具有最佳化感官品质的富含蛋白质的微藻生物质组合物

摘要

本发明涉及一种用于确定富含蛋白质的微藻生物质组合物的感官品质的方法，该方法包括测定11种挥发性有机化合物的含量，其中该11种挥发性有机化合物是戊醛、己醛、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃、辛醛、3,5-辛二烯-2-醇(或3-辛烯-2-酮)、3,5-辛二烯-2-酮、壬醛、2-壬烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛和己酸。

说明书

本发明涉及具有最佳化感官特征的小球藻(Chlorella)属的微藻生物质的新颖的 富含蛋白质的组合物，由此使得可将其掺入食物配制品中且并不生成不合意风味；并且还 涉及用于评估小球藻属的微藻生物质的富含蛋白质的组合物的感官特征的方法。

背景技术

本领域普通技术人员熟知的是，小球藻是食品的潜在来源，因为它们富含蛋白质 和其他必需营养素。

它们尤其包含45％的蛋白质、20％的脂肪、20％的碳水化合物、5％的纤维和10％ 的矿物质和维生素。

在替代性食物来源的寻找中，日益考虑使用微藻生物质(且主要是其蛋白质)作为 食品，以满足全球对动物蛋白逐渐增加的需求(如FAO所报道)。

此外，欧盟至今已经受多年的植物蛋白的结构性短缺，近年来累计短缺超过两千 万吨大豆等效物，目前从南美洲进口。

因此设想大量生产某些富含蛋白质的微藻作为减小此“蛋白质短缺”的可能方式。

广泛的分析和营养学研究已显示，这些藻类蛋白等效于常规植物蛋白，或甚至质 量更优。

但是，由于将源自微藻的材料纳入感官上可接受的食物制剂中的高生产成本和技 术困难，微藻蛋白的广泛分布仍处于初级阶段。

已报道来自多个物种的具有高比例蛋白质的微藻生物质(参见贝克尔(Becker，生 物技术研究进展(BiotechnologyAdvances))(2007),25:207-210中的表1)。

另外，现有技术中的多个专利申请案(例如专利申请案WO2010/045368)教示，可能 调节培养条件以进一步增加微藻生物质的蛋白质含量。

然而，在期望以工业方式从所述微藻的生物质产生微藻生物质粉末时，不仅从技 术角度看，并且从所产生组合物的感官特征看，仍存在相当大的困难。

实际上，尽管例如使用以光合作用方式培养于室外池塘中的微藻或使用光生物反 应器产生的藻类粉末是可商购的，但其具有深绿色(与叶绿素有关)和强烈的难闻味道。

即使配制于食物产品中或作为营养补充剂，这些藻类粉末也总是赋予食物产品或 营养补充剂这种在视觉上无吸引力的绿色且具有难闻腥味或海藻味。

另外，已知某些蓝藻物种天然地产生气味性化学分子(例如土臭素(反式-1,10-二 甲基-反式-9-萘烷醇)或MIB(2-甲基异龙脑))，从而产生泥土或发霉气味。

至于小球藻，本领域中通常所接受的描述语为“绿茶”味道，其略微类似于其他绿 色植物粉末(例如粉末状绿色大麦或粉末状绿色小麦)，该味道是源于其高叶绿素含量。

它们的味道通常仅在它们与具有强烈味道的植物或柑橘类果汁混合时才被遮蔽。

因此，仍存在对于具有适宜感官品质的小球藻属的微藻生物质的组合物的未满足 需要，允许将这些组合物用于更多和更多样化食物产品中。

发明概述

申请公司已发现，可通过提供具有最佳化感官特征且特征在于从11种特定化合物 选取的4种挥发性有机化合物的总风味值的富含蛋白质的微藻生物质组合物来满足此需 要。

因此，本发明首先涉及用于确定富含蛋白质的微藻生物质组合物的感官品质的方 法，该方法包括测定11种挥发性有机化合物的含量，这11种挥发性有机化合物是戊醛、己 醛、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃、辛醛、3,5-辛二烯-2-醇(或3-辛烯-2-酮)、3,5-辛二烯-2- 酮、壬醛、2-壬烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛和己酸。

优选地，该微藻生物质包括按生物质的干重计多于50％的蛋白质，并且该微藻属 于小球藻属。

优选地，通过SPME/GC、优选地通过SPME/GC-MS测定这11种挥发性有机化合物中每 种的含量。

优选地，在SPME/GC之后通过对应于这11种挥发性有机化合物中每种的色谱峰的 表面积来测定这11种挥发性有机化合物中每种的含量。

优选地，将这11种挥发性有机化合物中每种的含量、特别是对应于这11种挥发性 有机化合物的色谱峰的表面积与感官品质尤其定义为不可接受或可接受的一种或多种富 含蛋白质的参照微藻生物质组合物进行比较。

本发明还涉及用于定义挥发性有机化合物的分析特征以使得可评估富含蛋白质 的微藻生物质组合物的感官品质的方法，该方法包括：

-构建与微藻生物质组合物相关的第一基质，该第一基质包含具有可接受和不可 接受感官品质的两种对照，其中通过至少15名个体的感官小组评估这些微藻生物质组合物 的感官品质，

-构建与特征在于挥发性有机化合物分析特征的这些相同组合物相关的第二基 质，并且

-使第一基质与第二基质建立关联以产生关系模型，基于该关系模型，具有最佳化 感官特征的组合物可由此由其挥发性有机化合物的分析特征来表征。

优选地，该微藻生物质包括按生物质的干重计多于50％的蛋白质，并且该微藻属 于小球藻属。

优选地，该感官分析的描述语包括：

-下列气味：蔬菜味、醪液味、原汤味、酸败黄油味、乳酪味、粪肥味、发酵味、花生味 以及涂料味；以及

-下列颜色：黄色和绿色。

最后，本发明涉及选择这11种挥发性有机化合物中的具有低嗅觉阈值(即对该感 官小组的成员感知到的总体气味具有主要影响)的4种，以便构建简化模型，这使得可为该 富含蛋白质的微藻生物质组合物给出总体风味值。因此，本发明涉及用于确定富含蛋白质 的微藻生物质组合物的感官品质的方法，该方法包括测定这4种挥发性有机化合物的含量， 这4种有机化合物是3,5-辛二烯-2-醇(或3-辛烯-2-酮)、1-辛烯-3-醇、3,5-辛二烯-2-酮和 (E,E)-2,4-壬二烯醛。

然后此总风味值被表示为3,5-辛二烯-2-醇(或3-辛烯-2-酮)、1-辛烯-3-醇、3,5- 辛二烯-2-酮和(E,E)-2,4-壬二烯醛的个别风味值的总和。

优选地，该微藻生物质包括按生物质的干重计多于50％的蛋白质，并且该微藻属 于小球藻属。

因此当根据本发明的富含蛋白质的微藻生物质组合物的总体风味值较低(优选地 相对于感官上不可接受的参照微藻粉组合物的总体风味值的0至40％)时，它们具有最佳化 感官特征。

本发明还涉及用于选择具有可接受的感官特征的富含蛋白质的微藻生物质组合 物的方法，其特征在于通过上文所述的方法确定感官品质，并且当通过上文所述的方法计 算出的组合物的总风味值在相对于感官上不可接受的参照微藻生物质组合物的总风味值 的0与40％之间时选择该组合物。优选地，该微藻生物质包括按生物质的干重计多于50％的 蛋白质，并且该微藻属于小球藻属。

优选地，该微藻属于小球藻属并且特别是选自由普通小球藻(Chlorella vulgaris)、耐热性小球藻(Chlorellasorokiniana)和原壳小球藻(Chlorella protothecoides)组成的组，并且更特别地为原壳小球藻。

优选地，该微藻生物质包括按生物质的干重计多于50％的蛋白质。

发明详细说明

出于本发明目的，富含蛋白质的微藻生物质组合物在通过感官小组评估断定不存 在损害含有这些微藻生物质组合物的所述食物配制品的感官品质的异味时，具有“最佳化 感官特征”或“最佳化感官品质”。

术语“感官品质”旨在意指食物关于颜色和气味的特性。

这些异味与不合意特定气味性和/或芳香分子的存在有关，这些分子的特征在于 具有对应于产生感觉所需的感官刺激最小值的感知阈值。

然后“最佳化感官特征”或“最佳化感官品质”由感官小组通过在2种感官准则(颜 色和气味)的量表评估中获得最佳评分来反映。

术语“大约”旨在意指某一值±其10％、优选地±其5％。举例来说，“大约100”意指 介于90与110之间、优选地介于95与105之间。

术语“微藻生物质组合物”旨在意指包括至少50干重％、60干重％、70干重％、80干 重％或90干重％微藻生物质的组合物。然而，其他成分可任选地包含于此组合物中。

术语“富含蛋白质”旨在意指在该生物质中蛋白质含量超过按干重计50％，优选大 于55％，仍更优选大于按生物质的干重计的60％、65％和70％。

出于本发明目的，术语“微藻生物质”应以其最广泛解释来理解且理解为表示(例 如)包括多个微藻生物质颗粒的组合物。该微藻生物质是源于微藻全细胞。

一定数量的现有技术文件(例如国际专利申请案WO2010/045368)描述了产生和在 食品中使用富含蛋白质的小球藻微藻生物质的方法。

因此本发明中所讨论的微藻为小球藻属、更特别地原壳小球藻、仍更特别地通过 本领域技术人员本身已知的任一方法失去叶绿素色素(由于在黑暗中实施培养，或由于菌 株发生突变而不再产生这些色素)的小球藻的微藻。

特别地，微藻可非排他性地选自原壳小球藻、凯氏小球藻(Chlorellakessleri)、 微小小球藻(Chlorellaminutissima)、小球藻属、耐热性小球藻、黄绿异小球藻 (Chlorellaluteoviridis)、普通小球藻(Chlorellavulgaris)、瑞氏小球藻(Chlorella reisiglii)、椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)、嗜糖小球藻(Chlorella saccarophila)、凯氏拟小球藻(Parachlorellakessleri)、拜氏拟小球藻(Parachlorella beijerinkii)、大型无绿藻(Protothecastagnora)和桑椹型无绿藻(Prototheca moriformis)。因此，在一很特别的实施例中，微藻生物质组合物为小球藻生物质组合物，并 且特别是原壳小球藻生物质组合物。

本专利申请案WO2010/045368中所描述的发酵工艺由此使得产生一定数量的具 有可变感官品质的微藻生物质组合物。

如本文件中所描述的方法由此使得可选择具有尤其用于食物应用的可接受感官 特征且无需由个体组组织进行此感官评估的富含蛋白质的微藻生物质组合物。

1.通过检测11种挥发性有机化合物定义该感官特征

申请公司已发现，富含蛋白质的微藻生物质组合物的感官特征可通过特定气味性 分子、特别是特定挥发性有机化合物的性质和检测阈值来定义。

实际上，已鉴别出11种挥发性有机化合物，其在富含蛋白质的微藻生物质组合物 中的含量使得可确定所述组合物的感官品质。

这11种挥发性有机化合物是以下各项：戊醛、己醛、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃、辛 醛、3,5-辛二烯-2-醇(或3-辛烯-2-酮)、3,5-辛二烯-2-酮、壬醛、2-壬烯醛、(E,E)-2,4-壬 二烯醛和己酸。

因此，本发明涉及用于确定富含蛋白质的微藻生物质组合物的感官品质的方法， 该方法包括测定11种挥发性有机化合物中每种的含量，这11种挥发性有机化合物是戊醛、 己醛、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃、辛醛、3,5-辛二烯-2-醇(或3-辛烯-2-酮)、3,5-辛二烯-2- 酮、壬醛、2-壬烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛和己酸。

该方法并不排除测定其他挥发性有机化合物的含量。然而，11种挥发性有机化合 物足以确定富含蛋白质的微藻生物质组合物的感官品质。

优选地，这些挥发性有机化合物通过固相微提取(SPME)进行采样且通过气相色谱 GC、尤其通过GC-MS(气相色谱-质谱)进行分析。

从富含蛋白质的微藻生物质组合物的样品通过在SPME纤维存在下将所述组合物 加热足够时间段来提取挥发性部分。

纤维可(例如)选自(非排他性地)下组，该组由以下各项组成：卡博森(carboxen) 和聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)、二乙烯基苯、卡博森和聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)、金 属合金和聚二甲基硅氧烷(PDMS)、纤维(石墨化碳黑)、聚丙烯酸酯、 聚乙二醇(PEG)和PDMS/DVB。

优选地，使用DVB/CAR/PDMS(df50/30μm)纤维。

此处，申请公司推荐使用介于40℃与70℃之间、优选地介于50℃与65℃之间、尤其 大约60℃的温度下进行湿提取技术(水性悬浮)至少10分钟、优选至少15分钟和(例如)介于 15分钟与1小时之间。

优选地，在密封容器中实施此提取步骤。必须使用足够量的样品，例如至少1g，尤 其介于1g和10g之间并且特别是大约2g。

然后将这2g悬浮在含有1gCaCl₂、200μlHCl和2.32μg己醛-d12(内标)的7ml水 中，放置于密封SPME瓶(20ml)中。

然后在与所用SPME纤维类型相容的温度下(例如对于测试中所使用纤维来说介于 220℃与250℃之间、更准确地说230℃)将挥发性有机化合物解吸，且注入分析系统中。

优选地，通过气相色谱GC、尤其通过GC-MS实施分析。

若干GC/MS装置市面有售，例如GC/Mass克拉鲁斯(Clarus)光谱仪(铂金埃尔默公 司(PerkinElmer)，美国)、惠利特－普克德公司(HewlettPackard)6890气相色谱(惠利 特－普克德公司，美国)和耦合到安捷伦5973选择性质量检测器的安捷伦6890N气相色谱。

可用于GC/MS中的离子化方法例如是使用电子轰击离子化(EI)、化学轰击离子化 (CI)、电喷雾离子化、发光放电、场解吸(FD)等的质谱。

更准确地说，此处在来自赛默科技的TSQGC-MS系统的注入器中解吸所提取的挥 发性物质，且然后在CPwax52(60m×0.25mm，0.25μm)管柱上使用氦气在1.5ml/min下分离。

温度程序如下：

-50℃等温持续3分钟，然后

-编程以5℃/分钟升至230℃，

-然后等温持续20分钟。

通过电子轰击(EI)质谱(MS)实施检测并且通过与NIST文库的EI光谱进行比较来 鉴别化合物。

因此，对应于挥发性有机化合物的色谱峰的高度或表面积与所述化合物的量有 关。

术语“峰表面积”旨在意指SPME-GC/MS色谱图中特定离子的曲线下表面积。

优选地，11种挥发性有机化合物中的一者的含量是通过对应于此挥发性有机化合 物的SPME-GC/MS色谱图中特定离子的峰表面积来测定。

尤其相比于参照产物的含量来测定挥发性有机化合物的含量。

因此，总体上，这11种挥发性有机化合物的低总含量与最佳化感官品质相关。与之 相反，这11种挥发性有机化合物的较高总含量与中等或甚至较差或不可接受的感官品质有 关。

举例来说，当至少小于具有不可接受感官品质的组合物的总含量的两倍(例如至 少小2、3或4倍)且在要求最高的实施例中至少小10倍时，具有可接受感官品质的组合物的 总含量是较低的。

2.感官小组的定义和描述语的选择

本发明涉及用于测试富含蛋白质的微藻生物质组合物的感官品质的方法，该方法 包括由一组测试员评估这些感官品质。此评估可尤其通过下文所详述的方法实施。

申请公司还提供用于定义挥发性化合物的分析特征以使得可评估微藻生物质组 合物的感官品质的方法，该方法包括：

-构建与富含蛋白质的微藻生物质组合物相关的第一基质，该第一基质优选地包 括具有可接受和不可接受感官品质的两种对照，其中通过至少15名个体的感官小组评估这 些微藻生物质组合物的感官品质，

-构建与特征在于挥发性有机化合物分析特征的这些相同组合物相关的第二基 质，并且

-使第一基质与第二基质建立关联以产生关系模型，基于该关系模型，具有最佳化 感官特征的组合物可由此由其挥发性有机化合物的分析特征来表征。

形成感官小组以评估各批次微藻生物质组合物、尤其原壳小球藻生物质组合物的 感官特性。

为了评估富含蛋白质的微藻生物质组合物的感官特性，将至少15名个体(例如18 名个体)的一个小组放在一起。

这种“专家小组”使得可进行(定量描述性分析)类型(通常称为“感官特 征”)的分析(斯通(Stone)，H.，赛德尔(Sidel)，J-L，奥利维尔(Olivier)，S，伍尔西 (Woolsey)，A.，辛格尔顿(Singleton)，R.C；(1974)，通过定量描述性分析进行感官评价，食 品技术(FoodTechnology)，28(11)，24-33)。

如由标准NFISO11035:1995阐明的，进行用于产生描述语的研讨以详尽描述富 含蛋白质的微藻生物质组合物的嗅觉特性。

为此目的，将被鉴定为高度异质性的富含蛋白质的微藻生物质组合物批次放置在 于水中3％的溶液中。

每个小组成员评价处于已经提前在水浴中加热至55℃的闭合的玻璃罐中的这一 溶液，并且列出他或她从产物中感觉到的所有气味。

在用于产生描述语的研讨期间，由裁判员列出超过60个术语来描述该富含蛋白质 的微藻生物质组合物的气味。

首先定性地简化该描述语列表(例如：“草地”气味＝“切割草”气味)以获得16个描 述语的列表，那么一些研讨使得该列表能被进一步简化(参见ISO4121:1987)为9 个感官描述语。

优选地，如下表中所呈现的参照产物与每一描述语相关联：

描述语 参照 蔬菜味 3％的混合草 醪液味 5.6％的捣碎马铃薯泥 原汤味 来自MAGGI公司的1KUB OR/2l水 酸败黄油味 2.5％的酸败黄油 乳酪味 2％的戈尔根朱勒干酪(Gorgonzola)皮 粪肥味 2％的粪肥 发酵味 0.75％的胰蛋白胨(酵母提取物) 花生味 1.5％的碾碎花生 涂料味 3％的高度氧化的富含蛋白质的微藻组合物

因为“涂料味”描述语是感官上最有差别的，申请公司推荐使用它作为主要描述语 以建立产生的不同批次的富含蛋白质的微藻生物质组合物的感官归类。

训练该小组

进行各种练习以训练该小组对每个描述语的强度表的使用(NFISO08587:1992、 ISO08586-1:1993、ISO08586-2:1994)。

最后通过用相同批次的富含蛋白质的微藻生物质组合物进行3次特征练习来验证 该小组的表现；因为该小组被认为是有差别的、交感的和可再现的(方法描述于：帕赫斯 (Pagès)，J.，黎(Lê)，S.，哈森(Husson)，F，描述性感官分析中对于表现的统计方法(Une approchestatistiquesdelaperformanceenanalysesensorielledescriptive[A statisticalapproachtoperformanceindescriptivesensoryanalysis]，食品科学 (Sciencesdesaliments)，26(2006)，446-469)，该工具可以用于使用方法进行的 不同批次的富含蛋白质的微藻生物质组合物的感官分析。

感官特征

关于每个描述语的强度表，该小组逐一地分析每种富含蛋白质的微藻生物质组合 物。

关于一个特征研讨(对于1个样品)的调查表如下：

进行方差分析(ANOVA)以评估描述语(对于模型描述语～组合物+小组成员中的组 合效应，与费歇尔测试有关的p值小于0.20的描述语)的辨别能力。

将组合效应解释为描述语的辨别能力：如果没有效应(临界概率>0.20)，则不能根 据此准则辨别不同批次的组合物。

该临界概率越小，则描述语的辨别能力越大。

涂料味描述语突出为用于表征一个批次的可接受性的最显著描述语之一；对于此 描述语获得的等级将用于感官归类。

此归类由此然后用作用于研究挥发性有机化合物的分析特征且选择造成微藻生 物质组合物的较差感官品质的分子的基础。

因此，测定微藻生物质组合物的挥发性有机化合物的特征。如上文所详述，通过本 领域技术人员已知的任一方法且优选地通过SPME/GC-MS进行测定。

挥发性化合物的分析得到具有非常大量峰的很复杂的GC-MS色谱图。借助方差和 线性回归分析，与针对感官基质所获得结果最相关和与涂料气味最相关的挥发性有机化合 物。

因此，最佳化感官特征与挥发性有机化合物的分析特征有关且由其进行表征。

在一个优选实施例中，尤其如上文所定义，考虑所选各种有机化合物相对于参照 组合物的总含量。特别地，考虑对应于所选挥发性有机化合物的色谱峰的总表面积且加以 比较。

3.基于对总体气味具有影响的四种挥发性有机化合物的简化模型

在这个优选实施例中，申请公司发现，可能有利地是针对具有最佳化感官特征的 富含蛋白质的微藻生物质组合物建立一个总风味值，该总值基于选自以上鉴定的11种有机 化合物的4种挥发性有机化合物。

这些挥发性有机化合物是基于其低嗅觉阈值标准来选择。然后根据以下关系建立 该总风味值：

总FV＝ΣFv(3,5-辛二烯-2-醇)，Fv(1-辛烯-3-醇)，Fv(3,5-辛二烯-2-酮)，以及 FV[(E,E)-2,4-壬二烯醛]，

其中FV＝化合物x的浓度/化合物x的嗅觉阈值

如将在下面的实例中所示，相对于感官上不可接受的参照微藻生物质组合物的总 风味值而言具有在0和40％之间的低总风味值的富含蛋白质的微藻生物质组合物必然具有 最佳化感官特征。

从下列实例将更清除地理解本发明，所述实例旨在是说明性和非限制性的。

实例

实例1.感官测试的定义

通过溶于水中(中性介质最好)来测定对富含蛋白质的微藻生物质组合物的感知。

由此形成感官小组以根据以上列出的方法论评估根据专利申请案WO2010/ 045368的传授内容制得的各批次富含蛋白质的微藻生物质的感官特性。

测试了18个批次的微藻生物质：批次11、批次12、批次14、批次33、批次34、批次42、 批次43、批次44、批次54、批次81、批次82、批次83、批次84、批次85、批次92、批次93、批次 111、批次112。

基于高度表征描述语“涂料味”的气味给出了这些批次的此类表征的结果。

数据处理：

使用R软件(自由出售)实施分析：

R2.14.1版(2011-12-22)

版权(C)2011R基础统计学计算(TheRFoundationforStatistical Computing)

ISBN3-900051-07-0

平台：i386-pc-mingw32/i386(32位)

该软件是需要加载含有计算函数的模块的工作环境。

用于处理特征数据的模块如下：

-对于ANOVA：程序包car2.0-12版

-对于线性回归：程序包stats2.14-1版

ANOVA显示出一种产物与下一种产物的显著不同的结果：

ANOVA表(III型检验)

响应：数据[,涂料味]

获得的平均值(副产物)如下：

组合物 平均值 标准差 重复 批次092 0.00 0.00 8 批次111 0.00 0.00 9 批次12 0.10 0.10 10 批次112 0.28 0.12 36 批次43 0.29 0.17 21 批次44 0.33 0.26 12 批次33 0.36 0.36 11 批次11 0.40 0.40 10 批次81 0.96 0.25 23 批次14 1.00 0.50 9 批次82 1.50 0.34 24 批次34 1.64 0.38 22 批次42 1.96 0.25 49 批次93 2.67 0.58 9 批次84 3.23 0.36 22 批次54 4.09 0.41 11 批次83 4.24 0.16 34 9 -->批次85 4.60 0.22 10

图1给出了鉴于小组成员基于此“涂料味”标准给出的等级对不同批次进行的归 类。

因此，这种归类如下(以“涂料味”等级的递增顺序)：

批次92>批次111>批次12>批次112>批次43>批次44>批次33>批次11>批次81>批次 14>批次82>批次34>批次42>批次93>批次84>批次54>批次83>批次85。

对于此涂料味描述语，批次92因此被定义为可接受的感官品质的对照。

对于此涂料味描述语，批次85，就其本身而言，被定义为不可接受的感官品质的对 照。

现已确立此感官归类，可根据本发明有效地分析这些样品的SPME/GC-MS特征以鉴 别使得可定义所产生组合物的品质的参照分子靶。

实例2.通过SPME/GC-MS鉴别与不可接受“涂料气味”感官归类有关的挥发性有机 化合物(VOC)

为实施18个不同批次微藻生物质组合物的SPME/GC-MS分析，如上所示在水性悬浮 液中实施该工艺。

对在水性悬浮液中产物的挥发性化合物的分析

在水性悬浮液中分析挥发性化合物以减小基质影响，并且添加一种内标。

直观地，如图2中所示，GC-MS色谱图仍非常复杂，有数目非常多的化合物。

第一种方法在于比较色谱图、对介于3.2和35.0min之间的所有峰进行积分(TIC， “总离子流”)、并且检查这些“未处理的”结果是否使得能够与感官归类相关联。

色谱图的比较和介于3.2和35.0min之间的所有峰的积分(TIC，“总离子流”)-参见 图3-不能使得能够与感官归类相关联。

由于色谱图的高复杂度，难以在视觉上区分可接受的产物和不可接受的产物。

色谱图的表面积的积分也不能使得可接受的和不可接受的产物之间能够形成明 显差别。

此外，具有未处理的数据的此方法不能使得能够已知哪种或哪些挥发性化合物对 异味或不希望的味道或气味负责，也不能特异地监测它们的外观，也不具有关于它们如何 形成的任何信息。

第二种方法在于通过列出在SPME/GC-MS色谱图上鉴定的显现伴随这些感官归类 的挥发性化合物而添加到上述模型的挥发性有机化合物列表中。

从六个样品的GC-MS-嗅觉测量分析中，某些挥发性化合物突出出来；主要为该富 含蛋白质的微藻生物质组合物的脂质部分的降解所产生的醛，这些醛明显对异味或不希望 的味道或气味负责。

在这第二种方法中，因此决定通过GC-MS-嗅觉测量和不同产物的GC-MS来监测选 择的这些分子中的一些。

为了选择代表性挥发性有机化合物，实施一系列方差分析以仅保留考虑到SPME- GC/MS测量的可变性在组合物之间实际上彼此不同的挥发性有机化合物。

该模型如下：挥发性有机化合物～组合物；仅保留与费歇尔测试有关的临界概率 小于0.05的化合物。

此处给出化合物2-壬烯醛和3,5-辛二烯-2-酮的两个ANOVA实例：

2-壬烯醛

ANOVA表(III型检验)

3,5-辛二烯-2-酮(峰2)

ANOVA表(III型检验)

对于第一种挥发性有机化合物(2-壬烯醛)来说，组合效应似乎是显著的(临界概 率<0.00025)，这意味着考虑到测量可变性在产物之间有显著差异。

对于第二种化合物(3,5-辛二烯-2-酮，峰2)来说，组合效应不显著(临界概率> 0.05)。因此，对于此研究，2-壬烯醛将被保留而3,5-辛二烯-2-酮不会被保留。

在挥发性化合物的此第一选择之后，确立线性回归模型：此处涉及通过每一化合 物逐一阐释“涂料味”变量。

因此，构建尽可能多的化合物模型。该模型如下：涂料味～化合物。

为了选择鉴别为造成观察到的不可接受感官归类(异味)的化合物的最终列表，仅 保留与学生检验(Student'stest)有关的临界概率小于0.05(检验线性回归系数的零度) 的化合物。

与该模型有关的R²是用于量化通过化合物所阐释的可变性百分比的指示。其不会 很高，但较为显著；为此，根据临界概率来选择化合物(以不会忽略对该小组描述的涂料气 味具有较小但显著的影响的化合物)。

系数：

残差标准误差：0.4444，在16自由度下

多元R²：0.7741，调节R²：0.76

统计学F：54.82，在1和16自由度下，临界概率：

1.491x10^-06

系数：

残差标准误差：0.7756，在16自由度下

多元R²：0.3119，调节R²：0.2689

统计学F：7.252，在1和16自由度下，临界概率：0.016

对于这2种化合物，即己醛和3,5-辛二烯-2-酮(峰值1)，临界概率低于0.05，因此 它们与该小组描述的涂料气味相关。

发现该研究的11种化合物与该“涂料味”描述语很好地相关。

所选择的这11种分子在下表中列出：

*嗅觉阈值，根据H.杰伦(Jelen)，色谱科学杂志(JournalofChromatographic Science)，第44卷，2006年8月

**估计值

除非另外指明，该嗅觉阈值是取自www.leffingwell.com/odorthre.htm

如在图4中所示，这些不可接受的产物显现比这些可接受的样品载有更多这11种 挥发性化合物。

统计分析证实了所有这11种分子都是显著的(除了3,5-辛二烯-2-酮在21.24min 处的第二个峰)。

总之，基于“涂料味”标准，通过分析置于水性悬浮液中的产物的挥发性物质，监测 这11种分子(戊醛、己醛、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃、辛醛、3,5-辛二烯-2-醇(或3-辛烯-2- 酮)、3,5-辛二烯-2-酮(2个峰中的第一个)、壬醛、2-壬烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、己酸)使 得有可能区分可接受的产物与不可接受的产物。

建立简化的模型

为了简化该模型，决定保留对根据本发明的富含蛋白质的微藻生物质组合物的总 体气味具有最大影响的化合物，也就是说这些化合物具有极低嗅觉阈值。

这些个体风味值(＝其化合物浓度/嗅觉阈值)在图5中示出。

考虑到每种化合物的浓度和嗅觉阈值，对根据本发明的富含蛋白质的微藻生物质 组合物的感官特性来说四种化合物显现是特别重要的：3,5-辛二烯-2-醇或3-辛烯-2-酮 (花香-橙皮味)、1-辛烯-3-醇(蘑菇-溶剂味、涂料味、蘑菇-油墨味)、3,5-辛二烯-2-酮(两 个峰中的第一个，花香)、以及(E,E)-2,4-壬二烯醛(油腻味)。

这四种化合物的个体描述语将根据本发明的不可接受的富含蛋白质的微藻生物 质组合物的总体感知气味很好地汇集在一起。

因此基于这四种化合物，可确立富含蛋白质的微藻生物质组合物的总风味值：

总风味值＝Σ3,5-辛二烯-2-醇(或3-辛烯-2-酮)、1-辛烯-3-醇、3,5-辛二烯-2- 酮和(E,E)-2,4-壬二烯醛的个体风味值。

如图6所示，此后易于将不同批次的富含蛋白质的微藻生物质组合物归类到两个 家族中：

-可接受的：这些是批次111、92、12、112、43、33、33、81、14、44、82和34；

-不可接受的：这些是批次83、84和85。

应指出，批次85(根据实例1是具有感官上不可接受品质的一个批次)具有100％的 风味值。

因此，可接受的批次确实具有介于相比于不可接受的参照微藻粉组合物(在这种 情况下指批次85)的总风味值的0和40％之间的总风味值。

基于四种感官化合物，批次42、93以及54具有远远大于参照批次85的总风味值。

然而，应当指出批次85被定义为仅基于“涂料味”描述语是不可接受的。

在分析挥发性有机化合物方面，无疑批次42、93和54是特别受挥发性有机化合物 之间的协同作用影响的。

这并不有损于以下事实，即，基于从参照11中对4种挥发性有机化合物进行的这种 选择的简化模型使得可将富含蛋白质的微藻生物质组合物归类到两个相异并且可容易鉴 别的家族中。

附图说明

图1：对于这些组合物中每种针对涂料味描述语获得的平均级别

图2：在水性悬浮液中通过SPME得到的取自样品的挥发性有机化合物的色谱图 (TIC)

图3：这些色谱图(在水性悬浮液中SPME)的区域3.2-35.0min的所有峰的积分

图4：在水性悬浮液中通过SPME得到的取自取样空间的11种所选择化合物的相对 含量

图5：所选择的11种化合物的个体风味值

图6：基于4种化合物的总风味值