一种基于花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯构建的呕吐霉素传感器的制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种基于花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯构建的呕吐霉素传感器的制备方法及应用，属于新型功能材料、生物传感检测技术领域。基于花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯对双氧水有良好的电化学催化能力和电子转移能力，显著提高了生物传感器的灵敏度，对粮食中呕吐霉素的检测具有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明一种基于花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯构建的呕吐霉素传感器的制备方法及应用。具体是采用具有良好电化学催化性能的花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯，制备一种检测粮食中呕吐霉素的传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。

背景技术

呕吐毒素又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇，是一种无色针状结晶，具有较强的热抗力。呕吐毒素是由镰刀菌属产生的毒性代谢产物，多分布于小麦、大麦、玉米等谷物籽实中，在谷物和饲料中检出率极高，是在黄曲霉毒素之后污染最严重的霉菌毒素。呕吐毒素对人和动物均有很强的毒性，能引起人和动物呕吐、腹泻、皮肤刺激、拒食、神经紊乱、流产、死胎等。

目前生物传感器已经广泛用于各种真菌毒素的检测，因为生物传感器具有灵敏度高、选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等一系列优点。其中，由于无标记型传感器可以直接用于检测抗原抗体的识别过程并且避免了标记物带来的干扰，得到了更加广泛的关注。

本发明将花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯修饰到玻碳电极表面，构建无标记型传感器。第一，花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯具有良好的生物相容性，并且能够有效地固定抗体；第二，花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯具有良好的电化学催化活性和较大的催化接触面积，能够提高传感器的灵敏度；第三，花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯具有良好的电子转移能力和大的比表面积，能够进一步增加抗体的固定和增强电子传递。该方法在检测过程中产生了良好的电化学信号，可用于呕吐霉素的分析。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，为目前有效检测呕吐霉素提供了新途径。

发明内容

本发明的目的之一是基于花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯构建无标记型生物传感器。

本发明的目的之二是将该无标记型生物传感器应用于呕吐霉素的高灵敏、特异性检测。

本发明的技术方案如下

1.一种基于花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯构建的呕吐霉素传感器的制备方法

（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

（2）在电极表面滴加6μL浓度为1~2mg/mL的花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯水溶液，干燥；

（3）继续将6μL浓度为5~20μg/mL的呕吐霉素抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；

（4）用3μL浓度为5~20mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；

（5）将6μL浓度为0.0002~20ng/mL的一系列不同浓度的呕吐霉素抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。

花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯的制备

（1）花状金铂的制备

将25~100mL超纯水、0.125~0.5mL质量分数为1%的氯金酸溶液和1.5~6mg氯铂酸钾在三口烧瓶中混合，加热煮沸后，快速加入1.5~6mL质量分数为2%的柠檬酸钠水溶液，煮沸10min，冷却到室温，得到花状金铂溶液；

（2）花状二氧化铈的制备

将0.099g七水合三氯化铈和0.5g聚乙烯吡咯烷酮溶解在7.5~30mL水中，随后加入0.25~1mL浓度为0.4mmol/L的草酸和0.35~1.4mL浓度为5mmol/L的氨水，搅拌30min后，加入0.065~0.26mL双氧水，将上述混合夜转入反应釜中，在150℃条件下反应5h，离心洗涤后干燥，得到花状二氧化铈；

（3）花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯的制备

将0.1g花状二氧化铈和0.1mL三氨丙基三乙氧基硅烷加入5~20mL异丙醇中，室温下搅拌24h，离心洗涤后干燥，得到三氨丙基三乙氧基硅烷修饰的花状二氧化铈，将0.1g三氨丙基三乙氧基硅烷修饰的花状二氧化铈和20mg氧化石墨烯加入到25~100mL的水中，随后加入15mL所制备的花状金铂溶液，室温下搅拌3h，离心洗涤后干燥，得到花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯。

呕吐霉素的检测方法

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）选择计时电流法对呕吐霉素抗原进行检测，将输入电压设置为-0.4V，取样间隔设置为0.1s，运行时间设置为400s；

（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向磷酸盐缓冲溶液中注入10μL浓度为5mol/L的双氧水溶液，然后记录电流随时间的变化，绘制工作曲线；

（4）将待测样品溶液代替呕吐霉素抗原标准溶液进行检测。

本发明的有益成果

（1）本发明采用花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯具有良好的生物相容性，通过形成金氮键化学键合至玻碳电极表面。

（2）本发明采用的花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯具有大的比表面积，能够有效固定大量的抗体。

（3）本发明采用的花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯对双氧水具有优越的电化学催化性能，提高了生物传感器的灵敏度。

（4）本发明采用的花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯具有良好的电子的传递效率，进一步提高了生物传感器的灵敏度。

（5）本发明将制备的无标记型生物传感器用于呕吐霉素的检测，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、灵敏和特异性检测。

具体实施方式

实施例1一种基于花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯构建的呕吐霉素传感器的制备方法

（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

（2）在电极表面滴加6μL浓度为1mg/mL的花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯水溶液，干燥；

（3）继续将6μL浓度为5μg/mL的呕吐霉素抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；

（4）用3μL浓度为5mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；

（5）将6μL浓度为0.0002~20ng/mL的一系列不同浓度的呕吐霉素抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。

实施例2一种基于花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯构建的呕吐霉素传感器的制备方法

（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

（2）在电极表面滴加6μL浓度为1.5mg/mL的花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯水溶液，干燥；

（3）继续将6μL浓度为10μg/mL的呕吐霉素抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；

（4）用3μL浓度为10mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；

（5）将6μL浓度为0.0002~20ng/mL的一系列不同浓度的呕吐霉素抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。

实施例3一种基于花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯构建的呕吐霉素传感器的制备方法

（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

（2）在电极表面滴加6μL浓度为2mg/mL的花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯水溶液，干燥；

（3）继续将6μL浓度为20μg/mL的呕吐霉素抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；

（4）用3μL浓度为20mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；

（5）将6μL浓度为0.0002~20ng/mL的一系列不同浓度的呕吐霉素抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。

实施例4花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯的制备

（1）花状金铂的制备

将25mL超纯水、0.125mL质量分数为1%的氯金酸溶液和1.5mg氯铂酸钾在三口烧瓶中混合，加热煮沸后，快速加入1.5mL质量分数为2%的柠檬酸钠水溶液，煮沸10min，冷却到室温，得到花状金铂溶液；

（2）花状二氧化铈的制备

将0.099g七水合三氯化铈和0.5g聚乙烯吡咯烷酮溶解在7.5mL水中，随后加入0.25mL浓度为0.4mmol/L的草酸和0.35mL浓度为5mmol/L的氨水，搅拌30min后，加入0.065mL双氧水，将上述混合夜转入反应釜中，在150℃条件下反应5h，离心洗涤后干燥，得到花状二氧化铈；

（3）花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯的制备

将0.1g花状二氧化铈和0.1mL三氨丙基三乙氧基硅烷加入5mL异丙醇中，室温下搅拌24h，离心洗涤后干燥，得到三氨丙基三乙氧基硅烷修饰的花状二氧化铈，将0.1g三氨丙基三乙氧基硅烷修饰的花状二氧化铈和20mg氧化石墨烯加入到25mL的水中，随后加入15mL所制备的花状金铂溶液，室温下搅拌3h，离心洗涤后干燥，得到花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯。

实施例5花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯的制备

（1）花状金铂的制备

将50mL超纯水、0.25mL质量分数为1%的氯金酸溶液和3mg氯铂酸钾在三口烧瓶中混合，加热煮沸后，快速加入3mL质量分数为2%的柠檬酸钠水溶液，煮沸10min，冷却到室温，得到花状金铂溶液；

（2）花状二氧化铈的制备

将0.099g七水合三氯化铈和0.5g聚乙烯吡咯烷酮溶解在15mL水中，随后加入0.5mL浓度为0.4mmol/L的草酸和0.7mL浓度为5mmol/L的氨水，搅拌30min后，加入0.13mL双氧水，将上述混合夜转入反应釜中，在150℃条件下反应5h，离心洗涤后干燥，得到花状二氧化铈；

（3）花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯的制备

将0.1g花状二氧化铈和0.1mL三氨丙基三乙氧基硅烷加入10mL异丙醇中，室温下搅拌24h，离心洗涤后干燥，得到三氨丙基三乙氧基硅烷修饰的花状二氧化铈，将0.1g三氨丙基三乙氧基硅烷修饰的花状二氧化铈和20mg氧化石墨烯加入到50mL的水中，随后加入15mL所制备的花状金铂溶液，室温下搅拌3h，离心洗涤后干燥，得到花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯。

实施例6花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯的制备

（1）花状金铂的制备

将100mL超纯水、0.5mL质量分数为1%的氯金酸溶液和6mg氯铂酸钾在三口烧瓶中混合，加热煮沸后，快速加入6mL质量分数为2%的柠檬酸钠水溶液，煮沸10min，冷却到室温，得到花状金铂溶液；

（2）花状二氧化铈的制备

将0.099g七水合三氯化铈和0.5g聚乙烯吡咯烷酮溶解在30mL水中，随后加入1mL浓度为0.4mmol/L的草酸和1.4mL浓度为5mmol/L的氨水，搅拌30min后，加入0.26mL双氧水，将上述混合夜转入反应釜中，在150℃条件下反应5h，离心洗涤后干燥，得到花状二氧化铈；

（3）花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯的制备

将0.1g花状二氧化铈和0.1mL三氨丙基三乙氧基硅烷加入20mL异丙醇中，室温下搅拌24h，离心洗涤后干燥，得到三氨丙基三乙氧基硅烷修饰的花状二氧化铈，将0.1g三氨丙基三乙氧基硅烷修饰的花状二氧化铈和20mg氧化石墨烯加入到100mL的水中，随后加入15mL所制备的花状金铂溶液，室温下搅拌3h，离心洗涤后干燥，得到花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯。

实施例7呕吐霉素的检测方法

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）选择计时电流法对呕吐霉素抗原进行检测，将输入电压设置为-0.4V，取样间隔设置为0.1s，运行时间设置为400s；

（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向磷酸盐缓冲溶液中注入10μL浓度为5mol/L的双氧水溶液，然后记录电流随时间的变化，绘制工作曲线；

（4）将待测样品溶液代替呕吐霉素抗原标准溶液进行检测；

（5）该生物传感器对呕吐霉素抗原检测线性范围为0.0002~20ng/mL，检测限0.1pg/mL。