用于评估人数学能力的基因以及检测试剂盒和检测方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，特别涉及用于评估人数学能力的基因以及检测试剂盒和检测方法。本发明首次提供了人类全基因组中SPOCK1基因，特别是其SNP位点rs1012694、rs11743006、rs17778739、rs17777541在评估人数学能力中的应用。本发明通过三个独立人群样本的meta分析发现了4个位于SPOCK1基因上的达到全基因组关联分析显著水准的SNP位点，基于此提供了一种评估数学能力的检测试剂盒以及检测方法，实验结果来自于中国人群，具有很强的中国人群适应性，同时检测手段经济便捷，有利于在人群中大范围推广。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及用于评估人数学能力的基 因以及检测试剂盒和检测方法。

背景技术

数学能力对于个人及整个社会的发展具有重要的意义。数学能力作为人 类最重要的高级认知能力之一，是个体正确认识客观世界所必需的基本能力， 甚至对未来的工作和生活都具有重要的影响。因此，数学能力培养贯穿人类 教育始终。研究证实，数学能力由遗传和环境因素共同决定，遗传因素决定 了数学能力的20％到90％。

单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)是由单个核苷酸 的改变而引起的DNA序列的改变，造成染色体基因组的多样性。SNP分布广、 密度高，已成为继限制性片段长度多态性(RFLP)标志和微卫星即短串联重 复(STR)标志后的第三代遗传标志，在肿瘤、糖尿病、阅读障碍等复杂遗传 疾病的研究中起重要作用。其中，全基因组关联分析(GenomeWideAssociation Study，GWAS)是研究这类复杂遗传性状相关基因的重要手段。

对于数学能力的全基因组关联分析仅在欧美人群中有少量研究，并且均 未发现显著性基因位点。目前在中国人群中，还没有针对数学能力进行的大 规模的系统的全基因组关联分析研究报道，因而缺乏针对中国人群的用于数 学能力评估的遗传基因位点及关联基因检测试剂盒。因此开展人群数学能力 相关遗传位点研究，对提高我国人口综合素质具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供用于评估人数学能力的基因以及检测 试剂盒和检测方法，通过对所述基因的全基因组关联分析来评估数学能力， 适合于中国人群

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

人类全基因组中SPOCK1基因在评估人数学能力中的应用。

作为优选，所述SPOCK1基因为其上SNP位点rs1012694、SNP位点 rs11743006、SNP位点rs17778739、SNP位点rs17777541中的一个或两个以 上。

目前在中国人群中，还没有针对数学能力进行的大规模的系统的全基因 组关联分析研究报道，因而缺乏针对中国人群的用于数学能力评估的遗传基 因位点及关联基因检测试剂盒。本发明首次在中国人群中通过GWAS分析发 现了与中国人群数学能力关联的基因及其SNP位点，并在此基础之上提供了 一种评估数学能力的检测试剂盒以及检测方法。

在数学能力全基因组关联分析研究方面，本发明首次以中国一般人群为 研究对象，使用了结构化数学考试成绩作为判断标准，最低分0分最高分100 分，之后采用全基因组关联分析方法，分析个体的数学成绩与全基因组单核 苷酸多态性之间的关联，研究得出数学成绩为代表的数学能力的关联位点。

全基因组关联分析的第一个阶段，以两个独立人群为基础(样本量分别 为494和504)，共获得位于常染色体上的28个满足GWAS进一步验证标准 的SNP位点。对这28个SNP位点在另一个样本量为599的人群中进行了验 证，结果如表1，表1结果验证了SPOCK1基因上SNP位点rs1012694、SNP 位点rs11743006、SNP位点rs17778739、SNP位点rs17777541具有显著性差 异。

表1

此后对三个人群样本的数据结果进行meta分析，表明本发明所述4个位 于SPOCK1基因上的SNP位点达到全基因组关联分析显著水准(5×10^-8)， 分别为rs1012694(p＝1.870×10^-9)、rs11743006(p＝1.450×10^-9)、rs17778739(p ＝2.170×10^-9)和rs17777541(p＝7.840×10^-9)，结果见表2。

表2

SNP Allele β SE P rs1012694 T/C -2.396 0.398 1.87E-09 rs11743006 A/C -2.404 0.397 1.45E-09 rs17778739 G/C -2.386 0.398 2.17E-09 rs17777541 C/G -2.302 0.399 7.84E-09

注，SNP:单核苷酸多态性；Allele:等位基因；β:加法模型回归系数；SE： 回归系数标准误；其中每增加一个风险等位基因(对应于表1中的次要等位 基因和表2中的第一个等位基因)，数学成绩平均变化β个单位，故β可以 作为分值来评估数学能力高低。

基于上述的发明内容，本发明提供了一种评估人数学能力的检测试剂盒， 包括：

SNP位点rs1012694、SNP位点rs11743006、SNP位点rs17778739、SNP 位点rs17777541中一个或两个以上SNP位点的扩增引物及其单碱基延伸引 物。

作为优选，所述SNP位点rs1012694、SNP位点rs11743006、SNP位点 rs17778739、SNP位点rs17777541的扩增引物及其单碱基延伸引物如下：

SNP位点rs1012694扩增引物序列如SEQIDNO:1-2所示，单碱基延伸引 物序列如SEQIDNO:3所示；

SNP位点rs11743006扩增引物序列如SEQIDNO:4-5所示，单碱基延伸 引物序列如SEQIDNO:6所示；

SNP位点rs17778739扩增引物序列如SEQIDNO:7-8所示，单碱基延伸 引物序列如SEQIDNO:9所示；

SNP位点rs17777541扩增引物序列如SEQIDNO:10-11所示，单碱基延 伸引物序列如SEQIDNO:12所示。

作为优选，所述试剂盒还包括：

Taq酶、虾碱性磷酸酶、虾碱性磷酸酶缓冲液、无酶水，以及SNP位点 rs1012694、SNP位点rs11743006、SNP位点rs17778739、SNP位点rs17777541 各自的标准DNA样本。其中，标准DNA主要是作为对照使用，检验试剂盒 中所有试剂是否能够正常工作。按照默认的操作规范，在具体试验第一次实 施过程中，会进行标准DNA检测。

同时，本发明还提供了一种评估人数学能力的检测方法，包括：

步骤1、用SNP位点rs1012694、SNP位点rs11743006、SNP位点 rs17778739、SNP位点rs17777541中一个或两个以上SNP位点的扩增引物分 别PCR扩增人基因组DNA目的片段；

步骤2、步骤1所述PCR扩增结束后，将PCR产物用虾碱性磷酸酶处理， 除去游离的dNTPs；

步骤3、步骤2完成后，向PCR产物中加入各自对应的单碱基延伸引物 分别进行PCR单碱基延伸；

步骤4、将单碱基延伸后的PCR产物树脂纯化，芯片点样，质谱分析， 检测结果采用软件对SNP位点rs1012694、SNP位点rs11743006、SNP位点 rs17778739、SNP位点rs17777541进行等位基因分型；

步骤5、根据如下标准评估数学能力：

SNP位点rs1012694，携带等位基因分型为C/C的人群为参照，等位基因 分型为T/C人群较C/C分型人群数学能力平均低2.396分，等位基因分型为 T/T人群较C/C分型人群数学能力低4.792分；

SNP位点rs11743006，携带等位基因分型为C/C的人群为参照，等位基 因分型为A/C人群较C/C分型人群数学能力低2.404分，等位基因分型为A/A 人群较C/C分型人群数学能力低4.808分；

SNP位点rs17778739，携带等位基因分型为C/C的人群为参照，等位基 因分型为G/C人群表示较C/C分型人群数学能力低2.386分，等位基因分型 为G/G人群表示较C/C分型人群数学能力低4.772分；

SNP位点rs17777541，携带等位基因分型为G/G的人群为参照，等位基 因分型为C/G人群较G/G分型人群数学能力低2.302分，等位基因分型为C/C 人群较G/G分型人群数学能力低4.604分；

根据分值大小评估数学能力。

作为优选，步骤1为：

用SNP位点rs1012694、SNP位点rs11743006、SNP位点rs17778739、 SNP位点rs17777541中一个或两个以上SNP位点的扩增引物分别PCR扩增 人外周血基因组DNA目的片段；

PCR扩增程序为：94℃4min；94℃20s，56℃30s，72℃1min，共 45个循环；72℃5min；4℃保持；

PCR扩增体系为：体系共5μl，包括2μlTaq酶，1.5μl无酶水，上游和 下游扩增引物各0.25μl，1μl人外周血基因组DNA样本溶液，浓度为50ng/μl。

作为优选，步骤2为：

步骤1所述PCR扩增结束后，配制虾碱性磷酸酶处理反应液与PCR产物 反应，除去游离的dNTPs；

反应条件为37℃40min，85℃5min，4℃保持；

虾碱性磷酸酶处理反应液：共2μl，其中包括1.53μl无酶水，0.17μl虾 碱性磷酸酶缓冲液，0.3μl虾碱性磷酸酶。

作为优选，步骤3为：

步骤2完成后，向PCR产物中加入各自对应的单碱基延伸引物分别进行 PCR单碱基延伸；

PCR反应体系：反应缓冲液0.2μl，单碱基延伸引物0.94μl，ddNTP0.2μl， Taq酶0.041μl，无酶水0.619μl；

PCR反应程序：I.94℃30s；II.94℃5s；III.52℃5s；IV.80℃5s；V.返 回III,4个循环；VI.返回II,39个循环；VII.72℃保持3min，VIII4℃保持。

本发明中PCR过程中所用试剂为商业试剂，可通过市售途径购买，例如 各种缓冲液等。

作为优选，步骤4所述软件为TYPER4.0软件(Sequenom)。

由以上技术方案可知，本发明通过三个独立人群样本的meta分析发现了 4个位于SPOCK1基因上的达到全基因组关联分析显著水准的SNP位点，基 于此提供了一种评估数学能力的检测试剂盒以及检测方法，实验结果来自于 中国人群，具有很强的中国人群适应性，同时检测手段经济便捷，有利于在 人群中大范围推广。

具体实施方式

本发明公开了用于评估人数学能力的基因以及检测试剂盒和检测方法， 本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出 的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都 被视为包括在本发明。本发明所述应用、产品和检测方法已经通过较佳实施 例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文 所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在数学能力全基因组关联分析研究方面，本发明以中国一般人群为研究 对象，研究得出数学成绩为代表的数学能力的关联位点。全基因组关联分析 的第一个阶段，以两个独立人群为基础(样本量分别为494和504)，共获得 位于常染色体上的28个满足GWAS进一步验证标准的SNP位点。对这28个 SNP位点在另一个样本量为599的人群中进行了验证。在三个人群样本的meta 分析中共发现4个位于SPOCK1基因上的达到全基因组关联分析显著水准 (5×10^-8)的SNP位点，分别为rs1012694(p＝1.870×10^-9)、rs11743006(p＝ 1.450×10^-9)、rs17778739(p＝2.170×10^-9)和rs17777541(p＝7.840×10^-9)。

在此新发现的基础上，本发明进一步开发了数学能力评估的基因检测试 剂盒，包含用于扩增上述4个SNP位点基因片段的PCR引物对，以及特异性 检测上述4位点基因型的SequenomMassARRAY单碱基延伸引物。所述PCR 引物对序列和单碱基延伸引物的序列如表3所示。

表3

所述试剂盒还包括Taq酶，SAP(shrimpalkalinephosphatase，虾碱性磷 酸酶)，SAPBuffer，无酶水，以及rs1012694、rs11743006、rs17778739和 rs17777541位点的标准DNA样本。

本发明的试剂盒中含有特异性扩增目的片段的PCR引物对、特异性检测 个体基因型的SequenomMassARRAY单碱基延伸引物(引物的特异性保证了 后续检测的准确性)，以及用于PCR扩增和进行SequenomMassARRAY分 型检测试剂盒的常规组件、试剂、操作步骤等。

本发明的检测方法用于测定来源于人的基因组DNA，临床取材样本来源 广泛，如体液、组织细胞等，通过提取和纯化这些样本均可制备基因组DNA。

本发明所用的试剂均为市售产品，可购自天根生化科技。

按照产品说明书提供的操作步骤，使用OSR-M102-T1血液基因组DNA 提取试剂盒及其配套的OSE-M48核酸提取仪(天根生化科技)制备人外周血 基因组DNA作为检测的人DNA样本。

本发明采用SequenomMassARRAY对上述4个SNP位点进行检测，检 测方法如下：

1、用表1所示的4个扩增引物对分别扩增目的基因片段。PCR扩增：94℃ 4min；94℃20s，56℃30s，72℃1min，共45个循环；72℃5min；4℃保持。 每个反应体积为5μl，包括2μlTaq酶，1.0μl无酶水，PCR上游和下游引物 各0.25μl，0.5μldNTP(10mMeach)，1μlDNA样本溶液(浓度为50ng/μl)。

2、在PCR结束后，将PCR产物分别和碱性磷酸酶(SAP，shrimpalkaline phosphatase)处理反应液反应，以去除体系中游离的dNTPs。碱性磷酸酶处 理反应液(SAPMix，共2μl，其中包括1.53μl无酶水，0.17μlSAPBuffer， 0.3μlSAPEnzyme)反应条件：37℃40min，85℃5min，4℃保持，启动PCR 仪进行碱性磷酸酶处理。

3、步骤2完成后，向PCR产物中加入表3中各自对应的单碱基延伸引物 分别进行PCR单碱基延伸；

PCR反应体系：反应缓冲液0.2μl，单碱基延伸引物0.94μl，ddNTP0.2μl， Taq酶0.041μl，无酶水0.619μl；

PCR反应程序：I.94℃30s；II.94℃5s；III.52℃5s；IV.80℃5s；V.返 回III,4个循环；VI.返回II,39个循环；VII.72℃保持3min，VIII4℃保持。

4、树脂纯化，芯片点样，质谱分析，检测结果用TYPER4.0软件(Sequenom) 分型并输出结果。

5、根据如下标准评估数学能力：

SNP位点rs1012694，携带等位基因分型为C/C的人群为参照，等位基因 分型为T/C人群较C/C分型人群数学能力平均低2.396分，等位基因分型为 T/T人群较C/C分型人群数学能力低4.792分；

SNP位点rs11743006，携带等位基因分型为C/C的人群为参照，，等位 基因分型为A/C人群较C/C分型人群数学能力低2.404分，等位基因分型为 A/A人群较C/C分型人群数学能力低4.808分；

SNP位点rs17778739，携带等位基因分型为C/C的人群为参照，等位基 因分型为G/C人群表示较C/C分型人群数学能力低2.386分，等位基因分型 为G/G人群表示较C/C分型人群数学能力低4.772分；

SNP位点rs17777541，携带等位基因分型为G/G的人群为参照，等位基 因分型为C/G人群较G/G分型人群数学能力低2.302分，等位基因分型为C/C 人群较G/G分型人群数学能力低4.604分；

根据分值大小评估数学能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。