嘧菌酯对口腔癌及癌前病变的干预作用

摘要

本发明关于一种化合物嘧菌酯(E)-[2-[6-(2-氰基苯氧基)嘧啶-4-基氧]苯基]-3-甲氧基丙烯酸甲酯(methyl(E)-2-{2-[6-(2-cyanophenoxy)pyrimidin-4-yloxy]phenyl}-3-methoxyacrylate)的新用途和用于显著抑制口腔癌细胞的制剂，属于抗肿瘤药物研发领域。嘧菌酯获取方法简便，化学结构明确，采用CCK-8法对口腔癌细胞SCC15和CAL27以及口腔癌前病变DOK细胞的增殖活性进行检测，实验结果显示有明显的增殖抑制作用，本发明为临床治疗口腔癌新药的研发提供实验依据，可应用于抑制口腔癌细胞生长的制剂中。

说明书

技术领域

本发明是关于一种化合物的新应用，具体的说是涉及一种新的干预口腔癌细胞生长的化合物。

背景技术

口腔癌是头颈部常见的恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的3％，位居第六位。口腔癌的发病率在世界 范围内呈上升趋势，发病年龄年轻化及女性增多趋势，估计全球每年新发病例27.4万例。口腔是人体的 重要解剖学部位，口腔癌病人以外观受损、进食困难及疼痛为主要症状，晚期还有张口困难、唾液减少、 颈部僵硬等一系列临床表现。目前，对于口腔癌主要采用手术治疗，放射治疗，化学药物治疗为主的综合 序列治疗，但治疗效果往往不佳，5年生存率不足50％。理想的抗癌药物应具备低毒、安全、有效、价廉 等条件，因此亟需研发。

开发一种新药花费昂贵，周期长，应用现有已知的化合物，是寻找新抗癌药物的有效手段。嘧菌 酯(别名阿米西达，英文名Azoxystrobin)是一种从蘑菇分离出来的strobilurin类天然杀虫剂，具有广 谱、高效、低毒、保护、治疗等特点。嘧菌酯是一种线粒体呼吸抑制剂，分子式C₂₂H₁₇N₃O₅,分子量403.3875， CAS号131860-3-8，合成专利最早由英国帝国化学工业公司申请。通过抑制细胞色素Bcl向细胞色素C的 电子转移，从而抑制线粒体的呼吸。嘧菌酯毒性较低，对雌、雄大鼠的急性经口、经皮毒性均属低毒，雌、 雄大鼠经口LD50>5000mg/kg，急性经皮LD50>5000mg/kg，急性吸入LC50(2h)>2474mg/m³，属低毒性，致 敏实验得出对豚鼠皮肤致敏率为0％。致畸实验结果显示嘧菌酯原药未引起人外周学淋巴细胞染色体畸变率 增高，目前尚未见报道有致突变、致畸和致癌作用。在大鼠体内的毒代动力学特点是，嘧菌酯给药后1h 血药浓度达到峰值，分布范围广，但在被测组织器官中未有蓄积作用，排泄快，4h后主要以未经代谢的原 型直接随粪便排出。

现有技术背景缺陷：化疗是口腔癌临床治疗常用方法之一，在口腔癌治疗中发挥了重要的作用， 但部分病例在化疗后机体对化疗药物出现了耐药现象，造成化疗失败，且副作用较大。所以寻找新型低毒 高效的治疗药物对口腔癌综合治疗具有重要意义。本发明所涉及的化合物嘧菌酯为常见市售的广谱杀菌 剂，主要用于农作物的病虫害防治，其制备方法简单，杀虫效果好。我们研究发现嘧菌酯对口腔癌细胞的 生长有显著的抑制作用，有望为临床口腔癌治疗的新药研发提供科学依据。迄今，国内外尚未发现有关嘧 菌酯与癌症相关性研究。

发明内容

本发明的目的是针对目前口腔癌综合治疗的缺陷，提供一种在制备用作抗肿瘤药物中应用的化合 物，为口腔癌的临床药物治疗提供新的支持。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下。

具体包括以下步骤：

1.嘧菌酯为式(1)所示结构式的化合物，分子式为C₂₂H₁₇N₃O₅，化学名，(E)-[2-[6-(2-氰基苯氧基) 嘧啶-4-基氧]苯基]-3-甲氧基丙烯酸甲酯，CAS编号为131860-33-8；外观为白色粉末状，分子量 403.34。本品也可溶于甲醇、甲苯、丙酮等其他有机溶剂，但不以此为限，本发明中将嘧菌酯原药溶 于DMSO，配制成50mg/ml贮存液，存于4℃冰箱。

2.嘧菌酯对口腔癌细胞增殖的影响

通过CCK-8法检测嘧菌酯对肿瘤细胞增殖的影响，其原理为在电子耦合剂存在的情况下，可以被 线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色甲臜产物。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，使用酶 标仪在450nM波长处测定OD值，以间接反映活细胞数量。

将1.5μg/ml、3μg/ml、6μg/ml、12μg/ml不同浓度的嘧菌酯分别作用于口腔癌细胞SCC15， CAL2724h,48h,72h后，细胞增殖受到不同程度的抑制。随着药物浓度的升高，SCC15及CAL27细 胞增殖抑制率亦随着升高。嘧菌酯作用于SCC15细胞24h,48h,72h的半数抑制率IC50分别为7.82 μg/ml,7.51μg/ml和8.02μg/ml；CAL27细胞24h,48h,72h的IC50分别为4.4μg/ml，6.5μg/ml， 和5.9μg/ml。提示嘧菌酯对口腔癌细胞增殖具有抑制作用。

3.嘧菌酯对口腔癌前病变细胞增殖的影响

将1.5μg/ml、3μg/ml、6μg/ml、12μg/ml不同浓度的嘧菌酯分别作用于口腔癌前病变细胞DOK 24h,48h,72h后，细胞增殖受到明显的抑制。48h,72h的抑制率都在90％-100％之间。提示嘧菌酯对 口腔癌前病变细胞的增殖抑制作用尤其显著。

综上所述，本发明拓展了嘧菌酯新的应用途径，为将嘧菌酯应用于抑制肿瘤细胞生长上，使其能 进一步应用包括于治疗口腔癌的医药组分中，改善口腔癌的治疗效果。本发明对该化合物的应用的范 围包括对于口腔癌细胞的生长抑制，进而抑制肿瘤的增生，从而延缓肿瘤的恶化。同时，本发明中亦 可将嘧菌酯利用于抑制口腔癌细胞生长的医药组成物的成分中，还可包括药学上可接收的载体。载体 可为赋形剂(如水)、填充剂(如蔗糖或淀粉)、黏合剂(如纤维素衍生物)、稀释剂、崩解剂、吸 收促进剂或甜味剂，但并未仅限于此。本发明医药制剂可依一般习知药学的制备方法生产制造，将嘧 菌酯与一种以上的载体相混合，此剂型可包括锭剂、粉剂、粒剂、胶囊或其他液体制剂，但未以此为 限。

以下将配合图示进一步说明本发明的实施方式，

附图说明

图1.嘧菌酯化学结构式；

图2.嘧菌酯对SCC15细胞增殖的影响；

图3.嘧菌酯对CAL27细胞增殖的影响；

图4.嘧菌酯对DOK细胞增殖的影响；

具体实施方式

SCC15细胞培养于DMEM-F12培养基中,CAL27细胞和DOK细胞培养于DMEM高糖培养基中，l0％Gibco 胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素，并置于5％CO₂、95％空气、37℃的饱和湿度孵箱中培养。 细胞贴壁生长，2-3天传代一次，实验所需细胞均处于对数生长期。

采用CCK-8法检测细胞增殖。实验设置实验组，嘧菌酯浓度分别为1.5μg/ml、3μg/ml、6μg/ml、 12μg/ml；溶剂对照组，与实验组同浓度的DMSO。取对数生长期细胞，用含0.25％EDTA胰酶消化，离心， 弃上清。用含有10％血清的培养基调整细胞浓度为2.5×10⁴个/ml。每孔接种200μl细胞悬液入96孔培 养板内，每组4个复孔。贴壁过夜后，吸弃上清，按组加入含有不同浓度漏芦EA的培养液(血清含量为10％)， 并设溶剂对照组继续培养不同时间(24h、48h、72h)。每孔加190μl培养基和10μlCCK8试剂，置 于37℃、5％CO2饱和湿度孵箱内培养2.5h后终止培养。在酶标仪上测定各孔吸光度(A值)，选择450nm 波长，记录结果，并按以下公式计算增殖抑制率：增殖抑制率(％)＝(A_实验组-A_空白组)/(A_对照组-A_空白组)× 100％。