一种表面活性剂改进的木质纤维素的连续糖化共发酵法

摘要

本发明一种表面活性剂改进的木质纤维素的连续糖化共发酵法，涉及生物质原料降解通过发酵工艺生产燃料乙醇领域。本发明的技术方案为，通过添加表面活性剂对预处理的纤维素底物不经过脱毒处理直接进行连续酶解糖化共发酵；所述表面活性剂可选择在预酶解前加入或者预酶解后加入。本发明通过添加表面活性剂，对预处理的纤维素底物可不经过脱毒处理直接进行连续酶解糖化共发酵，对于降低葡萄糖的损失、简化生产工艺、降低设备投资、减少水消耗、提高乙醇产量等方面有经济、有效、可行的应用前景。本发明首次利用添加表面活性剂对未脱毒速生杨进行连续糖化共发酵生产乙醇，乙醇浓度及收率获得大幅度提高，有效降低了木质纤维素乙醇生产过程的总成本。

说明书

技术领域

本发明涉及生物质原料降解通过发酵工艺生产燃料乙醇领域，具体涉及一种表面活性剂 改进的木质纤维素的连续糖化共发酵法。

背景技术

随着化石能源的日益枯竭和环境污染的日益加剧，可再生清洁能源燃料乙醇的开发和利 用受到了人们的广泛关注。传统的乙醇发酵以糖或淀粉为原料，二者都是食物的主要来源， 以粮食为原料生产燃料乙醇已经对世界粮食安全构成了威胁，寻找其它原料替代粮食势在必 行。木质纤维素作为自然界最为丰富且廉价的可再生资源，其主要成分纤维素半纤维素是潜 在的燃料乙醇的生产原料，利用木质纤维素生产燃料乙醇成为世界各国研究的热点。由木质 纤维素生产燃料乙醇要经历预处理、酶解、发酵三个步骤，可是在生物质预处理过程中会产 生弱酸、糠醛和5-羟甲基糠醛(HMF)以及酚类化合物等毒性物质：这些化合物对酿酒酵母发 酵产生强烈抑制作用，从而影响酵母菌的正常生长和随后的发酵过程。

因此，对预处理的木质纤维素水解液进行脱毒处理显得尤其重要。目前文献报道的脱毒 方法主要包括水洗脱毒、物理脱毒(真空浓缩气提法、膜分离法)、化学脱毒(是石灰中和、 活性炭吸附、离子交换、溶剂萃取)、生物脱毒。例如文献BioprocessBiosystEng(2013) 36:659–666采用活性炭吸附法讨论了糠醛、HMF、乙酰丙酸等发酵抑制剂对酵母细胞生长速 度的影响；专利CA102226204B公开了一种木质纤维素乙醇发酵液的脱毒方法，通过在待处 理糖液中添加可溶性电解质盐后加热得到恒温原料液通过膜组件进行膜蒸馏去除糖液中对后 续发酵产生抑制作用的物质。可是，水洗、物理、化学脱毒等方式消耗大量水资源、设备投 资成本高且工艺复杂，而且脱毒效果差、糖分损失严重；YanlingYu报道了一种生物脱毒法 (BioresourceTechnology,2011,102(8):5123-5128),通过利用构巢曲霉(FLZ10)对玉米秸秆 蒸汽爆破液进行生物脱毒处理，然后利用酿酒酵母进行同步糖化发酵，乙醇浓度达到34g/L。 该方法需要增加构巢曲霉的设备投资、培养基化学试剂及能量消耗。因此，开发一种工艺简 单、成本低廉、效果好的脱毒的方法是木质纤维素乙醇工业的必经之路。

发明内容

本发明的目的是针对现有的生物质预处理过程中产生的毒性物质对后续发酵过程的抑制 作用，提供了一种表面活性剂改进的木质纤维素为原料的连续糖化共发酵法。

为了实现本发明目的，本发明的一种表面活性剂改进的木质纤维素的连续糖化共发酵法 (SSCF),对预处理的纤维素底物不经过脱毒处理直接进行连续酶解糖化共发酵；所述表面 活性剂可选择在预酶解前加入或者预酶解后加入。

表面活性剂选择在预酶解前加入的具体步骤为：以预处理的纤维素为原料作为底物，首 先添加纤维素酶、水溶性表面活性剂、PH缓冲液在高温条件下进行预酶解一段时间，然后降 低温度添加酿酒酵母进行同步糖化和乙醇发酵生产。

表面活性剂选择在预酶解后加入的具体步骤为：以预处理的纤维素作为底物，首先添加纤 维素酶、PH缓冲液在高温条件下进行预酶解一段时间，然后降低温度添表面活性剂、加酿酒 酵母进行同步糖化和乙醇发酵生产。

所述的发酵体系中：预处理的纤维素与缓冲液的固液比为0.1-0.3g/mL；所述水溶性表 面活性剂的浓度为0-0.4g/mL；纤维素酶的添加量为10-30FPU/g原料；酿酒酵母的细胞浓度 为：0.5*10⁸亿-1.8*10⁸个/mL；

所述的预酶解温度为50℃，预酶解时间为2-24小时；同步糖化和乙醇发酵生产的温度为 30-39℃；同步糖化和乙醇发酵时间为16-96小时，150～300rpm。

所述表面活性剂为聚乙二醇、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇二甲醚、聚二甲基硅氧烷、吐 温中的至少一种。

所述水溶性表面活性剂优选为聚乙二醇,分子量为200～8000，优选为200-2000。

所述表pH缓冲溶液为：醋酸-醋酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸-磷酸钠缓冲液或硫酸溶 液，pH缓冲溶液pH为4.0～5.5。

所述表pH缓冲溶液pH优选为4.8。

所述水溶性表面活性剂的浓度优选为0.125g～0.18g/mL。

所述的发酵体系中预处理的纤维素与缓冲液的固液比优选为0.125g/mL。

所述的发酵体系中纤维素酶的添加量优选为20FPU/g原料。

所述的发酵体系中酿酒酵母的细胞浓度为优选为0.6*10⁸～0.96*10⁸个/mL。

所述的预酶解时间优选为8-12小时；同步糖化和乙醇发酵生产的温度优选为33℃，同步 糖化和乙醇发酵时间优选为72小时。

具体SSCF的过程可见附图1，附图2和附图3。

现有技术以预处理的纤维素为原料，首先添加纤维素酶、PH缓冲液在高温条件下进行预 酶解一段时间，然后降低温度添加酿酒酵母进行同步糖化和乙醇发酵生产如图1所示；

本发明一种表面活性剂改进的木质纤维素的连续糖化共发酵法SSCF的过程如图2和图3 所示。

相对现有技术，本发明的优点在于：本发明通过添加表面活性剂，对预处理的纤维素底 物可不经过脱毒处理直接进行连续酶解糖化共发酵，对于降低葡萄糖的损失、简化生产工艺、 降低设备投资、减少水消耗、提高乙醇产量等方面有经济、有效、可行的应用前景。本发明 首次利用添加表面活性剂对未脱毒速生杨进行连续糖化共发酵生产乙醇，乙醇浓度及收率获 得大幅度提高，有效降低了木质纤维素乙醇生产过程的总成本。

例如：在蒸汽爆破预处理的速生杨的浓度为15％，同步糖化和发酵时间为96小时，未添 加表面活性剂时的乙醇收率浓度分别为22％和7.0g.L^-1,而添加1.5g.mL^-1的表面活性剂后 乙醇收率和浓度分别可达到75％和24.0g.L^-1，

附图说明

图1纯水中SSCF的操作过程；

图2表面活性剂改进的SSCF的操作过程1；

图3表面活性剂改进的SSCF的操作过程2；

图4不同浓度PEG-1000对未脱毒汽爆速生杨SSCF过程酶解效率的影响；

图5不同浓度PEG-1000对未脱毒汽爆速生杨SSCF过程乙醇收率的影响；

图6不同浓度PEG-1000对未脱毒汽爆速生杨SSCF过程乙醇浓度的影响；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围不受实施例的限制， 下述实施例和说明书中描述的内容只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前 提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。 本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

另外，值得说明的是，以下各实施例中发酵液中各组分的含量测定采用高效液相色谱仪 (Agilent1260)，依据木质纤维素底物的投料量计算其转化率、乙醇收率，依据发酵液中乙醇 质量、活化水与pH液体积计算乙醇浓度。

色谱条件为：离子交换柱，柱温为65℃，视差折光检测器，检测器为50℃；流动相：5Mm H₂SO₄，流速0.6ml/min，进样量25uL。

本发明实施例中所述的预处理方法为汽爆法处理。

实施例1

将预处理的速生杨粉末1.5g作为底物，首先添加pH值为4.86的缓冲液10.5mL、纤维素 酶0.2mL、在50℃条件下进行预酶解4小时，然后将温度降到33℃，然后加入酿酒酵母保持 细胞浓度为0.8*10⁸/mL进行SSCF发酵72小时。预处理的速生杨的酶解率、乙醇收率及浓度 数据见表1。

实施例2

将预处理的速生杨粉末1.5g作为底物，首先添加pH值为4.86的缓冲液10.5mL、纤维素 酶0.2mL、表面活性剂2.0g,在50℃条件下进行预酶解4小时，然后将温度降到33℃，然后 加入酿酒酵母保持细胞浓度为0.8*10⁸/mL进行SSF发酵72小时。预处理的速生杨的酶解率、 乙醇收率及浓度数据见表1。从表中数据可以看出，加入PEG-1000后酶解率几乎没有变化， 而乙醇收率及浓度提高将近1倍。

实施例3

实验步骤和实施例1相同，不同点在酵母细胞浓度为0.96*10⁸/mL。预处理的速生杨的 酶解率、乙醇收率及浓度数据见表1。从表中数据可以看出，在纯水体系中增加酵母细胞浓 度，酶解效率、乙醇收率及收率几乎没有改变。

实施例4

实验步骤和实施例2相同，不同点在细胞浓度为0.96*10⁸/mL。预处理的速生杨的酶解 率、乙醇收率及浓度数据见表1。从表中数据可以看出，在PEG-1000存在体系中增加酵母细 胞浓度，酶解效率、乙醇收率及收率几乎没有改变。

实施例5

实验步骤和实施例1相同，不同点在缓冲液体积增加为12.0mL。预处理的速生杨的酶解 率、乙醇收率及浓度数据见表1。从表中数据可以看出，在纯水体系中降低底物浓度，酶解 效率、乙醇收率及收率几乎没有改变。

实施例6

实验步骤和实施例2相同，不同点在缓冲液体积增加为12.0mL。预处理的速生杨的酶解 率、乙醇收率及浓度数据见表1。从表中数据可以看出，在PEG-1000存在体系中降低底物浓 度明显改善了酶解效率、乙醇收率及收率。

实施例7

实验步骤和实施例1相同，不同点在缓冲液体积减少为10.0mL。预处理的速生杨的酶解 率、乙醇收率及浓度数据见表1。从表中数据可以看出，在纯水体系中提高底物浓度，酶解 效率、乙醇收率及收率几乎没有改变。

实施例8

实验步骤和实施例2相同，不同点在缓冲液体积减少为10.0mL。预处理的速生杨的酶解 率、乙醇收率及浓度数据见表1。从表中数据可以看出，在PEG-1000存在体系中提高底物浓 度明显降低了酶解效率、乙醇收率及收率。

表1：预处理速生杨粉的连续酶解糖化和共发酵

实施例9

实验步骤和实施例5相同，不同之处在于纤维素酶用量为0.3mL。预处理的速生杨的酶 解率、乙醇收率及浓度数据见表2。从表中数据可以看出，在纯水体系中提高纤维素酶用量， 酶解效率少有提高，但是乙醇收率及收率几乎没有改变。

实施例10

实验步骤和实施例6相同，不同之处在于纤维素酶用量为0.3mL。预处理的速生杨的酶 解率、乙醇收率及浓度数据见表2。从表中数据可以看出，在PEG-1000体系中提高纤维素酶 用量，酶解效率、乙醇收率及收率均有所提高。

实施例11

实验步骤和实施例9相同，不同之处在于预处理速生杨在50℃条件下进行预酶解8小时。 预处理的速生杨的酶解率、乙醇收率及浓度数据见表2。从表中数据可以看出，在纯水体系 中延长共发酵时间，酶解效率有所提高，但是乙醇收率及收率几乎没有改变。

实施例12

实验步骤和实施例10相同，不同之处在于预处理速生杨在50℃条件下进行预酶解8小 时。预处理的速生杨的酶解率、乙醇收率及浓度数据见表2。从表中数据可以看出，在PEG 体系中延长共发酵时间，酶解效率、乙醇收率及收率均有所改善。

实施例13

实验步骤和实施例12相同，不同之处在于预处理速生杨的预酶解后加入PEG-1000。预 处理的速生杨的酶解率、乙醇收率及浓度数据见表2。从表中数据可以看出，表面活性剂的 加入顺序对发酵效率没有明显影响。

实施例14

实验步骤和实施例10相同，不同之处在于加入PEG-1000量为3.0克。预处理的速生杨 的酶解率、乙醇收率及浓度数据见表2。结果可以看出PEG-1000用量过多会导致SSCF过程 效率下降，酶解效率、乙醇收率及收率均有下降。

表2：预处理速生杨粉的连续酶解糖化和共发酵

实施例 PEG-1000 时间/h 酶解率/％ 乙醇收率/％ 乙醇/g.L^-19 0.0000 4+72 71.13 23.28 7.57 10 2.0039 4+72 72.12 71.20 23.17 11 0.0000 8+72 75.53 22.52 7.32 12 2.0085 8+72 76.51 75.63 24.61 13 2.0303 8+72 74.41 73.44 23.89 14 3.0300 4+72 62.16 60.89 19.81

实施例15

实验步骤和实施例11相同，不同之处在于预处理速生杨的预酶解时间为24小时。预处 理的速生杨的酶解率、乙醇收率及浓度数据见表3。从表中数据可以看出，纯水体系中SSCF 过程时间增加并没有改善乙醇收率及浓度。

实施例16

实验步骤和实施例12相同，不同之处在于预处理速生杨的预酶解后时间为24小时。预 处理的速生杨的酶解率、乙醇收率及浓度数据见表3。从表中数据可以看出，在PEG-1000存 在体系中SSCF过程时间增加并没有改善乙醇收率及浓度。

实施例17

实验步骤和实施例15相同，不同之处在于缓冲液体积减少为10mL。预处理的速生杨的 酶解率、乙醇收率及浓度数据见表3。从表中数据可以看出，纯水体系中SSCF过程底物浓度 增加并没有改善乙醇浓度。

实施例18

实验步骤和实施例12相同，不同之处在于缓冲液体积减少为10mL。预处理的速生杨的 酶解率、乙醇收率及浓度数据见表3。从表中数据可以看出，在PEG-1000存在体系中SSCF 过程底物浓度增加大幅降低了乙醇收率及浓度，但是仍然高于纯水体系结果。

表3.预处理速生杨粉的连续酶解糖化和共发酵

实施例 PEG-1000 缓冲液/mL 酶解率/％ 乙醇收率/％ 乙醇/g.L^-115 0.0000 12 82.88 21.55 7.01 16 2.0059 12 76.62 75.74 24.66 17 0.0000 10 77.41 19.59 7.65 18 1.9966 10 76.12 28.42 11.10

实施例19

实验步骤和实施例16相同，不同点在发酵温度为36℃，速生杨酶解率、乙醇收率及浓 度数据见表4。从表中数据可以看出，在PEG-1000存在体系中SSCF过程适当提高温可有效提 高乙醇收率及浓度。

实施例20

实验步骤和实施例16相同，不同点在发酵温度为39℃，速生杨酶解率、乙醇收率及浓 度数据见表4。从表中数据可以看出，在PEG-1000存在体系中SSCF过程中提高温度可有效提 高乙醇收率及浓度。

实施例21

实验步骤和实施例16相同，不同点在于加入表面活性剂PEG-200(2.0g)，酶解率、乙醇 浓度数据见表4。从表中数据可以看出，在PEG-200可提高乙醇收率及浓度。

实施例22

实验步骤和实施例16相同，不同点在于加入表面活性剂PEG-400(2.0g)，酶解率、乙醇 浓度数据见表4。从表中数据可以看出，在PEG-400可提高乙醇收率及浓度。

实施例23

实验步骤和实施例16相同，不同点在于加入表面活性剂PEG-4000(2.0g)克，葡萄糖转 化率、乙醇收率及浓度数据见表4。从表中数据可以看出，在PEG-4000可提高乙醇收率及浓 度。

实施例24

实验步骤和实施例16相同，不同点在于加入表面活性剂聚乙二醇单甲醚(2.0g)，葡萄糖 转化率、乙醇浓度数据见表4。

实施例25

实验步骤和实施例16相同，不同点在于加入表面活性剂聚乙二醇二甲醚(2.0g)，葡萄糖 转化率、乙醇浓度数据见表4。

表4预处理速生杨粉的连续酶解糖化和共发酵

实施例 表面活性剂 温度/℃ 酶解率/％ 乙醇收率/％ 乙醇/g.L^-119 PEG-1000 55+36 97.5 96.8 31.5 20 PEG-1000 55+39 89.1 89.0 29.0 21 PEG-200 55+33 77.4 60.8 19.8 22 PEG-400 55+33 76.1 66.8 22.8 23 PEG-4000 55+33 76.6 75.7 24.6 24 聚乙二醇单甲醚 55+33 77.2 28.4 11.1 25 聚乙二醇二甲醚 55+33 70.5 21.5 7.0

实施例26

将预处理的速生杨粉末1.5g作为底物，首先添加pH值为4.86的缓冲液12.0mL、纤维素 酶0.3mL、表面活性剂0-2.0g,在50℃条件下进行预酶解24小时，然后将温度降到33℃，然 后加入酿酒酵母保持细胞浓度为0.8*10⁸/mL进行SSCF发酵72小时。预处理的速生杨的酶解 率、乙醇收率及浓度数据见图4、5、6。从图中数据可以看出，加入PEG-1000后对酶解率几 乎没有影响，而乙醇收率及浓度随着PEG-1000的浓度的增加逐渐增加。

实施例27

将预处理的速生杨粉末1.5g作为底物，添加pH值为4.86的缓冲液12mL、纤维素酶0.3mL, 在50℃条件下进行预酶解4小时，然后将温度降到33℃，加入表面活性剂PEG-10001.5002g、 细胞浓度为0.8*10⁸/mL的酿酒酵母进行SSCF发酵72小时。预处理的速生杨的酶解率、乙醇 收率及浓度数据见表5。从表中数据可以看出，与实施例10及实施例12进行比较，PEG-1000 的加入顺序对酶解效率、乙醇收率及浓度没有明显影响。

实施例28

实验步骤同实施例27，不同点在于PEG-1000的加入量为2.0039g，预处理的速生杨的酶解 率、乙醇收率及浓度数据见表5。

实施例29

实验步骤同实施例27，不同点在于预酶解8小时，预处理的速生杨的酶解率、乙醇收率 及浓度数据见表5。

实施例30

实验步骤同实施例27，不同点在于预酶解8小时，表面活性PEG-1000的加入量为2.0103g， 预处理的速生杨的酶解率、乙醇收率及浓度数据见表5。

表5：预处理速生杨粉的连续酶解糖化和共发酵

实施例 PEG-1000 时间/h 酶解率/％ 乙醇收率/％ 乙醇/g.L^-127 1.5002 4+72 71.63 71.42 22.89 28 2.0039 4+72 71.82 70.90 22.17 29 1.5003 8+72 75.51 74.63 23.61 30 2.0103 8+72 74.93 73.84 24.01