一种具有增强免疫功能浒苔多糖的制备方法及应用

摘要

本发明提供了一种具有增强免疫功能浒苔多糖的制备方法及其应用。该浒苔多糖的制备方法包括浒苔粗多糖提取、浒苔粗多糖脱蛋白、高速离心法去除小分子杂质、高速离心法去除小分子杂质、氧化法脱去色素以及Sephacryl-300凝胶层析柱纯化多糖等步骤。本发明提供了一种方法简单、性能稳定、成本低廉、药用价值大，能提高免疫力等特点的一种浒苔多糖其制备方法。尤其是采用提取、纯化的制备方法，以及体外免疫活性筛选和免疫抑制动物实验，获得浒苔多糖及其提炼方法，阐明了此种浒苔多糖可增强免疫抑制小鼠的免疫功能的作用，为有效地开发了浒苔的药用价值和用途，治理环境污染，降低清理成本，提高社会和经济效益提供了新方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种具有增强免疫功能浒苔多糖的制备方法及应用。

背景技术

浒苔(Enteromorphaprolifera)是一种大型药食兼用的藻类植物，属绿藻门石莼目石莼科，在全球范围内分布广泛，我国则主要分布于东南沿海地区。该藻生长和繁殖性能非常强，其生长需要大量的空间，使得海洋中的其它需光藻类生物无法存活，造成大量藻体死亡；浒苔类植物的死亡可使水体的富营养化，其降解过程能大量消耗氧气，导致水体中溶氧快速下降，鱼类因缺氧而窒息死亡；水体富营养化还能造成其它藻类植物大量繁殖，影响沿海的自然景观。因此，浒苔大量增殖将对海洋生态系统造成严重破坏。浒苔多糖的获得和应用有效地开发了浒苔的药用价值和用途，治理了环境污染，降低了清理成本，提高了社会和经济效益。

经研究发现，浒苔营养丰富，含有多种活性功能成分，药用价值高，开发潜力大。浒苔多糖是其主要活性成分，具有增强免疫功能生物学活性。由于浒苔多糖结构非常复杂，而且对于不同提取和纯化分离工艺，所得多糖结构与组分之间也存在很大差异，如何提取纯化获得具有增强免疫功能的浒苔多糖的制备方法一直是个研究热点问题。

发明内容

本发明公开了一种具有增强免疫功能浒苔多糖的制备方法及应用，该方法从浒苔中提取的多糖应用于免疫抑制小鼠可显著改善环磷酰胺诱导的小鼠免疫抑制增强免疫活性。此制备方法简单、性能稳定、成本低廉、药用价值大，对于促进浒苔资源的综合利用、天然药物和保健品的研究和开发以及海洋生态保护具有十分重要的意义。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种具有增强免疫功能浒苔多糖的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

1)浒苔粗多糖提取：称取浒苔干品，加入20倍水，于90℃提取三次，每次2h，纱布过滤，取浸提液旋转蒸发浓缩到原体积1/6，再加入3倍体积95％乙醇，4℃过夜，得白色絮状沉淀，冷冻干燥，即为浒苔粗多糖；

2)浒苔粗多糖脱蛋白：将浒苔粗多糖溶于蒸馏水，于60℃水浴中加热溶解，冷却后调整溶液pH值到6.5，加入木瓜蛋白酶，浒苔粗多糖终浓度为3％，50℃恒温水浴2.5h后，将溶液于90℃，加热5min，灭活木瓜蛋白酶，冷却至室温后，加入1/4V的Sevage试剂、即氯仿：正丁醇为4：1的试剂，反复震荡萃取30min后，3000r/min离心15min，溶液分层，最上层是多糖溶液，中间凝胶层即为变性的蛋白质，最下层为有机溶剂，收集最上层溶液，反复多次萃取，直到没有凝胶层为止，减压浓缩除掉上清液中有机试剂；

3)高速离心法去除小分子杂质：先用浓氨水调整多糖液pH至8.0，再向其中加入10％的过氧化氢溶液同时快速搅拌，直至溶液变为淡黄色，50℃以下保温2h脱色素，降至室温，将多糖溶液于6000r/min离心15min，去除小分子杂质；

4)氧化法脱去色素：将多糖溶液装入阻滞分子量为3500Da的透析袋里，用蒸馏水透析，2h后更换一次透析液，4℃过夜；次日用8000Da的聚乙二醇浓缩糖液至1/3体积后，反复用蒸馏水清洗透析袋表面，收集浓缩的多糖溶液，低温干燥，得浒苔多糖的粗制品；

5)Sephacryl-300凝胶层析柱纯化多糖：将浒苔多糖的粗制品加热溶解于蒸馏水中，多糖浓度为50mg/mL，打开Sephacryl-300层析柱打开水口，待液面几乎于柱床平齐时，关闭出水口，轻缓加入5mL多糖溶液，防止冲击基质，再次打开开关，待样品刚好与柱床相平时，关闭阀门，用少量蒸馏水冲洗基质表面及层析柱管壁，打开阀门，待液面于柱床平齐时，关闭阀门，缓慢加入蒸馏水，充满整个层析柱后，安装层析装置，开始洗脱，其洗脱速度为1min/mL，每管洗脱3min，共收集40管后，将含有多糖的洗脱液收集一起，减压浓缩后，低温冻干，即为EP。

2、根据权利要求1所述的浒苔多糖的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：在第5)步之后对其进行乙醇分级纯化：将EP溶液加入无水乙醇，使其乙醇终浓度为40％，4℃过夜沉淀多糖，3000r/min离心15min后，分离上清液和沉淀，低温冻干沉淀即为EP1；再向上清液中加入无水乙醇，使其终浓度达到60％后，4℃过夜沉淀多糖，6000r/min离心15min，再次分离上清液和沉淀，低温冻干沉淀即为EP2；再向剩余的糖液中加入无水乙醇，待乙醇浓度达到80％时，4℃过夜收集沉淀，低温冻干即为EP3。

3、根据权利要求1或者2所述的浒苔多糖的应用。

经测定，本发明的分离、纯化的浒苔多糖EP2含糖醛酸22.60％，硫酸根20.49％。单糖组成为鼠李糖76.7mg/kg，半乳糖21.5mg/kg，葡萄糖10.3mg/kg，木糖9.5mg/kg。本发明提供一种方法简单、性能稳定、成本低廉、药用价值大，能提高免疫力等特点的一种浒苔多糖其制备方法。尤其是采用提取、纯化的制备方法，以及体外免疫活性筛选和免疫抑制动物实验，获得浒苔多糖及其提炼方法，阐明了此种浒苔多糖可增强免疫抑制小鼠的免疫功能的作用，为有效地开发了浒苔的药用价值和用途，治理环境污染，降低清理成本，提高社会和经济效益提供了新方法。

附图说明

图1：浒苔多糖组分对T、B淋巴细胞增殖影响

其中：A、多糖组分对T淋巴细胞增殖的影响；B、多糖组分+ConA对T淋巴细胞增殖的影响C、多糖组分对B淋巴细胞增殖的影响；D、多糖组分+ConA对B淋巴细胞增殖的影响。其中：A、C组中刺激组与空白组比较##p＜0.01，多糖组与空白组比较*p＜0.05，**p＜0.01；而B、D组中刺激组与空白组比较##p＜0.01；协同组与刺激组比较*p＜0.05，**p＜0.01

图2：浒苔多糖组分对细胞增殖影响

其中：A、多糖组分对细胞增殖的影响；B、多糖组分+LPS对细胞细胞增殖的影响，其中：A组中刺激组与空白组比较##p＜0.01，多糖组与空白组比较*p＜0.05，**p＜0.01；而B组中刺激组与空白组比较##p＜0.01；协同组与刺激组比较*p＜0.05，**p＜0.01

图3：浒苔多糖组分对细胞分泌NO的影响作用

其中：A、多糖组分对Mφ细胞分泌NO的影响；B、多糖组分+LPS对Mφ细胞分泌NO的影响。其中：A组中刺激组与空白组比较##p＜0.01，多糖组与空白组比较*p＜0.05，**p＜0.01；而B组中刺激组与空白组比较##p＜0.01；协同组与刺激组比较*p＜0.05，**p＜0.01

图4：浒苔多糖在T淋巴细胞中的分布(100×)

其中：A空白对照组，BEP2处理组，CConA处理组，DEP2+ConA处理组。

图5：浒苔多糖在B淋巴细胞中的分布(100×)

其中：A.空白对照组；B.EP2处理组；C.LPS处理组；D.EP2+LPS处理组

图6：浒苔多糖在Mφ细胞中的分布(40×)，

其中：A.空白对照组；B.EP2处理组；C.LPS处理组；D.EP2+LPS处理组组

图7：浒苔多糖对T淋巴细胞RNA合成的影响(100×)。

其中：A.空白对照组；B.EP2处理组；C.ConA处理组；D.ConA+EP2处理组

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步阐释和说明。

1)本发明所述浒苔多糖的制备方法详细说明。

大致而言，浒苔多糖的分离提取纯化包括如下步骤，脱脂干燥→90℃水提→过滤→浓缩→乙醇沉淀→脱蛋白→去小分子杂质→脱色素→纯化→真空干燥→多糖纯品。具体到本发明是按照以下的步骤进行的。

(1)浒苔粗多糖的提取：称取适量浒苔干粉，按固液比1：20加入单蒸水，90℃恒温浸泡2h，纱布过滤，得到滤液，反复提取2次，将上述滤液合并(体积为V)，旋转蒸发浓缩至至1/4V(体积为V1)，缓慢加入3V1乙醇(95％)，同时快速搅拌，防止杂质絮凝，4℃冰箱静置过夜，次日将醇沉提取物在3500r/min离心15min，弃上清液，合并沉淀，低温真空干燥，得到浒苔粗多糖。

(2)浒苔粗多糖的脱蛋白：将浒苔粗多糖溶于蒸馏水，于60℃水浴中加热溶解，冷却后调整溶液pH值到6.5，加入木瓜蛋白酶，溶液中浒苔粗多糖终浓度为3％，50℃恒温水浴2.5h后，将溶液于90℃，加热5min，灭活木瓜蛋白酶，冷却至室温后，加入1/4V的Sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)，反复震荡萃取30min后，3000r/min离心15min，溶液分层，收集最上层溶液，反复多次萃取，直到没有凝胶层为止，减压浓缩除掉上清液中有机试剂。

(3)浒苔多糖中色素及小分子杂质去除：先用浓氨水调整多糖液pH至8.0，再向其中加入10％的过氧化氢溶液同时快速搅拌，直至溶液变为淡黄色，50℃以下保温2h脱色素，降至室温，将多糖溶液于6000r/min离心15min，去除小分子杂质。

(4)浒苔多糖透析除盐：将多糖溶液装入阻滞分子量为3500Da的透析袋里，用蒸馏水透析，2h后更换一次透析液，4℃过夜。次日用8000Da的聚乙二醇浓缩糖液至1/3体积后，反复用蒸馏水清洗透析袋表面，收集浓缩的多糖溶液，低温干燥，得浒苔多糖的粗制品。

(5)浒苔多糖纯化：将浒苔多糖的粗制品加热溶解于蒸馏水中，多糖浓度为50mg/mL，打开Sephacryl-300层析柱打开水口，待液面几乎于柱床平齐时，关闭出水口，轻缓加入5mL多糖溶液，防止冲击基质，再次打开开关，待样品刚好与柱床相平时，关闭阀门，用少量蒸馏水冲洗基质表面及层析柱管壁，打开阀门，待液面于柱床平齐时，关闭阀门，缓慢加入蒸馏水，充满整个层析柱后，安装层析装置，开始洗脱，其洗脱速度为1min/mL，每管洗脱3min，共收集40管后。利用硫酸-苯酚法测定各管溶液的多糖含量，绘制洗脱曲线，将含有多糖的洗脱液收集一起，减压浓缩后，低温冻干，即为EP。

(6)浒苔多糖分级沉积：将EP溶液加入无水乙醇，使其乙醇终浓度为40％，4℃过夜沉淀多糖，3000r/min离心15min后，分离上清液和沉淀，低温冻干沉淀即为EP1；再向上清液中加入无水乙醇，使其终浓度达到60％后，4℃过夜沉淀多糖，6000r/min离心15min，再次分离上清液和沉淀，低温冻干沉淀即为EP2；再向剩余的糖液中加入无水乙醇，待乙醇浓度达到80％时，4℃过夜收集沉淀，低温冻干即为EP3。

经检验，按照本发明所述方法制备和分级提取的浒苔多糖(EP)及乙醇分级后的浒苔多糖(EP1、EP2、EP3)的各组分的总糖含量、糖醛酸含量、蛋白质含量和硫酸根含量如下表所示。

2)本发明制备的浒苔多糖免疫活性组分的筛选及其对淋巴细胞免疫增值能力影响

为了筛选出按照上述方法制备的各浒苔多糖组分中具有免疫活性的组分，采用体外实验方法，先将BALB/c小鼠T、B、Mφ细胞分离，进而进行细胞培养，检测浒苔多糖组分对T、B、Mφ这三种重要淋巴细胞增殖能力的影响。我们得出如下结论：浒苔多糖EP2显著促进B淋巴细胞增殖与母细胞化，有促进T淋巴细胞和巨噬细胞增殖的趋势。采用环磷酰胺诱导建立了小鼠免疫抑制模型，EP2进行灌胃。发现EP2能显著改善免疫抑制小鼠免疫器官指数、巨噬细胞吞噬功能、迟发性超敏反应、淋巴细胞转化功能、相关细胞因子及抗体水平，以及T细胞亚群的稳态。EP2可望成为一种无毒副作用的免疫增强剂，浒苔多糖具有重要的开发应用前景。

(1)EP、EP1、EP2和EP3四种浒苔多糖组分对T、B和淋巴细胞和Mφ细胞增殖活性的作用(结果如图1、2所示)

每种细胞均设空白对照组、多糖组、丝裂原组以及多糖+丝裂原组，各组体系均为200μL，每组中均加入处理好的T、B淋巴细胞或Mφ细胞悬液100μL，空白对照用RPMI-1640完全培养液补充到200μL；丝裂原组分别加入10μLConA或LPS，再用RPMI-1640培养液补足到200μL，ConA或LPS终浓度分别为5μg/mL或10μg/mL；多糖组由EP、EP1、EP2和EP3四种多糖组分构成，每个组分均设6个浓度梯度，多糖终浓度分别为50、100、200、300、400、500μg/mL；浒苔多糖+丝裂原组由EP、EP1、EP2和EP3四种多糖组分和丝裂原(ConA或LPS)组成，每个多糖组设6个浓度梯度，每种多糖组分终浓度分别为50、100、200、300、400、500μg/mL，ConA或LPS终浓度分别为5μg/mL和10μg/mL。每个孔均设三个重复，于37℃，5％CO2条件下孵育48h，在细胞培养结束前4h，向所用孔中都加入MTT20μL，吸弃上清，每孔加入100μLDMSO，轻微震荡10min，于读取570nm下吸光值。结果显示：不同多糖组分促进T淋巴细胞增殖的效果存在差异，EP2效果最显著(p＜0.05)。浒苔多糖各组分均能显著促进B淋巴细胞增殖，EP2作用效果最显著(p＜0.05)，EP3次之(p＜0.05)，EP1作用效果不明显，即EP2﹥EP3﹥EP﹥EP1。

(2)4种浒苔多糖组分对细胞NO分泌的影响(结果如图3所示)

每种多糖组分均设空白对照组、多糖组、撕裂原组以及多糖+丝裂原组，各组体系均为200μL，各组体系组成均参考3.3.4，放置37℃，5％CO2条件下孵育24h，每孔吸取50μL细胞上清液，依次加入室温下GriessReagentI和GriessReagentII溶液各50μL，于540nm处测出其相应的吸收光，通过NO的线性回归曲线计算出细胞NO释放量，从而可以评价多糖对巨噬细胞活化作用。将各组数据利用SPSS2.0软件处理，用LinearRegression方法分析各组数据的线性回归方程，以R2表示方程的相关系数。结果表明：，所有的多糖组分均可以促进Mφ细胞分泌NO，而且效果均极其明显(p＜0.01)，呈现一定量效关系，其中EP2在500μg/mL的作用效果最佳，比其他组分作用效果明显。

(3)淋巴细胞和Mφ细胞中多糖的分布(PAS染色法)

调整T和B细胞悬液，使其浓度均达到1×107个/mL，向24孔细胞培养板中分别加入100μL细胞悬液，每种细胞均设空白对照组、浒苔多糖组(EP2终浓度400μg/mL)、丝裂原刺激组(ConA或LPS终浓度分别为5μg/mL和10μg/mL)、浒苔多糖+丝裂原组(EP2终浓度400μg/mL，ConA或LPS终浓度分别为5μg/mL和10μg/mL)，用RPMI-1640完全培养基将每孔补足到500μL，于37℃，5％CO2条件下孵育48h后，吹打吸出细胞悬液，离心洗涤，制作涂片，10％甲醛固定20min，洗涤晾干涂片，按照多糖染色(PSA)试剂盒的说明书染色，封片、镜检。

将200μL巨噬细胞悬液(3×106个/mL)吸入装入灭菌玻片的六孔板中，每孔体系为1mL，均设为设空白对照组、浒苔多糖组(EP2终浓度400μg/mL)、丝裂原刺激组(LPS终浓度为10μg/mL)、浒苔多糖+丝裂原组(EP2终浓度400μg/mL，LPS终浓度为10μg/mL)，用RPMI-1640完全培养基将每孔补足到1mL，37℃，5％CO2培养48h，用PBS淋洗细胞爬片，再用甲醛溶液(10％)固定细胞20min，洗涤晾干细胞爬片按照多糖染色(PSA)试剂盒的说明书染色，封片、镜检。

B、D组为多糖组，且细胞中染色较其他俩组深，是由于细胞内的多糖可以被西弗式染液染成桃红色，从图4、5中可以说明，多糖作为一种有益的营养物质被细胞吸收到细胞内部，也说明多糖对于细胞的作用部位也在细胞内，从而推翻了关于多糖是通过细胞膜作用于淋巴细胞这个猜想，但是对于进入到细胞内部的具体作用还需要进一步深入研究。

(4)淋巴细胞和Mφ细胞中RNA的检测(甲基绿-派洛宁染色法)

取T、B淋巴细胞、Mφ细胞悬液，方法同(3)一样，制作细胞涂片与爬片，10％多聚甲醛固定20min后，用甲基绿-派洛宁染色30min，大量的单蒸水冲洗干净后，封片、镜检，观察T、B淋巴细胞中RNA的分布。

通过图6、7可知，加入多糖组的B淋巴染色要比对照组稍深，说明多糖能够增强B淋巴细胞中RNA的含量，能够加强其代谢合成，而加入多糖协同刺激T、B淋巴细胞时，可以发现T、B淋巴细胞明显要比刺激组的深，说明增强刺激剂对淋巴细胞的刺激作用，增强淋巴细胞中RNA的合成，从而可能增强其相应的免疫功能。

3)EP2在免疫抑制小鼠上的应用

(1)将60只Babl/c小鼠(SPF级，体重20±2g，6-8w)随机分成6组，即空白对照组、免疫抑制模型组、EP2低剂量治疗组、EP2高剂量治疗组。在免疫抑制模型制备第三天，各处理组的小鼠进行多糖灌胃，每天1次，为期14d，EP2低剂量治疗组按照50mg/kg/d灌胃EP2；EP2高剂量治疗组按照150mg/kg/d灌胃EP2；免疫抑制模型组则用相同容积生理盐水灌服。

(2)EP2对小鼠免疫器官及血象的影响：125mg/kg的EP2可以明显减轻CTX对脾脏及胸腺细胞的毒性作用，使胸腺指数几乎能恢复到正常水平，而且对脾脏具有反弹式恢复的功能。2125mg/kgEP2可以明显提高了WBC、LY和PMBC的数量，反弹式的增强骨髓造血功能。

(3)EP2对小鼠腹腔巨噬功能的影响：125mg/kgEP2对CTX拮抗效果更好，使Mφ吞噬率以及吞噬指数分别提高了31％和39％，所以EP2可以显著改善免疫抑制小鼠的Mφ的功能及Mφ比例。

(4)EP2对小鼠迟发性超敏反应(DHT)的影响：50mg/kgEP2和125mg/kgEP2均能显著提高免疫抑制小鼠Th1细胞活性，对免疫抑制小鼠的耳肿度和肿胀率恢复效果非常显著。

(5)EP2对小鼠T、B淋巴细胞转化作用的影响：50mg/kgEP2和125mg/kgEP2都可以拮抗CTX对淋巴细胞毒性作用，而且效果都非常显著。

(6)EP2对小鼠特异性免疫应答的影响：125mg/kgEP2可以明显缓解CTX对T细胞的毒性，尤其是拮抗了对Tc细胞损害，使得T细胞数量显著增加，从而减小了CD4+比例，提高CD8+的比例，通过这种双向调整使CD4+/CD8+的值下降，逐步恢复免疫抑制小鼠T细胞亚群的稳态。

(7)EP2对小鼠相关细胞因子的影响：125mg/mLEP2明显提高了IL-2、INF-γ和IL-4水平，分别提高了17.8％、32.8％、14.4％，提示EP2对Th1细胞因子调节程度要明显高于Th2类细胞因子，从而说明EP2可以改善以体液免疫为主的Th2免疫应答反应，同时也大大增强了机体Th1免疫应答反应。