一种利用自杀基因快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法

摘要

本发明提供一种利用自杀基因快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法，在自然光下，没有被噬菌体侵染的细菌不显蓝色，噬菌体侵染的细菌显蓝色；在加入致死条件诱导剂诱导下，具有抑制QS功能的特异多肽因抑制QS分子的活性而不启动自杀基因的表达，因此存活；而非特异多肽无法抑制QS分子，导致自杀基因启动致死；然后将存活的候选克隆挑出来，进一步功能验证，最后通过DNA测序的方法获得特异多肽序列对应的DNA序列，从而获得高效、特异的QSI多肽。本发明步骤简单，只需要3天至一周左右的时间，就可以获得多个QSI候选多肽，因此具有非常明显的优势。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程与适体技术，公开了针对筛选细菌群体感应抑制物的噬菌体 展示技术。具体而言，特指一种筛选细菌群体感应抑制物的技术，该方法同样也适用于长、 短链N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)的群体感应分子抑制物的筛选。本发明中涉及的噬菌体 展示技术可适用于例如噬菌体抗体库、环肽、线性多肽等带有随机文库的任何噬菌体文库。 涉及的宿主菌为可以被噬菌体文库侵染的雄性F’细菌，例如ER2738、DH5αF’、XL1-Blue，涉 及的载体为加入QS分子可导致自身基因诱导细菌死亡的载体pSB537。属于病原微生物预防 与控制领域。

背景技术

细菌耐药的形势严峻，如何提高新药研发速度，抑制或杀死病原菌的要求迫在眉 睫。目前新药的开发主要有几种方法：一是传统的经典方法，即从自然环境例如土壤或者植 物中筛选天然抗生素或者抗菌物质。但筛选天然抗菌物质的方法存在着过程繁琐，工作量 大等问题，需要在筛选规模与通量上得到质的提高；二是人工合成或者半合成的抗生素，通 过修改一些化学修饰改变化合物结构，提高药效。但由于同类合成的抗生素都具有类似化 学结构和作用机理，因此容易对同类耐药细菌产生抗性；三、近十几年来在国际知名药物公 司和科研机构中发展十分迅速的高通量药物筛选技术，使新药的大规模筛选、靶点确认、自 动化以及效价评估成为可能。同时，该技术也面临着筛选模型与数据库有限的技术难题；除 上述几种抑菌方法以外，还有一些利用细菌特殊生理功能以及重要靶点的新型抑菌药物正 在研究开发。例如消除细菌生物膜生成、抑制细菌群体感应以及抗体靶向抑制耐药菌的策 略。这些方法为新型药物开发提供了新的思路，有待于进一步研究。

细菌的群体感应（QS,quorumsensing）是指细菌根据自身细胞密度变化进行基 因表达调控的群体行为，研究发现，自然界中大部分的细菌都存在QS现象，它不仅控制细菌 的生物发光，还与生物被膜和孢子生成、毒素分泌、质粒转移以及包括抗生素在内的第二代 谢产物合成紧密相关。目前已知的细菌QS系统，可以根据分泌的化学信号分子性质（又称为 自诱导物，AI,autoinducer）分为以下4类：一类信号分子为AI-1，是N-酰基高丝氨酸内酯 类（AHLs）及其衍生物,广泛分布在革兰氏阴性细菌中并具有种属特异性。该类分子作用机 理的研究相对比较透彻：AHLs分子由一系列具有相同高丝氨酸内酯环和不同碳原子数目和 饱和程度的酰胺侧链构成，N侧链中的碳原子数多为偶数（只有C7一个奇数），从C4至C18不 等，而且在3碳位置上可以有不同的取代基团。如图1所示，以费氏弧菌为例，AHLs合成酶 LuxI合成特定AHLs并扩散到细胞外，当细胞密度增加到一定阈值时，AHLs与LuxR家族蛋白 结合，从而使LuxR族蛋白与DNA上的调控元件结合，起始转录LuxCDABEG，启动生物发光过 程；第二类是由LuxS家族蛋白形成的自诱导物AI-2，其主要成分为呋喃酮酰硼酸酯。文献报 道AI-2在多种革兰氏阳性和阴性细菌中存在，是不同物种细菌间相互联系的通用信号。另 外两类是在革兰氏阳性细菌中独有的寡肽类分子AIP（Autoinducingpeptide）以及目前 机制还尚未完全清楚的肾上腺素/去甲肾上腺素信息系统（AI-3）信号分子。

由于QS在细菌的生命活动中所起的重要作用，抑制细菌群体感应并不影响细菌的 生长，但却可以减少生物膜的生成、影响细菌毒素的分泌并且很难产生耐药性，因此，开发 针对QS相关基因或者其分泌的信号小分子物质的抑制物，称之为群体感应抑制剂（QSI， quorumsensinginhibitor）或者群体感应淬灭（QQ，quorumquenching），是一个具有广阔 应用潜力的抑菌策略，也是今后新型抗生素替代品的理想化合物来源，成为当前药物开发 研究的热点。

发明内容

关于QSI分子的筛选，目前主要集中在对AHLs和AI-2的抑制上。QSI的来源可以大致分 为4种，一种是从环境中提取的天然QSI分子。例如从海洋红藻Deliseapulchra、海洋珊瑚 Euniceaknighti、大蒜等天然物质中提取的AHLs和呋喃酮类物质；一种是根据信号分子的 结构，人工设计和合成其相似结构分子，以达到与QS分子竞争底物但又不激活活性的目的； 还有一种是利用表达QS分子降解酶的方法；此外，还有利用QS筛选特异抗体或者适体的方 法。以上四种是当前获得QSI的主要来源，但是都存在一些问题：植物等来源的样品成份复 杂，QSI前期的提取、鉴定和纯化过程繁琐而且还受到样品纯度与温度、地域等不确定因素 的限制；人工设计合成与抗体筛选不仅需要专业的化学合成与结构分析背景，还要考虑到 样品制备过程的繁琐程度，专业的设备、中间产物毒性与污染评估以及样品纯度等一系列 问题。

这些问题制约着QSI分子筛选的进一步发展，急需一种能快速、高通量地筛选出高 效QSI分子的新方法。因此，本发明所要解决的技术问题是：建立一种简单、快速地筛选抑制 不同类型QS分子特异性多肽的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

将噬菌体展示随机肽库与QS自杀感应菌株相结合的方法来筛选QSI分子。噬菌体展示 随机肽库（Phagedisplay），是将一段长度大约为15-36bp的随机核苷酸序列插入噬菌体 外壳蛋白结构基因内，外源短肽随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。理论上,7个 随机氨基酸序列可产生约20⁷种多肽序列，可以作为“人工抗体”，筛选出能特异性结合靶 物质的多肽。该技术一般采用生物淘选（Biopanning）的方法来筛选抗原表位，其基本技术 流程大致为：将靶蛋白或物质包被固定在聚乙烯平板中，再加入噬菌体展示肽库与之特异 性结合，经过多轮的清洗和筛选后，获得与靶物质结合较紧密的噬菌体克隆，最终确认特异 的短肽序列。但由于本专利研究的靶物质是N-酰基高丝氨酸内酯类（AHLs）以及呋喃酮酰硼 酸酯等小分子物质，很难直接包被在平板上进行富集，因此本专利中采用一个与传统生物 淘选方法完全不同的特异多肽筛选策略。主要原理是如图2所示：感应到QS分子将致死的感 应菌株与噬菌体随机肽库孵育侵染，在添加入相应抗生素、特异QS信号分子、致死条件诱导 剂和IPTG/X-gal诱导孵育平板长菌。在自然光下，没有被噬菌体侵染的细菌不显蓝色，噬菌 体侵染的细菌显蓝色；在加入致死条件诱导剂诱导下，具有抑制QS功能的特异多肽因抑制 QS分子的活性而不启动自杀基因的表达，因此存活。而非特异多肽无法抑制QS分子，导致自 杀基因启动致死。然后将存活的候选克隆挑出来，进一步功能验证，最后通过DNA测序的方 法获得特异多肽序列对应的DNA序列，从而获得高效、特异的QSI多肽。

本发明所要解决的问题是通过以下技术途径来实现的：如图2所示，本发明公开了 一个利用M13噬菌体展示随机肽库筛选QSI多肽的方法。以QS分子C4-AHL感应致死载体 pSB537为例，如图2所示，该质粒带有嗜水气单胞菌群体感应系统AhyRI’和条件致死基因 SacB，AhyR蛋白感应C4-AHL分子，激活AhyI’启动子，诱导细菌表达SacB蛋白。在添加自杀诱 导物20%蔗糖后，可导致细菌死亡，只有添加或者产生QSI分子才能使细胞存活。然后利用 M13噬菌体不裂解宿主菌并可分泌到胞外的特性，侵染携带pSB537的F’大肠杆菌，在添加 C4-AHL分子、四环素、氨苄青霉素、20%蔗糖和IPTG/X-gal的平皿中筛选出在可见光下显蓝 色、12小时孵育后能正常生长的噬菌斑。然后将该噬菌体扩增，加入带有pSB536的QS感应菌 株中，通过抑制生物发光的方法验证QSI功能，最后测序获得特异QSI多肽序列。需要指出的 是，目前已经有利用自杀基因SacB或者PhlA来筛选QSI的载体，例如QSIS1和QSIS213，因此 本专利重点描述的是利用噬菌体展示技术与QS感应自杀载体结合的技术。

所述方法具体包括如下：

（1）将QS信号分子C4-AHL感应自杀质粒转导入大肠杆菌ER2738菌株，获得菌株，从划线 平板中挑取该单菌落并接种到5ml添加有20μg/mL四环素和100μg/mL氨苄青霉素的LB 培养基中，37^oC、250rpm振荡过夜，以2%接种量转接到LB培养基中，然后在200rpm条件 下振荡至对数生长中期并收集1mL菌体后重悬于200μLLB培养基中待用；

（2）将噬菌体肽库放置冰上化冻，取10μL稀释到90μL无菌水中，再分别将步骤（1）中 待用重悬后的200μL菌液与10μL已稀释的噬菌体肽库轻轻混匀，在室温条件下孵育2-5 min；吸取上述所有预混液加入3mL、45^oC温浴已融化的含有10-30wt.%蔗糖、0.7wt.% 琼脂粉的上层琼脂LB培养基中，迅速充分混匀并倾倒到添加含有终浓度为20μg/mL四环 素、100μg/mL氨苄青霉素、10μMC4-AHL、10-30wt.%蔗糖、1.5wt.%琼脂粉的IPTG/X- galLB培养基平板上；待上层琼脂充分凝固后，倒置放入37^oC培养箱中静置培养12-16h；

（3）翌日，将过夜平板分别在白光光源下拍照比对，分析比较在致死条件下能够生长且 存在蓝色噬菌斑的个体菌落，挑取该蓝色单菌落转接于LB液体培养基中，并在在37^oC、250 rpm振条件下，培养4-5h；

（4）然后将转接后的菌液离心取上清待用，与此同时，将原始含pSB536质粒菌株过夜活 化后，按2%接种量转接至LB培养基中培养3h，再以体积比1：100稀释于LB培养基后添加终 浓度为10μMC4-AHL信号分子待用，最后以每孔200μL体积量添加于96孔黑色微孔板中， 并将待用上清，即外源添加所筛选出阳、阴性结果的上清10μL加入到96孔黑色微孔板，充 分混匀后于37℃多孔道酶标仪中，在OD490nm波长下每小时监测一次，共监测12-16h；

（5）利用化学发光成像技术，将该监测后的96孔黑色微孔板在生物发光条件下拍照比 对结果，其曝光时间为10min；根据拍照结果，挑选出目标噬菌体，最终，将目的噬菌体灭活 后送测序。

所述的IPTG/X-galLB培养基制备方法为：称取1.25gIPTG、1gX-gal溶于25 mL二甲基甲酰胺为母液，然后用时按体积分数为0.1%添加到LB培养基中；所述的LB培养基 为5g酵母粉，10g蛋白胨，10g氯化钠，pH7.4－7.6,1000mL。

所述的上层琼脂LB培养基为LB培养基中添加10-30wt.%蔗糖、0.7wt.%琼脂 粉。

所述质粒为pSB537，其制备方法为，将含有pSB536质粒菌株利用碱裂解法提取该 质粒，利用分子改造技术将该质粒中发光基因序列LuxCDABE替换成致死基因序列SacB，经 测序及功能验证后保存于-20^oC备用，致死基因序列SacB序列如SEQIDNO.1所示。

本发明的优点在于：本发明中使用的方法在原理上与现有筛选QSI的策略几乎完 全不同，首先它利用随机文库筛选获得特异性多肽序列，在实验室中就可以获得结果，不需 要从自然界的众多生物中去筛选，这样就省去了选材盲目、样品处理步骤繁琐、结果无法预 知、最终抑制物的结构和性质很难分离鉴定等问题；其次，和目前仅有的利用噬菌体抗体文 库筛选群体感应抑制多肽的方法相比，也有很大的不同。目前的文库筛选方法，是先用QS分 子化学修饰生成半抗原，然后免疫动物并构建特异性抗体噬菌体文库，最后进行传统的生 物淘洗方法寻找特异性抗体。该方法需要复杂的化学结构背景，半抗原的构建还取决于QS 分子自身的化学结构。而本发明适用于任何已知道基因调控背景的QS元件。同时，以往方法 共有的问题是，步骤繁琐，耗时长，需找一个QSI至少需要花费1个月至半年以上的时间。本 发明步骤简单，只需要3天至一周左右的时间，就可以获得多个QSI候选多肽，因此具有非常 明显的优势。该发明专利不仅可以用于抑制细菌毒性、生物膜形成，降低细菌耐药性等医疗 用途，还可以用于相对应QS分子检测试剂盒的开放。

附图说明

图1.费氏弧菌中LuxR/LuxI系统的QS感应原理简单示意图。

图2.本专利中构建的QSI诱导质粒pSB537_SacB图谱。

图3.本专利中筛选细菌群体感应抑制剂(QSI)多肽的原理示意图。

图4.本专利中筛选细菌群体感应抑制剂(QSI)多肽的试验流程图。

图5.筛选的噬菌体上清影响QS生物发光感应菌株pSB536情况。A）孵育24小时 后，OD490nm下，带pSB536质粒的大肠杆菌生物发光OD值，C4-AHL+为阳性对照（未添加外源 添加物）、C4-AHL为阴性对照（未添加信号分子以及外源添加物）、C4-AHL+peptide1为随机 挑选的非特异菌斑上清、C4-AHL+peptid2-5为实验组（在致死条件下能够在平板生长且存 在噬菌斑的个体菌落）；B)孵育24小时后，相应添加物在化学发光成像仪下图像。以上试验 在96孔黑色微孔板中完成，各重复三次，三个星号代表与只加C4-AHL相比显著性差异P< 0.001。

具体实施方式

所述方法具体包括如下：

（1）将QS信号分子C4-AHL感应自杀质粒转导入大肠杆菌ER2738菌株，获得菌株，从划线 平板中挑取该单菌落并接种到5ml添加有20μg/mL四环素和100μg/mL氨苄青霉素的LB培 养基中，37^oC、250rpm振荡过夜，以2%接种量转接到LB培养基中，然后在200rpm条件下 振荡至对数生长中期并收集1mL菌体后重悬于200μLLB培养基中待用；

（2）将噬菌体肽库放置冰上化冻，取10μL稀释到90μL无菌水中，再分别将步骤（1）中 待用重悬后的200μL菌液与10μL已稀释的噬菌体肽库轻轻混匀，在室温条件下孵育2-5 min；吸取上述所有预混液加入3mL、45^oC温浴已融化的含有10-30wt.%蔗糖、0.7wt.% 琼脂粉的上层琼脂LB培养基中，迅速充分混匀并倾倒到添加含有终浓度为20μg/mL四环 素、100μg/mL氨苄青霉素、10μMC4-AHL、10-30wt.%蔗糖、1.5wt.%琼脂粉的IPTG/X- galLB培养基平板上；待上层琼脂充分凝固后，倒置放入37^oC培养箱中静置培养12-16h；

（3）翌日，将过夜平板分别在白光光源下拍照比对，分析比较在致死条件下能够生长且 存在蓝色噬菌斑的个体菌落，挑取该蓝色单菌落转接于LB液体培养基中，并在在37^oC、250 rpm振条件下，培养4-5h；

（4）然后将转接后的菌液离心取上清待用，与此同时，将原始含pSB536质粒菌株过夜活 化后，按2%接种量转接至LB培养基中培养3h，再以体积比1：100稀释于LB培养基后添加终 浓度为10μMC4-AHL信号分子待用，最后以每孔200μL体积量添加于96孔黑色微孔板中， 并将待用上清，即外源添加所筛选出阳、阴性结果的上清10μL加入到96孔黑色微孔板，充 分混匀后于37^oC多孔道酶标仪中，在OD490nm波长下每小时监测一次，共监测12-16h；

（5）利用化学发光成像技术，将该监测后的96孔黑色微孔板在生物发光条件下拍照比 对结果，其曝光时间为10min；根据拍照结果，挑选出目标噬菌体，最终，将目的噬菌体灭活 后送测序。

所述的IPTG/X-galLB培养基制备方法为：称取1.25gIPTG、1gX-gal溶于25 mL二甲基甲酰胺为母液，然后用时按体积分数为0.1%添加到LB培养基中；所述的LB培养基 为5g酵母粉，10g蛋白胨，10g氯化钠，pH7.4－7.6,1000mL。

所述的上层琼脂LB培养基为LB培养基中添加10-30wt.%蔗糖、0.7wt.%琼脂 粉。

实施例1

1.材料方法

实验材料BamHI、EcoRI购自Thermoscientific公司；QuorumSensing检测质粒 pSB536和E.coliJM109（SIMONSWIFTet,1997）宿主菌为本实验室保存，ER2738宿主菌、 噬菌体环7肽库Ph.D.-C7C^TMPhageDisplayPeptideLibraryKit购自美国NewEngland Biolabs纽英伦生物技术有限公司；抗生素四环素、氨苄青霉素购于Sigma公司，其他蔗糖等 相关药品试剂及培养基分别购于中国国药集团化学有限公司与英国OXOID公司。引物合成 和序列测定由上海立菲生物技术有限公司完成；信号分子N-butyryl-L-Homoserine lactone（C4-AHL）购自Cayman公司,货号10007898，50mg。实施例中的实验方法，如无特殊 说明，均为常规方法。

实验步骤

(1)首先，将实验室所保存的含有pSB536质粒菌株利用碱裂解法提取该质粒，利用分子 改造技术将该质粒中发光基因序列LuxCDABE通过酶切位点BamHI、EcoRI替换成致死基因序 列SacB，经测序及功能验证后保存于-20^oC备用，命名为pSB537；同时将噬菌体环7肽库试 剂盒中的侵染所用宿主菌ER2738利用氯化钙法制备感受态（参考分子克隆实验指南第四 版）；然后取出核酸含量为100ng的pSB537质粒运用热激转化法将该质粒转导入所制备的 ER2738感受态中。以上该步骤的实施，有效的提高了本实验筛选的过程中噬菌体对宿主菌 侵染能力，故将QS信号分子C4-AHL感应自杀质粒pSB537转导入大肠杆菌ER2738菌株尤为必 要。从划线平板中挑取单菌落ER2738接种至5ml含有终浓度为20μg/mL四环素和100μg/mL 氨苄青霉素的液体LB培养基中37^oC，250rpm振荡过夜；翌日，取过夜菌以1:200转接到LB 培养基中，然后在200rpm条件下振荡至对数生长中期并收集1mL菌体后重悬于200μLLB 培养基中待用；

(2)然后，将噬菌体C7C环肽文库（NEB公司）放置冰上化冻，取出10μL稀释至90μL无菌 水中，再分别将步骤（1）稀释后待用的200μL菌液与该稀释后10μL的噬菌体肽库轻轻混 匀，置于室温条件下孵育2-5min；接着吸取上述预混液加入45^oC温浴已融化的含有10-30 wt.%蔗糖、0.7wt.%琼脂粉的上层琼脂LB培养基，迅速充分混匀并倾倒至含有终浓度为 20μg/mL四环素、100μg/mL氨苄青霉素、20wt.%蔗糖和10μMC4-AHL、1.5wt.%琼脂 粉的IPTG/X-gal下层固体LB培琼脂培养基平板上；除以上实验组之外，还设置了一组不添 加信号分子的对照组，等待上层琼脂充分凝固后，倒置放入37^oC培养箱中静置培养14h；

(3)翌日,将过夜平板分别在白光光源下拍照比对，分析比较在致死条件下能够生长且 存在蓝色噬菌斑的个体菌落，挑取该蓝色单菌落以及对照未显蓝色单菌落转接于LB液体培 养基中，并在在37^oC、250rpm振条件下，培养5h；

(4)此后，将转接后的菌液离心取上清待用，与此同时，将原始含QS信号分子C4-AHL感 应质粒pSB536菌株过夜活化后以体积比1:100转接到LB培养基中200rpm3h，再将其以1： 100稀释于LB培养基中并添加终浓度为10μM的C4-AHL混匀后，以每孔200μL体积量添加于 96孔黑色微孔板中，再外源添加筛选出阳性结果的上清10μL为实验组，并以不含信号分子 为阴性对照以及含有信号分子为阳性对照，每组设三个重复；将上清液加入96孔黑色微孔 板充分混匀后于37^oC培养箱，静置过夜培养。

(5)最后，利用化学发光成像技术，将该过夜的96孔黑色微孔板在生物发光条件下 拍照比对结果，其曝光时间为10min。结果如图5所示，不含外源添加物和添加随机序列的 噬菌体上清的阳性对照发光强度和490nm吸收光值最强，其他挑选的peptide2-5上清与 不添加信号分子的阴性对照一样不发光。最终，将这些验证后目的噬菌斑扩增后失活，送至 北京金唯智测序公司测序，以进行进一步生物验证分析。

综上所述，利用QS感应自杀菌株可以被QSI抑制拯救的特性，结合噬菌体随机文库 展示技术进行QSI的筛选，解决传统噬菌体文库展示方法中，小分子物质化学结构复杂，难 以固定的难题，可以迅速、大规模地筛选针对各种不同类型QS分子的QSI；同时，根据QSI多 肽的空间结构，可以为研究与QS分子相互作用的天然蛋白三维构象预测提供参考依据。因 此，本专利具有理论与实际运用的多重优点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCELISTING

<110>福建农林大学

<120>一种利用自杀基因快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法

<130>2

<160>2

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>5796

<212>DNA

<213>发光基因序列LuxCDABE

<400>1

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