公开/公告号CN105296453A
专利类型发明专利
公开/公告日2016-02-03
原文格式PDF
申请/专利权人 山东省医药生物技术研究中心;山东建筑大学;
申请/专利号CN201510776880.6
申请日2015-11-12
分类号C12N9/78;C12N15/55;C12N1/21;C12N15/11;C12P17/18;C12R1/465;
代理机构济南圣达知识产权代理有限公司;
代理人张勇
地址 250062 山东省济南市历下区经十路18877号
入库时间 2023-12-18 13:57:21
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-11-02
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N9/78 授权公告日:20160831 终止日期:20171112 申请日:20151112
专利权的终止
2016-08-31
授权
授权
2016-03-02
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N9/78 申请日:20151112
实质审查的生效
2016-02-03
公开
公开
技术领域
本发明属于微生物育种和生物技术领域,具体涉及一株高活性克拉维胺酸氨基乙酰化酶 的棒状链霉菌及其应用。
背景技术
克拉维酸(clavulanicacid)是临床上常用的β-内酰胺酶抑制剂,可与阿莫西林或替卡西 林联合用药,从而增强该抗生素对耐药菌株的抗菌活性,提高临床疗效,具有重要的临床价 值。
克拉维酸是由棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)合成的一种次级代谢产物,工业生 产方式为微生物发酵和提取精制。目前发酵水平是决定克拉维酸生产成本的重要因素,因此 研发克拉维酸高产菌株具有非常重要的工业价值。野生型棒状链霉菌的克拉维酸产量很低, 远远不能满足工业发酵的需要,所以现有的棒状链霉菌工业菌株都是通过多轮诱变筛选得到 的突变株,但是常规诱变育种技术具有随机性和盲目性,导致育种工作效率较低,周期很长, 成为制约发酵工业生产技术提高的一个瓶颈。开发一种高效的棒状链霉菌育种方法并获得高 产菌株具有非常重要的实际应用价值。
克拉维胺酸氨基乙酰化酶是从中间体克拉维胺酸转向克拉维酸合成途径的关键酶,该酶 活性提高时能够提高克拉维胺酸转向合成克拉维酸的催化效率,而酶活性降低时克拉维胺酸 会流向副产物。通过对克拉维胺酸氨基乙酰化酶进行基因改造可以有望获得克拉维酸高产菌, 但由于基因改造的位点难以选择,因此,目前尚未有关于对克拉维胺酸氨基乙酰化酶进行基 因改造而获得克拉维酸高产菌的报道。
发明内容
针对上述现有技术,本发明的目的是提供一株高活性克拉维胺酸氨基乙酰化酶的棒状链 霉菌及其应用。采用定向进化的策略,对克拉维胺酸氨基乙酰化酶进行定向改造,并配合高 通量筛选技术获得高活性克拉维胺酸氨基乙酰化酶,进而得到克拉维酸高产菌株。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的一个方面涉及一种高活性克拉维酸氨基乙酰化酶,其具有如SEQIDNO.1所示 的氨基酸序列,或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基 酸序列。
本发明的另一方面涉及编码上述高活性克拉维酸氨基乙酰化酶的基因;具体的,该基因 的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
本发明的再一方面涉及一种棒状链霉菌,其含有上述编码高活性克拉维酸氨基乙酰化酶 的基因。
本发明的再一方面涉及一株高活性克拉维胺酸氨基乙酰化酶的棒状链霉菌,该菌株具体 为棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)B02-246。已于2015年10月13日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号,中国科学院微生物研究所),保藏编号为CGMCCNO.11484。
本发明的棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)B02-246与工业菌株棒状链霉菌B02相 比,克拉维胺酸氨基乙酰化酶的基因有4个碱基发生改变,分别是第1222位由A变为G, 第1229位由A变为T,第1239位由C变为A,第1240位由C变为G。其中第1222位碱基 突变引起密码子由AAG变为GAG,氨基酸由赖氨酸变为谷氨酸;第1229位碱基突变引起密 码子由GAC变为GTC,氨基酸由天冬氨酸变为缬氨酸;第1239位碱基突变引起密码子由 CTC变为CTA,是同义突变,氨基酸没有变化,都是亮氨酸;第1240位碱基突变引起密码 子由CAG变为GAG,氨基酸由谷氨酰胺变为谷氨酸。
本发明的另一目的是提供一种菌剂,该菌剂的活性成分为棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)B02-246。
所述棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)B02-246和/或所述菌剂在制备克拉维酸中 的应用也属于本发明的保护范围。
进一步的,所述棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)B02-246和/或所述菌剂在制备β- 内酰胺酶抑制剂中的应用也是本发明的保护范围。
本发明的再一个目的是提供该棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)B02-246的制备方 法,采用连续易错PCR方法体外突变克拉维胺酸氨基乙酰化酶的基因,以已有的克拉维胺酸 氨基乙酰化酶缺失菌株为出发菌,通过接合转移技术建立含有克拉维胺酸氨基乙酰化酶基因 的突变体库,筛选获得正突变株,最后通过发酵验证、传代培养获得遗传性状稳定的棒状链 霉菌(Streptomycesclavuligerus)B02-246。
本发明还有一个目的是提供一对用于体外突变克拉维胺酸氨基乙酰化酶基因的易错PCR 的引物,其引物序列分别如序列表中SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。
上游引物GcasForward序列:GCTCTAGAGCCCGCAGTGTGATGAAG(SEQIDNO.3);
下游引物GcasReverse序列:GCGAATTCGGGTGGCGTCTCCGCTCACG(SEQIDNO.4)。
所述连续易错PCR方法体外突变克拉维胺酸氨基乙酰化酶的基因的具体方法为:
(1)PCR反应体系:模板DNA2ul、PCR缓冲液5ul、TaqDNA聚合酶1ul、dATP1~ 3ul、dTTP1~3ul、dGTP1~3ul、dCTP1~3ul、上游引物2ul、下游引物2ul、25mMMgCl21~8ul、5mMMnCl20~1ul,补加超纯水至50ul。
(2)PCR条件:预变性97℃10分钟,变性97℃30秒,退火52~62℃30秒,延伸72℃ 2分钟,循环35次,终延伸10分钟。
第1次PCR的模板DNA来源于工业菌株棒状链霉菌B02,第2次PCR及后续PCR的模 板DNA采用上次PCR产物。
所述含有克拉维胺酸氨基乙酰化酶基因的突变体库的构建方法,具体步骤如下:
(1)将连续易错PCR产物用XbaI和BamHI进行双酶切,凝胶琼脂糖电泳分离后回收 酶切产物,并与同样双酶切的穿梭载体pSET152进行连接,转化大肠杆菌DH5a,挑取转化 子提取质粒进行双酶切鉴定,得重组pSET152;
(2)采用接合转移技术将重组pSET152转入工业菌株棒状链霉菌B02的克拉维胺酸氨 基乙酰化酶基因缺失菌株,得到一系列接合子,即构建得到克拉维胺酸氨基乙酰化酶基因的 突变体库。
筛选正突变株所采用的方法为:采用平板透明圈法,对突变体库中的接合子进行高通量 筛选。
本发明的有益效果:
(1)本发明首次采用定向突变的方式筛选得到克拉维胺酸氨基乙酰化酶基因的突变体, 通过连续易错PCR在体外对克拉维胺酸氨基乙酰化酶基因进行突变,同时通过高通量筛选方 法获得克拉维酸高产菌株B02-246,克拉维酸合成水平比工业菌株棒状链霉菌B02高1.3倍,可 应用于工业化发酵生产,具有重要的经济价值。
(2)本发明的棒状链霉菌工程菌的制备方法,突变工作的效率高,针对性非常强,降低 了诱变育种的随机性和盲目性,符合工业生产菌株的育种需要。
附图说明
图1是平板透明圈法筛选棒状链霉菌接合子;
图2是B02-246与B02的克拉维酸发酵水平比较。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明,应该说明的是,下述说明仅是为了解释本发明, 并不对其内容进行限定。
实施例1:连续易错PCR获得含突变碱基的目的基因
采用连续易错PCR在体外对克拉维胺酸氨基乙酰化酶基因进行突变。具体为:
1.易错PCR的引物为:
上游引物GcasForward序列:GCTCTAGAGCCCGCAGTGTGATGAAG;
下游引物GcasReverse序列:GCGAATTCGGGTGGCGTCTCCGCTCACG。
2.PCR体系:模板DNA2ul、PCR缓冲液5ul、TaqDNA聚合酶1ul、dATP1~3ul、dTTP 1~3ul、dGTP1~3ul、dCTP1~3ul、上游引物2ul、下游引物2ul、25mMMgCl21~8ul、 5mMMnCl20~1ul,补加超纯水至50ul。
3.PCR条件:预变性97℃10分钟,变性97℃30秒,退火52~62℃30秒,延伸72℃2 分钟,循环35次,终延伸10分钟。
第1次PCR模板DNA来源于工业菌株棒状链霉菌B02,第2次PCR及后续PCR的模 板DNA采用上次PCR产物。
PCR产物直接送测序,结果显示:当PCR体系中dATP1ul、dTTP1ul、dGTP2ul、dCTP 2ul、上游引物2ul、下游引物2ul、25mMMgCl26ul、5mMMnCl20.5ul,PCR退火温度为 58℃,2次连续PCR时错配碱基数为4~8,突变频率比较适合进行定向改造。
实施例2:棒状链霉菌克拉维胺酸氨基乙酰化酶突变体库的构建
将实施例1中的连续易错PCR产物用XbaI和BamHI进行双酶切,凝胶琼脂糖电泳分离 后回收酶切产物,并与同样双酶切的穿梭载体pSET152(pSET152为现有技术中的常规质粒) 进行连接,转化大肠杆菌DH5a,挑取转化子提取质粒进行双酶切鉴定。
采用接合转移技术将重组pSET152转入棒状链霉菌菌株B02的克拉维胺酸氨基乙酰化酶 基因缺失菌株(该基因缺失菌株为以菌株B02为出发菌株通过常规基因敲除技术得到),得 到一系列接合子,构建克拉维胺酸氨基乙酰化酶基因的突变体库。
实施例3:接合子的平板筛选
利用带β-内酰胺酶的大肠杆菌作为指示菌,用含氨苄青霉素的LA制作筛选平板,采用 平板透明圈法对棒状链霉菌接合子(实施例2制备)进行筛选。首先将6897个接合子分别转 接到BSCA固体平板上25℃培养6天,然后挖取6mm直径接合子琼脂块,放置在筛选平板 上,37℃培养16小时,测量透明圈直径(见图1)。同时采用菌株B02作为对照,透明圈直 径越大表示合成克拉维酸的能力越大,共选出正突变株564株,继续培养至产孢并分别编号 B02-1~B02-564。
将564个正突变株的孢子分别稀释至105个/ml,取100ul涂布BSCA固体平板上,25℃ 培养6天,进行平板复筛,最后选出克拉维酸高产突变株120株,继续培养至产孢。
其中,用于制备BSCA固体平板的培养基组成为:麦芽提取物8g/L、酵母提取物4g/L、 葡萄糖4g/L、琼脂粉15g/L、pH8.5、0.15MPa灭菌30min。
麦芽提取物和酵母提取物均为常规的市售产品。
实施例4:突变株的摇瓶发酵筛选
将实施例3选出的120株突变株的孢子分别稀释至107个/ml,按2%(V/V)接种于液体 培养基中,发酵摇瓶,25℃、200rpm振荡培养6天,3000rpm离心10min吸取上清液,用 HPLC法检测克拉维酸的发酵水平。结果显示92株突变株发酵液中克拉维酸含量显著高于出 发菌株,复筛的正突变率达到76.7%,其中8株突变菌的发酵水平提高幅度超过15%,结果 如表1。最终筛选获得一株克拉维酸发酵水平比工业菌株B02高1.3倍的突变菌株(结果见 图2),将此突变株命名为B02-246。
液体培养基的组成为:大豆蛋白提取物20g/L、酵母提取物8g/L、麦芽糊精15g/L、磷 酸氢二钾0.5g/L、pH7.5、0.15MPa灭菌30min。
其中,大豆蛋白提取物和酵母提取物均为常规的市售产品。
摇瓶发酵时,每250ml三角瓶装30ml液体培养基。
表1突变株摇瓶发酵的克拉维酸产量结果(g/L发酵液)
实施例5:高产菌株B02-246的遗传稳定性考察
将高产菌株B02-246的孢子悬液稀释涂布在BSCA固体培养基上25℃培养6天,分离株 B02-246的单孢菌落并进行扩大培养,连续分离单孢六次,每次扩大培养,并进行摇瓶发酵 验证克拉维酸发酵水平,结果见表2,结果表明高产菌株B02-246具有较好的遗传稳定性, 满足工业生产的需求。
表2B02-246不同传代次数的克拉维酸发酵水平(g/L发酵液)
实施例6:克拉维胺酸氨基乙酰化酶突变体的DNA序列测定
提取工程菌B02-246的基因组DNA作为模板,以GcasForward和GcasReverse为引物 进行高保真PCR扩增,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离并回收,与pCR-Blunt载体连接转化 大肠杆菌DH5a,挑取数个阳性克隆进行DNA测序。B02-246中克拉维胺酸氨基乙酰化酶基 因序列如序列表中SEQIDNO.2所示,B02中克拉维胺酸氨基乙酰化酶基因序列如序列表中 SEQIDNO.5所示。结果显示,B02-246中克拉维胺酸氨基乙酰化酶基因与野生型基因相比有 4个碱基发生改变,分别是第1222位由A变为G,第1229位由A变为T,第1239位由C 变为A,第1240位由C变为G,引起3个氨基酸变化,分别是K408E,D410V和Q414E。 B02-246中克拉维胺酸氨基乙酰化酶的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示,B02中克 拉维胺酸氨基乙酰化酶的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.6所示。
将菌株B02-246于2015年10月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(简称CGMCC,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所), 保藏编号为CGMCCNO.11484。
实施例7:发酵培养高产菌株B02-246生产克拉维酸
1.种子液培养:
将菌株B02-246的孢子接种到液体种子摇瓶,25℃200rpm振荡培养2天,然后接种到 200L种子罐,25℃培养2天获得种子液;同时以出发菌株B02作为对照。
2.发酵培养:
将种子液按5%(体积分数)接种量接种到5m3发酵罐,通气量1.5VVM,搅拌转速120 rpm,25℃发酵培养6天,放罐检测克拉维酸的发酵水平。
种子培养和发酵培养的液体培养基的组成为:大豆蛋白提取物20g/L、酵母提取物8g/L、 麦芽糊精15g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、pH7.5、0.15MPa灭菌30min。
其中,大豆蛋白提取物和酵母提取物均为常规的市售产品。
3.克拉维酸含量测定:
采用HPLC法测定发酵液中克拉维酸的含量,结果为:菌株B02-246发酵液中克拉维酸 含量为4.53g/L,菌株B02发酵液中克拉维酸含量为3.62g/L。
机译: 由克拉维酸盐和胺,克拉维酸和胺盐制备克拉维酸
机译: 克拉维酸叔丁胺盐及其在克拉维酸制备中的应用
机译: 克拉维酸二胺盐,其合成方法(变体),克拉维酸或其药理学上可接受的盐的合成方法,其盐的克拉维酸的纯化方法