检测日本乙型脑炎病毒核酸的试剂盒及应用

摘要

本发明公开了一种检测日本乙型脑炎病毒核酸的试剂盒及应用。所述试剂盒包括：RPA冻干试剂，RPA反应引物，RPA反应探针，缓冲液，镁盐溶液和双蒸水。本发明利用探针对RPA核酸扩增产物进行实时定量检测，检测过程中全程不开盖，污染低，整个反应在38℃恒温条件下进行，5-20分钟内即可通过观察荧光曲线，判读结果。本发明所述试剂盒具有灵敏度高，特异性强，操作简便，反应快速，仪器设备便携，低污染等特点。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测日本乙型脑炎病毒核酸的试剂盒及应用。

背景技术

流行性乙型脑炎是人畜共患的自然疫源性疾病，以三带喙库蚊等吸血昆虫为主要媒介， 是我国夏秋季流行的主要传染病之一。该病是以中枢神经系统病变为主的急性传染病，临床 上急起发病，有高热、意识障碍、惊厥、强直性痉挛和脑膜刺激征等症状，重型患者愈后往 往有后遗症，对儿童危害极大。

乙脑最早于19世纪70年代在日本发现，此后每10年有一次大流行。2008年乙脑疫苗 被纳入计划免疫项目内，发病率得到相对控制，但是由于部分地区免疫接种执行力度不足， 尤其是卫生防疫条件相对差的乡镇，造成乙脑疫苗接种率不高。加之全球气候变暖，生态环 境改变，蚊媒繁多，增加了疫情的控制难度。

目前，我国用于乙脑的实验室检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、血清学检测和分子生 物学技术等。(1)病毒的分离与鉴定法是检验乙脑的经典方法，可以准确获得病毒的主要信息， 如其基因型、是否变异等。但由于病毒载量低、分离困难、工作量大、试验条件要求高、检 测时间长而且影响因素多等，不利于乙脑的快速检测。(2)血清学检测方法有很多，例如补体 结合试验(CFT)、中和试验(NT)、血凝制试验(HI)及酶联免疫吸附试验(ELISA)等，它们多 以检测乙脑患者血清及脑脊液中特异性抗原和抗体为主。补体结合试验、中和试验、血凝抑 制试验是流行病学调查常用的传统方法，但是这三种方法需要采集急性期和恢复期双份血清 进行检测，诊断费时费力，不能达到早期快速诊断的目的。ELISA方法可对特异性乙脑抗体 IgM和IgG进行检测，但是此方法操作复杂，耗时长且灵敏度不高，因此也无法作为最佳的 快速诊断方法。(3)分子生物学检测方法主要采用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)技术， 目前认为RT-PCR是病原学诊断方法中有效的早期诊断方法。近年发展起来的实时荧光PCR， 通过在反应体系中加入SYBRGreenI荧光染料或一条特异性TaqMan荧光探针，能够实现 闭管检测。既保持了传统PCR技术的灵敏性等特点，又避免了假阳性污染，缩短了检测时 间。但是PCR方法需要昂贵的仪器和严格的实验室条件，仅设备优良的大型综合医院及科研 机构才会配备，限制了其应用，使其在疾病防控及社区检测中无法充分发挥作用。

重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)，被认为是可以替代 PCR的核酸检测技术。RPA技术属于恒温扩增的一种，它的反应模式与PCR相似，不同的是 RPA利用酶打开模板链，不需要通过高热变性，在25-43℃的温度范围内即可实现对核酸的扩 增。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结 合蛋白和链置换DNA聚合酶。目前尚未见利用RPA技术检测乙型脑炎病毒的报道。

发明内容

本发明的目的是针对目前乙脑病毒诊断技术存在的缺陷，提供一种新型的基于RPA技术 的检测日本乙型脑炎病毒核酸的试剂盒及应用。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种检测日本乙型脑炎病毒核酸的试剂盒，包括：RPA冻干试剂，RPA反应引物，RPA 反应探针，缓冲液，镁盐溶液和双蒸水；

所述RPA反应引物的序列为：

primerA：TGTGTCTTGACCGTGGTTGGAATGGTGGCAGC；

primerB：GGTTAGCACGACTGTGCTCCCCCCATACAATGC；

所述RPA反应探针的序列为：

5’-GTACGGGATGCTGGAAAAAACCAAAGCAGAT/THF/TCAAGAGCATGTTTGG/C3-spacer/ -3’。

所述RPA冻干试剂由噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY，DNA聚合酶，单链DNA 结合蛋白和dNTPs组成。

所述镁盐溶液为醋酸镁溶液。

所述RPA反应探针中，接近5’端的dT(第31bp)用FAM标记，接近3’端的dT(第33bp) 用BHQ1标记。

所述RPA冻干试剂、缓冲液及镁盐溶液均购自TwistDX公司TwistAmp^TM试剂盒。

所述缓冲液是补液缓冲液(RehydrationBuffer)。

进一步地，所述单链DNA结合蛋白为gp32。

如上所述的检测日本乙型脑炎病毒核酸的试剂盒的应用，包括以下步骤：

(1)配制反应体系：在RPA冻干试剂中加入25-30μL缓冲液，2.0-2.3μL10μMPrimerA， 2.0-2.310μMPrimerB，0.6-1μL10μMRPA反应探针，1-3μL待测样品和10.2-12.2μL双蒸水； 在反应管盖上加镁盐溶液2.3-2.8μL，盖严管盖并离心，使醋酸镁与溶液混合，上下颠倒反应 管使之充分混匀后再次离心；

(2)反应过程：将反应管直接置于荧光检测器内，在37-39℃下孵育，5-20min内观察结果；

(3)结果判定：待测样品中含有日本乙型脑炎病毒核酸的，反应管荧光曲线上升；不含日 本乙型脑炎病毒核酸的，为平滑直线；

所述检测日本乙型脑炎病毒核酸的试剂盒的应用用于非诊断目的。

本发明的原理为：RPA反应探针中携带一个荧光基团和一个荧光猝灭剂，分别与一个胸 腺嘧啶结合，中间由一个四氢呋喃碱基(THF)隔开，当此结构完整时，荧光强度低。当样品 中含有靶序列时，探针与靶序列结合，连接荧光基团和猝灭基团的THF碱基位点会被核酸内 切酶识别并酶解，下游的猝灭基团被释放，荧光强度增强，并可运用荧光检测器(Twista, TwistDX,Cambirdge,UK)对荧光信号进行分析，此荧光检测器同时具备37-39℃孵育的功能。 因此，将各反应组分混合后，直接置于荧光检测器内，在37-39℃下孵育，5-20min内即可观 察结果。

本发明的有益效果为：本发明将实时荧光RPA技术应用于乙型脑炎病毒核酸的检测，既 克服了传统检测方法中灵敏度低、耗时过长的弊端，又解决了q-PCR设备昂贵、实验室要求 高的问题。该检测试剂盒的灵敏度、特异性与q-PCR比较无明显差异，检测过程中全程不开 盖、污染低，整个反应在38℃恒温条件下进行，并且在5-20min内即可判读结果，是目前核 酸诊断技术中最快的检测方法之一。综上所述，本发明所述试剂盒具有灵敏度高，特异性强， 操作简便，反应快速，仪器设备便携，低污染等特点，非常适合应用于出口检疫、食品卫生 以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。

附图说明

图1为用本发明中的RPA检测日本乙型脑炎病毒核酸的灵敏度示意图。

图2为用本发明中的RPA检测日本乙型脑炎病毒核酸的特异性示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种检测日本乙型脑炎病毒核酸的试剂盒及应用，下面结合附图和具体实施 方式对本发明做进一步说明。图中各编号的具体含义如下：1：10⁴copy靶基因，2：10³copy 靶基因，3：10²copy靶基因，4：10copy靶基因，5：5copy靶基因，6：双蒸水。A:日本乙 型脑炎病毒核酸；B：腺病毒；C：血吸虫；D：蜱传；E：双蒸水。

本发明所述试剂盒将RPA技术与探针检测技术结合起来，探针同时携带荧光标记基团 FAM和猝灭基团BHQ1。未反应时探针的荧光强度很低，一旦探针识别靶序列并发生特异性 结合，在核酸内切酶的作用下，下游的猝灭基团被释放，荧光强度会增强。通过TwistDX荧 光检测器对信号进行分析，5-20min内即可判读结果。所述试剂盒的灵敏度、特异性均与实时 荧光PCR相近，灵敏度可达5copies/ul(见图1)，且对腺病毒、血吸虫及蜱传DNA无扩增 反应(见图2)。另外，TwistDX荧光检测器同时兼备38℃恒温孵育及荧光检测的功能，设备 体积小，操作简便，并且该试剂盒检测过程中全程不开盖，可有效避免因污染造成的假阳性。 实施例1

1.引物设计：从Genebank下载核酸序列，选择乙脑病毒保守区段，设计合成具有如下序 列的RPA引物。

primerA：TGTGTCTTGACCGTGGTTGGAATGGTGGCAGC；

primerB：GGTTAGCACGACTGTGCTCCCCCCATACAATGC。

2.探针设计：

5’-GTACGGGATGCTGGAAAAAACCAAAGCAGAT/THF/TCAAGAGCATGTTTGG/C3-sp acer/-3’。接近5’端的dT(第31bp)用FAM标记，接近3’端的dT(第33bp)用BHQ1标记。

引物及探针均由上海生工生物工程有限公司合成。

RPA冻干试剂、缓冲液及镁盐溶液均购自TwistDX公司TwistAmp^TM试剂盒。

3.反应体系：在RPA冻干试剂中加入29.5μL补液缓冲液(RehydrationBuffer)，2.1μL10μM PrimerA，2.1μL10μMPrimerB，0.6μL10μM探针和10.7μL双蒸水。在反应管盖上加醋酸镁 2.5μL，小心盖严管盖并离心使醋酸镁与溶液混合，上下颠倒反应管使之充分混匀后再次离心， 放置于TwistDX荧光检测器内，仪器自动升温至38℃孵育，在5-20min内即可通过观测荧光 曲线进行结果判读。

4.结果判读：待测样品中含有日本乙型脑炎病毒核酸的，反应管荧光曲线上升；阴性对照 (双蒸水)中不含日本乙型脑炎病毒核酸，为平滑直线。

5.从图1的结果分析中可得出，运用RPA方法对日本乙型脑炎病毒核酸进行检测，在10min 以内荧光曲线即出现上升，说明本发明的检测方法反应快速，扩增效率高。并且乙型脑炎病 毒基因组DNA模板量越高，荧光曲线上升的出现时间越早。另外，在模板量仅为5copy时， 仍可得到较高幅度的荧光曲线，而阴性对照为平滑的直线，提示此反应体系检测灵敏度较高， 对于临床诊断有极大的意义。

6.从图2的结果分析中可得出，运用本发明中的RPA对日本乙型脑炎病毒核酸、腺病毒、 血吸虫及蜱传进行检测时，日本乙型脑炎病毒核酸有荧光曲线上升，但腺病毒、血吸虫及蜱 传均无上升，说明本发明只针对日本乙型脑炎病毒核酸进行特异性扩增。

本发明在不脱离其精神和本质特征前提下，可以有多种具体实施方式，应当理解上述实 施例并不限于上述的任何细节，而应该在所附权利要求所定义的精神和范围内被广泛地解释， 因此，所有落在权利要求的边界和范围内的或者与这些边界和范围等价的变化和修改都试图 包含在附加权利要求内。