductionofaQualifiedPresumptionofSafety(QPS)approachforassessmentofselectedmicroorganismsreferredtoEFSA.EFSAJ2007;587,1-16)的QPS(安全合理推定)状态的分类单元列表。

溶血活性

方法学：在微好氧环境中血琼脂平板(BloodAgarBasenr2,Oxoid+7%人血或马血)上温育后测定植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2的溶血活性。

结果。菌株植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2没有溶血活性。

对抗生素的抗性

方法学：在E-测试(ABBiodisk,Solna)的帮助下测试植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2对抗生素的敏感性。根据欧委会(EuropeanCommission)推荐的流行病学断点来测定最低抑制浓度。

表1植物乳杆菌MCC1DSM23881和格氏乳杆菌MCC2DSM23882的抗菌敏感性(MIC,mg/L)

*MIC–最低抑制浓度、抗性断点、OHOL–专性同型发酵乳杆菌，n.r.-非必需的#

**EuropeanCommission(EC),2002.OpinionoftheScientificCommitteeonAnimalNutritiononthecriteriaforassessingthesafetyofmicro-organismsresistanttoantibioticsofhumanclinicalandveterinaryimportance.EuropeanCommission,HealthandConsumerProtectionDirectorateGeneral,DirectorateC,ScientificOpinions,Brussels,Belgium.http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scan/out64_en.pdf

#FEEDAPPanelEFSATechnicalguidancepreparedbythePanelonAdditivesandProductsorSubstancesusedinAnimalFeed(FEEDAP)ontheupdateofthecriteriausedintheassessmentofbacterialresistancetoantibioticsofhumanorveterinaryimportance.TheEFSAJournal(2008)732,1-15。

根据欧委会(EC,2002.OpinionoftheScientificCommitteeonAnimalNutritiononthecriteriaforassessingthesafetyofmicro-organismsresistanttoantibioticsofhumanclinicalandveterinaryimportance.EuropeanCommission,HealthandConsumerProtectionDirectorateGeneral,DirectorateC,ScientificOpinions,Brussels,Belgium.http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scan/out64_en.pdf)对乳杆菌建立的指示，植物乳杆菌MMC1显示对头孢噻吩和万古霉素具有抗性。

已知乳杆菌的若干种类/菌株对所提及的抗生素具有天然抗性，并因此不期望使用该微生物水平转移抗生素抗性基因。不发生对其他所研究抗生素的抗性。

菌株格氏乳杆菌MMC2对所测试的抗生素没有抗性。

植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2的功能性质

代谢物概况

方法学：在微好氧生长环境中温育24小时和48小时后，已经利用气相层析(HP6890)建立了代谢物概况(表2)。乳酸细菌(Lactobacilly)在10%CO₂环境中的MRS琼脂培养基上生长48小时，然后根据McFarland将悬浮液制备到0.9%NaCl溶液(具有10⁹微生物/mL的密度)中，并将1.0mL所得悬浮液接种至9.0mL的MRS液体培养基中。使用毛细管柱HP-INNOWax(15mx0.25mm;0.15μm)测定代谢物的量mmol/L。柱温度程序60℃1分钟，20℃/分钟120℃10分钟；检测器(FID)350℃。

表2.植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2在MRS培养基中微好氧培养24小时和48小时后，MRS培养基中乙酸、乳酸和琥珀酸的浓度(mmol/L)。

植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2聚集和乳凝固能力的测定

方法学：乳凝固能力。在37℃微好氧条件，UHT脱脂乳中温育菌株48小时后研究凝固乳的能力。根据以下方案评估凝固能力：

1.强(+)–24小时内乳凝固，

2.缓慢(+/-)–48小时内乳凝固，

3.缺乏(-)–乳不凝固。

自动聚集。为了评估自动聚集的能力，将先前在MRS琼脂培养基上预生长24小时的菌株悬浮在生理溶液中。所得悬浮液在室温下保持15分钟。根据以下方案评估聚集能力：0-缺乏，悬浮液均匀混浊；1-在溶液中有一些絮片；2-在悬浮液中有许多絮片，在试管的底部有少量沉积物；3-密集的，不发生悬浮，在底部上有沉积物，溶液几乎透明。

24小时内植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2使乳凝固，具有强的自动聚集性质(表3)。

表3菌株的聚集、一般蛋白质水解和乳凝固能力

菌株自动聚集乳凝固植物乳杆菌MCC13+格氏乳杆菌MCC23+

益生元的发酵能力

为了评估塔格糖(ArlaFoodIngredients)、棉子糖P95(BeneoOrafti)、棉子糖Synergy1(BeneoOrafti)和棉子糖L60/75(Orafti)的发酵，将0.05mL测试乳杆菌种的48小时培养物接种到MRS培养基中，其含有0.5%的山梨醇(sorbite)、塔格糖或松三糖(melecitose)，而不含葡萄糖。将氯酚红(0.004%)加入到培养基中作为指示剂。基于48小时后的颜色变化(从红色变成黄色)评估发酵。

表4植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2使用益生元的能力

植物乳杆菌MCC1格氏乳杆菌MCC2塔格糖-+L60/75++棉子糖 Synergy 1+-棉子糖 P95++

针对病原体的抗微生物活性

方法学：为了评估抗微生物性质，使用划线法(HüttP,ShchepetovaJ,LoivukeneK,KullisaarT,MikelsaarM.Antagonisticactivityofprobioticlactobacilliandbifidobacteriaagainstentero-anduropathogens.JApplMicrobiol.2006;100(6):1324-32)。

为了测定对病原体的抑制，以mm测量无生长区(growth-freezone)。与Hütt等(2006)类似，基于所用样品的结果计算算术平均数和标准误差，并如下评估在37℃温育过程中菌株(mm)的拮抗活性：-弱<9.7；中等9.7-12.2；强>12.2。将所有测试平行重复至少三次。

表5在厌氧环境和微好氧环境中进行培养的过程中利用划线法评估的植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2对病原体的抗微生物活性(对病原体生长的抑制，mm)

弱<9.7；中等9.7-12.2；强>12.2;nd–未测定。

划线测试中植物乳杆菌MCC1的抗微生物活性(杀死细胞及其分泌的代谢物的效果)在两种环境中对大多数所测试的病原体是强的(除了单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)和肠炎沙门氏菌)。格氏乳杆菌MCC2在两种环境中呈现为弱的拮抗剂。

一般蛋白水解性质

通过将之前在MRS培养液中预生长48小时的菌株划线到测试培养基上，在SMA培养基(脱脂乳琼脂培养基)和酪蛋白酸钙琼脂上研究植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2的一般蛋白水解性质。这些在37℃微好氧环境中7天内进行温育。基于以下评级系统评估蛋白水解的强度(6次测试，算术平均数)：4-强，3-中等，2-弱，1-非常弱，0-无。

结果：植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2具有足够良好的一般蛋白水解效果水解效果(在4-点系统中，植物乳杆菌MCC1为3点，格氏乳杆菌MCC2为2点)。

基于更特异的蛋白水解能力的生物选择(质谱和RP-HPLC技术测试，以鉴定α-S1-酪蛋白和β-酪蛋白的蛋白水解程度)

植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2它们如何水解不同的乳蛋白质是未知的。所以首先，使用个别纯的乳蛋白质(β-乳球蛋白、α-S1-酪蛋白、β-酪蛋白)确定水解过程中发生的分子量谱的改变，以稍后分析全脂乳的蛋白质谱(specter)改变。在MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离飞行时间)质谱仪上测定乳蛋白质水解产物的分子量(Marsilio,R.Catinella,S.SeragliaR.TraldiP.(1995)Matrix-AssistedLaser-DesorptionIonizationMass-SpectrometryfortheRapidEvaluationofThermal-DamageinMilk.RapidCommunicationsinMassSpectrometry,9,550-552)。将根据McFarland4标准具有10⁹CFU/mL的密度的悬浮液从培养物中制备到KCl生理溶液中。将10μl的乳蛋白质级分加入到所获得的悬浮液中。通过在测试之前和之后将稀释系列划线，测定这些级分的溶液中菌株的存活。将所述菌株在37℃下相应的蛋白质级分环境中温育2-6天。然后，将样品离心并在质谱仪(VoyagerDEPro,AppliedBiosystems)上测定蛋白质概况(图1和图2)。发现作为本发明目标的菌株能够使新陈代谢适应营养贫乏的环境。例如在测试中，唯一的营养来源是α-S1-酪蛋白、β-乳球蛋白、β-酪蛋白或从菌株细胞本身获得的物质。在测试结束时，所述菌株在全部三种蛋白质级分环境(α-S1-酪蛋白、β-乳球蛋白、β-酪蛋白)中是可检测到的。

然后在RP-HPLC(反相高效液相层析)方法的帮助下在具有2.5%脂肪含量的市售乳中研究菌株的蛋白水解性质。在温育的第2天和第4天测定α-S1-酪蛋白和β-酪蛋白的蛋白水解程度(图3)。为此，将对应于所研究的乳蛋白质的RP-HPLC层析谱峰面积与开始时刻(对照，即加入乳杆菌前的乳等于100%)进行比较，并计算剩余乳蛋白质的百分比量。此外，进行多于21天温育时间的实验。并且在预稀释乳的情况下还利用乳清(以减少变应性酪蛋白的量)研究作为本发明目标的菌株的组合，以提高蛋白水解效率和蛋白水解活性。已经按照Bobe等(BobeG,BeitzDC,FreemanAE,LindbergGL.(1998)SeparationandQuantificationofBovineMilkProteinsByreversed-PhaseHigh-PerformanceLiquidChromatography.J.Agric.FoodChem.,46,458-463)描述的一系列方法学开发了用于RP-HPLC分析的乳样品制剂和层析条件。将具有2.5%脂肪含量的市售乳(其中加入10⁷CFU/mL的研究菌株并在37℃下进行温育)与不含菌株的乳进行比较。高效液相层析(HPLC)(HewlettPackard1100)和装填多孔硅的反相柱Zorbax300SB-C18用于乳蛋白质的分离。流动相是具有变化梯度的洗脱系统，其由以下组成：溶液A-比例为900:100:1(v/v/v)的乙腈、水、TFA；溶液B-比例为100:900:1(v/v/v)的乙腈、水、TFA。梯度以溶液B开始，并且在将样品注射进系统后立即开始增加溶液A的比例。在分离阶段，当发生乳蛋白质分离时，溶液A的含量每分钟增加0.47%。通过将保留时间与主要的乳蛋白质标准的保留时间进行比较并利用MALDI-TOF质谱仪测定分子量来鉴定所获得的级分。乳蛋白质以下列顺序洗脱：κ-CN、α_S2-CN、α_S1-CN、β-CN、α-LA和β-LG。植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2对于α-S1-酪蛋白和β-酪蛋白具有适当的效果(见图1和图2的总结数据)，在第二天减少在儿童对牛乳、α-S1-酪蛋白和β-酪蛋白的变态反应应答中具有重要作用的蛋白质的量。基于RP-HPLC分析，最佳定向部分水解者是格氏乳杆菌MCC2(图3)。将上文提及的乳杆菌彼此组合，乳中的蛋白水解效果与个别使用同一菌株相比多少有些降低。植物乳杆菌MCC1还在由40%乳和60%乳清组成的混合物中温育4天：与开始时刻相比，α-酪蛋白的含量在第四天为81%，而β-酪蛋白的含量为83%。

实现了设定目标：菌株植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2及其组合减少了20-40%量的α-S1-酪蛋白和/或β-酪蛋白(即发生了定向中等水解效果)。

植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2水解引起乳变态反应的蛋白质，并且它们具有良好的一般蛋白水解活性。它们的使用分别或一起减少了乳变态反应，并因而它们可用于产生乳变态反应减少的具有健康性质的食物产品和膳食补充剂。

基于共轭亚油酸(CLA)产生的生物选择

CLA代表一组18碳脂肪酸，亚油酸(LA,顺式-9,反式-12-18:2)异构体，其中双链是共轭的。CLA在生物氢化和氧化过程中天然形成。认为CLA具有抗脂肪形成、抗致癌、抗糖尿病和抗炎症作用，对免疫系统、细胞因子和免疫球蛋白的产生具有调节作用并具有通过具体的转录因子直接或间接调节某些基因表达的能力(Wahle,K.W.J.,Heys,S.D.和Rotondo,D.(2004).Conjugatedlinoleicacids:aretheybeneficialordetrimentaltohealth?Prog.LipidRes.43:553-587)。因为若干乳酸细菌能够将亚油酸变成共轭亚油酸，那么其将可能在发酵的乳产品中增加CLA含量(Sieber,R.,Collomb,M.,Aeschlimann,A.,Jelen,P.和Eyer,H.(2004).ImpactofmicrobialculturesonCLAindairyproducts-areview.Int.DairyJ.14:1-15)。为此，应该测试哪种乳酸细菌是CLA生产菌。已知在微生物生长环境中出现的游离脂肪酸具有制菌效果，影响微生物的生长和细胞膜的通透性。效果的强度取决于脂肪酸。具有更高水平饱和的长链脂肪酸具有更强的抗微生物作用。双链的立体化学还影响了抗微生物活性：具有顺式构型的脂肪酸相比于反式形式是更强的抑制剂(Kankaanp??,P.E.,Salminen,S.J.,Isolauri,E.,Lee,Y.K.(2001).Theinfluenceofpolyunsaturatedfattyacidsonprobioticgrowthandadhesion.FEMSMicrobiol.Lett.194:149-153)。微生物具有建立的防御机制，用于抵抗抑制其生活功能的化合物：将多不饱和脂肪酸异构化成抑制性更低的变体，例如将具有更强制菌效果的亚油酸(LA)转化成CLA(Sieber,R.,Collomb,M.,Aeschlimann,A.,Jelen,P.andEyer,H.(2004).Impactofmicrobialculturesonconjugatedlinoleicacidindairyproducts-areview.Int.DairyJ.14:1-15)。大多数出现的CLA停留在环境中；一部分加入到细胞膜的脂质中。已经发现，少量的CLA可以定位在微生物细胞中。已经在若干微生物属，包括乳杆菌种的代表中发现了缀合LA和其他脂肪酸(油酸、蓖麻油酸)的能力。使用我们开发的CLA测定方法评估菌株在将亚油酸加入生长环境(MRS，脱脂乳)中的基础上产生CLA的能力。已经清楚，具有所需要的目的性蛋白水解效果的植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2显著产生了CLA(表7)。同时，这些菌株实际上对LA的制菌效果不敏感。

基于氧化抗性(抗氧化性)的生物选择

研究了具有特异的有限蛋白水解性质，还有CLA生产性的菌株植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2是否具有生理学上显著的氧化抗性。应该利用至少两种方法测定氧化抗性。

亚油酸测试(LA-测试)用作第一种方法，所述测试使得可以测定乳杆菌的细胞悬浮液抑制亚油酸过氧化的能力。

商业化的测试(总抗氧化剂状态-TAS,RandoxLaboratoriesLtd.,UK)用作第二种方法，所述测试基于乳杆菌的细胞悬浮液对形成铁基正铁肌红蛋白自由基(ferrylmetmyoglobinradical)(其由过氧化氢产生)的抑制(Rice-Evans和Miller1994)。以奎诺二甲基丙烯酸酯(trolox)(维生素E的可溶性形式)单位(mmol/L)报道TAS的值。两种方法均已公开(KullisaarT,ZilmerM,MikelsaarM,VihalemmT,AnnukH,KairaneC,KilkA.(2002).Twoantioxidativelactobacillistrainsaspromisingprobiotics.Int.J.FoodMicrobiol.72,215-224;Kullisaar,T.,Songisepp,E.,Mikelsaar,M.,Zilmer,K.,Vihalemm,T.,Zilmer,M.(2003)Antioxidativeprobioticfermentedgoatsmilkdecreasesoxidativestress-mediatedatherogenicityinhumansubjects.BritishJournalofNutrition90,449-456)。

为了测定TAA和TAS，将菌株在37℃下MRS培养液(Oxoid)中温育24小时。将微生物细胞在4℃和1500rpm下离心10分钟，利用等渗盐水(4℃)洗涤并悬浮在1.15%KCl(Sigma,USA)中。OD₂₆₀1.1时的悬浮液密度是10⁹微生物细胞/mL。植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2具有生理学上显著的总抗氧化性(表6)。

表6利用TAA和TAS方法测定的氧化抗性(n=7-9;M±SD)

菌株TAA (%)TAS (mmol/l)植物乳杆菌Inducia DSM 2137926±120.13±0.04植物乳杆菌MCC1 DSM 2388120±80.05±0.02格氏乳杆菌MCC2 DSM 2388225±60.03±0.03植物乳杆菌Tensia DSM 2138022±50.05±0.02

基于一氧化氮和过氧化氢产生能力的生物选择

为了获得目的性信息，还在NO和H₂O₂的产生方面研究了预先选择的菌株(特异的有限蛋白水解性质、CLA产生、抗氧化活性)。根据文献，之前没有关于通过微生物菌株同时产生NO和H₂O₂方面的研究。利用活细胞使用电化学测量(Apollo4000freeradicalanalyzerWPI,Berlin,Germany)使用ISO-HPO2和ISO-NOP类型的电极来进行测量。将所述电极置于在MRS培养液(Oxoid)中生长的培养物中，在5-7分钟内同时记录信号并计算测定时间内的平均信号强度。将每个实验点测定为4次独立平行实验，并且将每个平行实验测定两次。通过将样品信号与标准曲线进行比较测定所研究样品中NO和H₂O₂的浓度。

植物乳杆菌MCC1具有显著的产生NO和过氧化氢的能力，格氏乳杆菌MCC2也产生这两种化合物(图4和图5)。

因此，菌株植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2适合作为抗氧化剂添加剂添加剂用于产生食物产品和膳食补充剂。

表7显示了上文提及的菌株及其组合的功能性质的总结。

表7菌株植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2及其组合的功能性质的总结

#得分3>=20mm；得分2=15-20mm；得分1=<15mm,##得分3–无疾病；得分2–一些疾病；得分1–改变，疾病，¹得分3-400-500；得分2-300-399；得分1-100-299单位，²得分3–2.0-3.0；得分2–1.0-1.99；得分1-<1.0单位，⁴得分3–菊粉，其衍生物，塔格糖得分2-仅菊粉或塔格糖–无菊粉或塔格糖,⁵得分3–30-45%,得分2-15-30%,得分1–<15%,³得分3–仅微量；得分2-<10；得分1-11-30单位(长期效果中),^&得分3TAA>20,TAS>0.1；得分2–TAA>15,TAS0.05-0.09；得分1–TAA<15,TAS<0.05单位，***得分:CLA产生3–40-31,得分230–20-15,得分114-10单位。

上述描述的微生物菌株是本发明的目标

本发明的下一个目标是含有一种或两种菌株植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2的组合物。

如果所述组合物仅含有一种菌株，所述菌株含量在0.8-1.2体积百分比范围内，其中植物乳杆菌MCC1菌株的菌落计数是0.25x10⁸-4x10⁸CFU/mL，并且格氏乳杆菌MCC2菌株的菌落计数是0.5x10⁷-1x10⁸CFU/mL。

当使用一种菌株时，所述菌株的含量优选为1.0体积百分比，其中植物乳杆菌MCC1菌株的菌落计数在0.4x10⁸-4.8x10⁸CFU/mL范围内，并且格氏乳杆菌MCC2菌株的菌落计数是0.8x10⁷-1.2x10⁸CFU/mL。

如果所述组合物含有两种菌株植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2，那么两种菌株的含量在0.4-0.6体积百分比范围内，其中植物乳杆菌MCC1菌株的菌落计数在0.2x10⁸-2.4x10⁸CFU/mL范围内，并且格氏乳杆菌MCC2菌株的菌落计数是0.4x10⁷-0.6x10⁸CFU/mL。

当使用两种菌株时，两种菌株的含量优选为至少0.5体积百分比，其中植物乳杆菌MCC1菌株的菌落计数在0.25x10⁸-2x10⁸CFU/mL范围内，并且格氏乳杆菌MCC2菌株的菌落计数是0.5x10⁷-0.5x10⁸CFU/mL。

上文提及的菌株可以是活的或被杀死的。

本发明的下一个目标是所提及菌株的

-作为抗氧化剂蛋白水解成分用于产生食物产品和/或膳食补充剂，

-用于产生减少乳变态反应的低变应原的食物产品和/或膳食补充剂，

-用于产生减少伴随良性前列腺增生的下尿道刺激症状和氧化应激以及与此相关的炎症的食物产品和/或膳食补充剂

的单独或共同用途。

本发明的下一个目标是用于产生减少乳变态反应和伴随良性前列腺增生的下尿道刺激症状和氧化应激以及与此相关的炎症的食物产品和/或膳食补充剂的方法。

根据本发明的方法包括下列阶段：

A)将含有乳蛋白质的初始混合物加温至37+2℃；

B)加入植物乳杆菌MCC1和/或格氏乳杆菌MCC2或两者一起加入。如果单独使用植物乳杆菌MCC1，那么将加入至多达1.2体积百分比，优选1体积百分比，其菌落计数为0.4x10⁸-4.8x10⁸CFU/mL。如果单独使用格氏乳杆菌MCC2，那么将加入至多达1.2体积百分比，优选1体积百分比，其菌落计数为0.8x10⁷-1.2x10⁸CFU/mL。当两种上文提及的菌株一起使用时，那么将加入至多达1.2体积百分比，优选1体积百分比，其中将加入0.25x10⁸-2x10⁸CFU/mL的植物乳杆菌MCC1，加入0.5x10⁷-0.5x10⁸CFU/mL的格氏乳杆菌MCC2。发酵的最终pH为4.2+0.25。

C)通过植物乳杆菌MCC1或格氏乳杆菌MCC2或通过植物乳杆菌MCC1+格氏乳杆菌MCC2将混合物在37+2℃下发酵至少18-26小时。

D)将所述混合物在80-85℃范围内(优选82℃+2)巴氏消毒30-35分钟(优选30分钟)并冷却至温度20-30℃。

E)利用添加剂添加剂给所获得的混合物调味并冷却至温度2-6℃。

F)将所获得的混合物用于产生食物产品和/或膳食补充剂。在食物产品的情况下，将混合物装瓶、储存(在2-6℃)并进行所有需要的分析(测定氧化抗性等)。所述混合物还可以以粉末(胶囊、锭剂、片剂、粉末小袋(powdersachets)等)或液体(安瓿)形式用于产生商品化的膳食补充剂。

在粉末形式的膳食补充剂的制备过程中，例如通过冻干(冰冻-干燥)、喷雾干燥、碾磨干燥或其他已知方法(直至获得粉末稠度)从混合物中去除水。在液体膳食补充剂的制备过程中，从产品中部分去除水，直至获得所希望的稠度。可利用或不利用适当的添加剂(例如，抗氧化剂、甜味剂、益生元)制备膳食补充剂。

在上文提及的方法中，乳蛋白质的来源是乳、奶粉、乳蛋白质浓缩物、乳清或其他乳蛋白质来源。水果或浆果果汁、-浓缩物、糖浆或果汁饮料或水果或浆果果酱，优选沙棘、蓝莓或树莓果汁或其他果汁、糖浆、浓缩物是合适的添加剂。

附图说明

图1-MALDI-TOF质谱分析(示例性典型实验)。与菌株格氏乳杆菌MCC2混合后30分钟的β-酪蛋白。

图2-MALDI-TOF质谱分析(示例性典型实验)。与菌株格氏乳杆菌MCC2温育48小时后，基本上去除了β-酪蛋白24,0kDa的质谱峰(massspecterpeak)。

图3-菌株植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2在48小时和96小时温育情况下对β-酪蛋白水平的影响(基线水平是100%，基于MALDI-TOF质谱和RP-HPLC分析数据)。

图4-通过菌株植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2的NO产生。

图5-通过菌株植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2的H₂O₂产生。

图6-产生食物产品和产品添加剂的方案。

具体实施方式

实施例1：用产生乳变态反应应答和尿道刺激症状以及相关氧化应激和炎症减少的食物产品和膳食补充剂(其具有上文提及的健康性质，含有微生物植物乳杆菌MCC1或格氏乳杆菌MCC2或其组合)的方法。

下文呈现了优选的实施方案。

为了产生减少乳变态反应应答和尿道疾病的食物产品和/或膳食补充剂，使用在发酵罐中24小时内预生长的微生物培养物，然后将其冻干。

为了产生食物产品，将冻干的微生物培养物植物乳杆菌MCC1和/或格氏乳杆菌MCC2在少量温的(至少20℃)乳清、乳或从奶粉/乳蛋白质浓缩物或其他乳蛋白质来源制备的溶液中活化至少4小时。

用于产生具有健康性质的食物产品或产品添加剂的方法包括下列阶段(见图6中的方案)：

a)将初始混合物加温至发酵温度37±2℃，所述初始混合物含有乳蛋白质、从乳酪制造业获得的乳清(表8中的化学物理性质)，其中通过分离减少脂肪相并去除乳酪粉；

b)1体积百分比的菌株植物乳杆菌MCC1(菌落计数为0.5x10⁸-4x10⁸CFU/mL)或菌株格氏乳杆菌MCC2(菌落计数为1x10⁷-1x10⁸CFU/mL)或两种菌株一起(两者0.5体积百分比，其含有以0.25-2x10⁸CFU/mL范围密度的菌株植物乳杆菌MCC1的活细胞和以0.5x10⁷-0.5x10⁸CFU/mL范围密度的菌株格氏乳杆菌MCC2的活细胞)。

表8乳清的化学物理性质

成分/参数含量脂肪(%)< 0.115 -->蛋白质(%)0.66±0.10乳糖(%)4.07±0.59干物质(%)5.37±0.27密度(g/cm³)1.0199±0.0002pH6.14±0.41

c)将所述混合物在温度37±2℃下发酵18-26小时，其间由于一种或多种菌株植物乳杆菌MCC1和/或格氏乳杆菌MCC2的作用发生了乳蛋白质的部分水解。发酵持续直至酸度达到pH4.20±0.25的值；

d)为了失活(杀死)所述一种或多种菌株植物乳杆菌MCC1和/或格氏乳杆菌MCC2，将所述混合物在82±2℃下巴氏消毒30-35分钟并冷却至温度20-30℃；

e)利用所选的添加剂给所获得的混合物调味，所述添加剂可以是水果或浆果果汁、-浓缩物、-糖浆、果汁饮料或水果或浆果果酱。例如，使用16-17体积百分比的沙棘果酱或4.7-5体积百分比的浓缩樱桃果汁饮料和沙棘果汁以及9.8-10.2体积百分比的树莓蓝莓浓缩果汁饮料。

f)将所获得的混合物冷却至2-6℃，将食物产品煮沸，进行器官感觉和氧化抗性分析并储存(2-6℃)，以及进行临床研究(见下文)。

为了产生粉末膳食补充剂，使用食品加工技术中已知的方法(例如在冻干或干燥(喷雾干燥、碾磨干燥等)的帮助下)从所获得的混合物中去除水。优选使用单段式喷雾干燥器(进气温度160℃，出气温度80℃)，以产生粉末产品添加剂。

将具有熔点高于乳糖的合适填充剂(例如麦芽糊精)加入通过上文提及的方式产生的混合物中(以与乳清干物质1:1的比例)。

利用超滤对水、糖(乳糖)和盐进行分离用作另一个选择，其后是利用真空机器进行浓缩并干燥(喷雾干燥)，并因此获得具有低乳糖含量和高蛋白质含量的粉末膳食补充剂。

作为第三个选择，利用真空装置进行浓缩后接喷雾干燥用于去除水。最终的结果是含有乳糖的粉末膳食补充剂。

表9利用沙棘果酱调味的含有菌株MCC1+MCC2的食物产品(乳清饮料)和利用沙棘果酱调味的含有菌株MCC1+MCC2的膳食补充剂的化学物理性质

以上文提及的方式产生作为本发明目标的含有微生物和添加剂的食物产品FP-I–FP-V如下：

食物产品I(或FP-I)：含有混合物+植物乳杆菌MCC1+格氏乳杆菌MCC2的乳蛋白质；添加剂沙棘果汁(BT)；

食物产品II(或FP-II)：含有混合物+植物乳杆菌MCC1的乳蛋白质；添加剂树莓蓝莓浓缩果汁饮料(RB)。

食物产品III(或FP-III)：含有混合物+植物乳杆菌MCC1+格氏乳杆菌MCC2的乳蛋白质；添加剂黑加仑树莓浓缩果汁饮料(BR)。

食物产品IV(或FP-IV)：含有混合物+植物乳杆菌MCC1的乳蛋白质；添加剂蓝莓浓缩果汁饮料(B)。

食物产品V(或FP-V)：含有混合物+植物乳杆菌MCC1的乳蛋白质；添加剂越橘浓缩果汁饮料(C)。

膳食补充剂I(或DS/FP-I)：含有混合物+植物乳杆菌MCC1+格氏乳杆菌MCC2的乳蛋白质；添加剂沙棘果汁(BT)；

膳食补充剂II(或DS/FP-II)：含有混合物+植物乳杆菌MCC1的乳蛋白质；添加剂树莓蓝莓浓缩果汁饮料(RB)。

膳食补充剂III(或DS/FP-III)：含有混合物+格氏乳杆菌MCC2的乳蛋白质；添加剂。

表10

食物产品的典型感官测试实例

品尝人(Degustators)(n=15)。要求基于以下评分：1-讨厌的，2-不太能容忍的，3-可以容忍的，4-良好，5-极好/受欢迎的来评估下列参数：稠度、颜色、气味、味道和酸度。

FP-VFP-IVFP-IIIFP-I稠度2.3±1.23.6±1.03.3±1.34±1.1颜色2.6±0.93.8±0.83±14.1±1.2味道2.8±0.93.2±1.03.8±0.83.5±1.017 -->气味2.6±0.92.8±1.03.4±0.83.4±1.2酸度2.8±0.93.1±0.83.7±0.63.2±1.2合计2.6±1.03.3±0.93.4±0.93.7±1.2

实施例2：用于产生乳变态反应应答和尿道刺激症状以及相关氧化应激和炎症减少的食物产品和膳食补充剂(其含有微生物植物乳杆菌MCC1或格氏乳杆菌MCC2或其组合)的添加剂

作为产品添加剂，使用沙棘果汁(BT)(由沙棘浆果制成，不含防腐剂，经冷压缩和巴氏消毒的)、树莓蓝莓浓缩果汁饮料(将组分：浓缩的树莓蓝莓果汁(RB)、糖、酸度调节剂柠檬酸、防腐剂山梨酸钾稀释10倍)、越橘浓缩果汁饮料(C)和蓝莓浓缩物(B)(见表10)。利用原子吸收分光光度计测量(AAS)方法SpektraAAFS和220Z测定添加剂的抗氧化性(TAA和DPPH测试)和生命元素含量。(Varian,Australia)，在空气-乙炔(acetylen)混合物中，利用AAS火焰法测定Cu、Zn、Fe、Mn含量，利用发射法测定K含量。根据有效需求，利用专门的调查问卷进行终产品的感官测试。在表10中呈现了结果。

实施例3：临床试验1号

产品的安全性和有益作用，生物化学-临床和感官测试。

使用通过多重生物选择获得的多能性菌株和添加剂，并应用合适的技术方案(见实施例1)获得了食物产品FP-I(MCC1+格氏乳杆菌MCC2,BT)和FP-II(MCC1,RB)。随后进行临床试验(根据世界医学协会的赫尔辛基声明，被塔尔图大学(TartuUniversity)伦理审查委员会批准)，以阐明食物产品FP-I和FP-II的安全性和健康效果。

临床试验的主要方案如下：25位志愿者(11位女性，14位男性)，40-65岁，根据以下研究选择标准被随机分配成两组：无临床问题、慢性疾病、特殊饮食、维生素使用、矿物质制剂，参与者没必要改变其体力活动、平常的酒精使用、吸烟习惯或进食习惯。在每天使用200g的FP-I(n=10)或FP-II(n=15)两周之前和之后，测定以下生物化学-临床参数：炎症标志物(hsCRP、MPO、IL-6、IL-10)、脂和脂蛋白标志物(TG、胆固醇、LDL-胆固醇、HDL-胆固醇、sdLDL)、免疫球蛋白(IgM、IgA、IgG、IgE)、氧化应激(OxS)标志物(异前列烷、oxLDL、LDL-b2GPI)、血糖、血压和尿肌酐。

结果

1)安全性

每天调查问卷的科学分析显示，在两周使用过程中没有受试者抱怨有不舒适或肠问题并且没有出现阴性症状。FP-I或FP-II的使用没有驱动它们的生物化学和临床参数超出地方性参考值界线的作用。它们没有增加IgE抗体的量，因为与试验前期相比重要的变态反应标志物之一没有引起炎症反应(hsCRPoxLDL、MPO、IL-6)或改变血脂、脂蛋白(TG、LDL、HDL)和葡萄糖的值，也没增加体内OxS的水平(异前列烷、oxLDL、MPO、sdLDL、LDLb2GPI)(表10)，并且不损伤肾功能(尿肌酐)。因此，在本发明思想基础上获得的FP-I和FP-II不引起炎症反应、一般变态反应致敏感作用、OxS，并因此不损伤健康人的有机体。

2)健康促进作用

临床试验的结果分析显示，FP-I和FP-II的使用诱导了一些统计学上显著的和多少不同的阳性效果(表10)。FP-I发挥了减轻整个身体的全身OxS负荷(降低了尿异前列烷和血MPO水平)的效果和抗炎效果(降低了血MPO)。FP-II减轻了整个身体的全身OxS负荷(降低了尿异前列烷)水平并发挥了抗炎效果(降低了hc-CRP并增加了IL-10)。同时，两种食物产品的使用不改变免疫球蛋白IgM、IgA和IgM的数值。

因此：第一个临床试验显示，本发明的思想(菌株的多元目的性生物选择、添加剂的生物选择和技术解决方案)产生了安全且更低变应原的食物产品，其具有若干炎症和氧化应激相关效果(与牛乳相比，引起更少的变态反应应答)，并在具有前列腺疾病(包括排尿障碍)的人中对生物化学和临床参数具有阳性效果。

表11生物化学和临床参数(临床试验1号；M±SD)

*n=10,**n=9,***n=15；组II中的四个人血压降低。

实施例4：临床试验2号儿童中的牛乳变态反应研究

牛乳蛋白质引起的反应在5-15%的婴儿中发生(HostA.(2002).Frequencyofcow’smilkallergyinchildhood.AnnAllergyImmunol89(Suppl1):33-7)，但是牛乳蛋白质变态反应(CMPA)在2-7.5%的婴儿中发生(HillDJ,FirerMA,SheltonMJ等(1986)Manifestationofmilkallergyininfancy:clinicalandimmunologicfindings.JPediatr109:270-6)。CMPA可以是IgE或非IgE介导的。通常，早期反应是荨麻疹、血管性水肿、呕吐或特应性皮炎加重。特应性皮炎加重或胃肠道疾病作为晚期反应发生(VandenplasY,BruetonM,DupontC,HillD,IsolauriE,KoletzkoS,OranjeAP,StaianoA.(2007)Guidelinesforthediagnosisandmanagementofcow'smilkproteinallergyininfants.ArchDisChild.92:902-908)。现存的诊断测试不能证明或否定儿童是否患有CMPA(VantoT,Juntunen-BackmanK,KalimoK等(1999)Thepatchtest,skinpricktest,andserummilk-specificIgEasdiagnostictoolsincows'milkallergyininfants.Allergy54:837-42)。因此，CMPA的诊断金标准是具有后续激发作用的排除饮食(VandenplasY,BruetonM,DupontC,HillD,IsolauriE,KoletzkoS,OranjeAP,StaianoA.(2007)Guidelinesforthediagnosisandmanagementofcow'smilkproteinallergyininfants.ArchDisChild.92:902-908)。作为用于激发作用测试的方案，使用Isolauri等描述的用于此类研究的国际上承认的方案(IsolauriE,TurjanmaaK.(1996)Combinedskinprickandpatchtestingenhancesidentificationoffoodallergyininfantswithatopicdermatitis.JAllergyClinImmunol;97:9-15;SütasY,KekkiO-M,IsolauriE.(2000)Lateonsetreactionstooralfoodchallengearelinkedtolowseruminterleukin-10concentrationsinpatientswithatopicdermatitisandfoodallergy.ClinExpAllergy30:1121-8)。

方法学

在塔尔图大学临床基金会(TartuUniversityClinicsFoundation)的儿童临床变态反应疾病中心(CentreofAllergicDiseasesoftheChildren'sClinic)进行利用食物产品FP-II和FP-I的开放性激发作用(根据世界医学协会的Helsinki声明，被TartuUniversityEthicsReviewCommittee所批准)。测试在年龄为9个月-4岁8个月(平均年龄25.1个月)的儿童中进行20次(部分受试者参与两种食物产品试验)。预试验背景如下：TartuUniversityClinicFoundation的CentreofAllergicDiseasesoftheChildren'sClinic(针对乳的IgE测试，针对乳的NTT)的医生根据历史和辅助研究诊断所有儿童具有牛乳变态反应和/或不耐受。研究组中的所有儿童为无乳排除饮食。使用乳后，9名儿童发生皮疹，一般是特应性皮炎加重，一名儿童发生了急性荨麻疹，一名儿童发生了腹泻。一名儿童仅在进食了加工的乳产品后出现了呼吸困难和皮疹。3名儿童已经同时被诊断为患有哮喘，其中一名还具有变应性鼻炎，一名具有花粉变态反应(花粉病)。一名儿童具有哮喘和花粉变态反应并发症。没有儿童接受抗组胺药或皮质类固醇治疗。在三名儿童中，并发的哮喘正在减轻，因此当进行激发测试时，他们没有接受持久的哮喘治疗。

在TUCF的CentreofAllergicDiseasesoftheChildren'sClinic，试验的第一天进行开放性口腔激发。以增加的量(在下唇上一滴，2mL、10mL、50mL、100mL)向儿童施用所研究的产品(FP-II或FP-I)。施用每次量后，在20分钟内评估儿童的状况和变态反应的发生。如果发生疹、咳嗽、呼吸困难或腹痛/腹泻，则立即中断产品的施用。如果在试验第一天施用至多达100ml产品后，儿童没有反应，那么所述儿童在第二天、第三天和第四天在家每天接受100mL所研究的产品。要求父母评估迟发反应的发生。如果儿童具有以下反应，则认为测试是阳性的：a)早期反应-在施用少量产品后的激发第一天，发生瘙痒、疹、荨麻疹或呕吐；b)迟发反应-在开始用所研究产品进行激发后发生皮炎加重、呕吐、腹痛和腹泻超过24小时。如果在激发过程中(4天)和随后一周内不发生反应，则所述开放性激发测试是阴性的。因此，受试者耐受所述产品。

结果总结

食物变应原性问题的解决是非常复杂的并且不可能产生完全没有变态反应但具有非常高的生物品质的产品。因为目前儿童可以同时对若干食物产品(还对其他常见因素)具有变态反应，所以该问题变得更困难。这也在我们的试验中观察到了(见表5)，其使得难以排除在给定时间由于其他原因的引发而没有出现阳性应答疹。因此，研究的焦点是定向的，以便产生更少的变态反应应答，即所获得的食物产品相比于牛乳是更低变应原性的。对给定食物产品无变态反应或更少变应性的儿童的每个百分比会增加在其最重要的生物发育期内能为其发育获得足够生物学高品质食物的儿童数量。激发测试显示，两种食物产品FP-II以及FP-I相比于牛乳是更低变应原性的(表5)。12名儿童中的至少3-4名儿童在激发测试基础上使用FP-I后没有发生任何变态反应。8名受试者中的3名受试者在使用FP-II后没有发生任何变态反应。在FP-I引起一些反应的5名受试者中，3名耐受FP-II(60%)。因此在案例情况下，FP-II相比于FP-I甚至是更低变应原性的。由于味觉性质，大多数儿童还优选FP-II。

表12对牛乳变态反应应答的研究(低变应原性试验)

CMA–牛乳变态反应，AD–特应性皮炎，BA–支气管哮喘。

实施例5：临床试验3号。食物产品FP-I和FP-II对伴随良性前列腺增生的下尿道刺激症状和氧化应激以及炎症指示的作用。

上文提及的临床试验显示，本发明的思想(菌株的多元目的性生物选择、添加剂的生物选择和技术解决方案)产生了使用安全且更低变应原性的食物产品FP-I和FP-II，其具有若干炎症和氧化应激相关作用并对尿道刺激症状和OxS以及炎症指示具有阳性效果。

方法学

参与试验的55名男性(施用FP-I)和5名男性(施用FP-II)，其具有轻度或中度IPSS(国际前列腺症状评分)<8。所述IPSS调查问卷含有评估下尿道刺激症状的3个问题和评估尿路梗阻(梗阻症状)的4个问题。还需要进行前测试(PSA，前列腺分泌物)用于准确选择研究组。这意味着，在前列腺分泌物研究和NIH-CPSI调查问卷的帮助下，排除了活性前列腺炎(前列腺炎症)，并且通过使用PSA测试和手指触诊，排除了前列腺癌的临床可能性。因此我们在研究组中包括患有轻度或中度尿障碍的男性，其中排除了其他原因的疾病(前列腺炎、前列腺癌)。患者(患有轻度和中度排尿障碍，没有炎症反应)每天使用200g食物产品FP-I或FP-II，使用2周。

结果

FP-I。进行两个测试系列。在第一个系列中有23位患者参与，并且在第二个测试(其中还进行了安慰剂对照)中有32位患者参与(表13)。在两种情况中，观察到炎症标志物HsCRP和OxS标志物异前列烷统计学上的显著减少。第二个测试系列还指出抗炎IL-10和炎症/OxS标志物oxLDL统计学上的阳性变化。在第一个测试系列中(n=23)，还观察到该标志物阳性变化的趋势。在第二个测试系列中，还测定了糖化血红素的水平，其降低是统计学上的。

当总结两个测试系列的结果(表13)时，则hsCRP、异前列烷和oxLDL在统计学上下降，并且存在IgE下降的正趋势，并且IL-10在统计学上增加。使用FP-I后hsCRP和oxLDL之间存在相关性。在对照组中，没有看到任何提及的参数统计学上显著的变化。

FP-II。进行一个测试系列并确定下列参数：IgEkU/L、oxLDL、IL-10、8-异前列烷、hsCRP和MPO。发现，在RP-II使用者组中，在多于40%的使用者中出现了炎症和OxS标志物MPO统计学上的显著减少(之前77±13，之后53±9ng/mL，p=0.0056)和尿障碍频率的降低。

结果总结

FP-I以及FP-II的施用降低了具有中度下尿道疾病(IPSS评分<8)并且具有主要刺激症状的受试者中OxS和炎症的水平。在FP-I的情况下，66%具有中度下尿道疾病(IPSS评分<8)和主要刺激症状的研究组男性(55)中出现了至少20%的疾病减少，并且在30%的研究组中出现了平均40%的疾病减少。患者的临床和生物化学参数(hs-CRP、IL-10、oxLD、8-异前列烷)可能在统计学上得到了改善。在对照组中没有出现任何变化。

表13FP-I的测试系列(M±SD)

实施例6：膳食补充剂(DS/FP-I)对伴随良性前列腺增生的下尿道刺激症状和氧化应激以及炎症指示的作用。

在试验中包括具有轻度或中度排尿障碍-IPSS(国际前列腺症状评分)的10名男性，然而基于先前的前列腺分泌物研究和NIH-CPSI调查问卷，排除了活性前列腺炎，并通过使用PSA测试和手指触诊排除了临床上显著的前列腺癌的可能性。每天使用45g膳食补充剂，使用14天。在所有具有轻度(IPSS评分2-7)和中度(IPSS评分8-19)排尿障碍的10名患者中，使用膳食补充剂后，根据“国际前列腺症状评分”分别有3/7的排尿障碍改善了50-66%(p=0.003)，然而发现在夜间排尿的需求减少方面出现了显著阳性变化(平均87.5%)。

所有临床试验的总体总结

含有植物乳杆菌MCC1和格氏乳杆菌MCC2的食物产品和膳食补充剂是低变应原性的，降低了OxS的水平并对具有中度下尿道疾病和主要刺激症状的那些患者的前列腺疾病具有统计学上有效的效果。