鹅掌楸苷及其苷元在制备防治脓毒症所致肺损伤药物中的用途

摘要

本发明公开了一种鹅掌楸苷及其苷元在制备防治脓毒症所致肺损伤药物中的用途，属于含有来自植物的药物制剂。本发明将从大血藤中提取的鹅掌楸苷经纤维素酶酶解获得鹅掌楸苷苷元（+）-丁香脂素；再通过小鼠实验，采用口服给药途径，应用小鼠盲肠结扎并穿孔盲肠末端败血症模型，观察证实鹅掌楸苷或其苷元具有防治脓毒症所致肺损伤的作用。本发明中鹅掌楸苷及其苷元从天然中药中提取对人体毒副作用低，可以显著提高患者的用药安全性和用药依从性，进而大幅度改善了肺损伤患者的治疗效果和生活质量。同时，本发明所述的（+）-丁香脂素的制备方法利于大生产操作、污染少、产品纯度高，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于含有来自植物的药物制剂，具体是一种鹅掌楸苷及其苷元在制备防治脓毒症所致肺损伤药物中的用途。

技术领域

脓毒症是指由感染引起的全身炎症反应综合征(SIRS)，肺脏是脓毒症最易受损的靶器官，急性肺损伤(ALI)是急性呼吸功能窘迫综合征(ARDS)最常见的原因和表现，影响肺功能的病理改变包括迅速出现的呼吸困难、低氧血症及呼吸衰竭。临床上以急性发病、进行性加重并难以改善的低氧血症为主要表现特点。其中败血症诱发的ALI／ARDS发病率可高达25%-50%。对1994-2006年国际上正式发表的72个ARDS临床研究进行荟萃分析，11426例ALI/ARDS病人的病死率为43%。在我国北京市和上海市的流行病学调查中，ARDS病死率高达50%和68%。ALI/ARDS的治疗手段都是非特异的支持疗法，包括机械辅助通气。过度的炎症反应被认为是ALI/ARDS的主要特点，所以类固醇药物一度被认为是治疗ALI/ARDS患者的有效手段，但对其是否能改善ALI/ARDS的死亡率存在巨大争议。例如ARDS后期应用糖皮质激素可以增加患者的死亡率。ALI/ARDS给家庭及社会带来了严重的经济负担，因此进一步寻找治疗ALI/ARDS的特效药成为当今研究的热点。

大血藤为我国特有的大血藤科植物大血藤的干燥藤茎，主要产于湖北、四川、江西、河南、江苏、浙江等地，有清热解毒、活血，祛风止痛之功效，用于肠痈腹痛，热毒疮疡，经闭，痛经，跌扑肿痛，风湿痹痛等。所含化学成分主要为鞣质类、木质素类、酚酸类、黄酮类等。文献报道，其中木质素类主要成分鹅掌楸苷（Liriodendrin）分子式：C₃₄H₄₆O₁₈，分子量：742.73。

鹅掌楸苷苷元（+）-丁香脂素，分子式为C₂₂H₂₆O₈。目前，鹅掌楸苷苷元（+）-丁香脂素提取纯化主要是应用硅胶层析、高速逆流层析法、制备高效液相色谱等进行制备。现有的提取分离方法主要采用层析色谱柱法，但这些提取方法得到的（+）-丁香脂素的含量低，操作过程污染严重，基本无法进行大生产操作；同时人工合成的丁香脂素为消旋体，很难将（+）-丁香脂素和（-）-丁香脂素分离。

发明内容

本发明就是为了丰富鹅掌楸苷及其苷元的医药用途以及解决现有技术中鹅掌楸苷苷元提取方法存在不足的问题，所提出的一种鹅掌楸苷及其苷元在制备防治脓毒症所致肺损伤药物中的用途。

本发明是通过以下技术方案实现的。

鹅掌楸苷及其苷元在制备防治脓毒症所致肺损伤药物中的用途。

所述鹅掌楸苷或其苷元的给药剂量为1mg/kg·d-50mg/kg·d。

所述鹅掌楸苷苷元为（+）-丁香脂素。

一种权利要求3所述的鹅掌楸苷苷元（+）-丁香脂素的制备方法，步骤如下：

a.将鹅掌楸苷按1:10-20的固液比加入到含水解酶的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，30℃-70℃下水解10-72小时；

b.离心收集上清液，加入与上清液等体积的有机溶剂萃取，分取有机溶液用适量水洗涤，再用无水硫酸钠脱水，过滤，滤液减压浓缩至干，即得（+）-丁香脂素；

c.将步骤b中得到的（+）-丁香脂素加入甲醇溶液进行重结晶，得到纯度为大于95%的（+）-丁香脂素。

所述步骤a中水解酶为纤维素水解酶。

所述步骤b中有机溶剂为氯仿或二氯甲烷。

本发明获得了如下的有益效果。

本发明所述的鹅掌楸苷或其苷元具有显著的防治脓毒症所致肺损伤的作用。而且这两种物质是从传统中药大血藤中提取得到的天然中药单体，其对人体毒副作用低，可以显著提高患者的用药安全性和用药依从性，进而大幅度改善了肺损伤患者的治疗效果和生活质量。本发明获得的鹅掌楸苷或其苷元可单独或以药物组合物形式使用并可通过口服，非肠道或局部途径给予，给药形式多样、方便，适用于人或其他恒温动物。同时，本发明所述的（+）-丁香脂素的制备方法利于大生产操作、污染少、产品纯度高，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明鹅掌楸苷及其苷元的结构式；

图2是本发明鹅掌楸苷苷元（+）-丁香脂素核磁共振色谱图；

图3是本发明鹅掌楸苷苷元（+）-丁香脂素HPLC色谱图；

图4是本发明对照组对小鼠盲肠结扎并穿孔盲肠末端所致肺脏组织学结构的影响图；

图5是本发明模型组对小鼠盲肠结扎并穿孔盲肠末端所致肺脏组织学结构的影响图；

图6是本发明鹅掌楸苷组对小鼠盲肠结扎并穿孔盲肠末端所致肺脏组织学结构的影响图；

图7是本发明丁香脂素组对小鼠盲肠结扎并穿孔盲肠末端所致肺脏组织学结构的影响图；

图8是本发明鹅掌楸苷或其苷元对小鼠盲肠结扎并穿孔盲肠末端所致肺组织中IL-1β含量的影响图；

图9是本发明鹅掌楸苷或其苷元对小鼠盲肠结扎并穿孔盲肠末端所致肺组织中MIP-1含量的影响图；

图10是本发明鹅掌楸苷或其苷元对小鼠盲肠结扎并穿孔盲肠末端所致肺组织中TNF-α含量的影响图；

图11是本发明鹅掌楸苷或其苷元对小鼠盲肠结扎并穿孔盲肠末端所致肺组织中IL-6含量的影响图；

图12是本发明鹅掌楸苷或其苷元对小鼠盲肠结扎并穿孔盲肠末端所致肺组织白蛋白含量的影响图；

图13是本发明鹅掌楸苷或其苷元对小鼠盲肠结扎并穿孔盲肠末端所致肺组织MPO含量的影响图；

图14是本发明鹅掌楸苷或其苷元对小鼠盲肠结扎并穿孔盲肠末端所致死亡率的影响图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。

一.鹅掌楸苷及其苷元的制备

本发明中鹅掌楸苷及其苷元的结构式如图1所示，其中R=Glu为鹅掌楸苷；R=H为鹅掌楸苷苷元。

1.本发明中鹅掌楸苷的制备方法已在发明专利CN103333174B中公开，具体制备方法如下：

一种鹅掌楸苷的制备方法，包括以下步骤：

（1）取大血藤粗粉，以40%~95%乙醇为溶媒，大血藤粗粉与溶媒的重量份数比为1:6~20，加热回流提取1~4次，每次1~3小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇至浸膏；

（2）浸膏加水溶解至大血藤粗粉重量的0.5~5倍，再加入大血藤粗粉重量1~5倍的鞣质沉淀剂明胶溶液沉淀，滤过，滤液减压浓缩至浆状，加硅藻土拌匀烤干，粉碎成细粉；

（3）以体积比为1:1~9的甲醇和氯仿的混合溶液回流提取细粉1~4次，每次1~3小时，滤过，合并滤液，减压回收溶剂至浆状物；

（4）加大血藤粗粉重量1/10~1/20的有机溶剂甲醇溶解上述浆状物，放置，结晶，滤过，洗涤，干燥即获得产品。

2.鹅掌楸苷苷元的制备

实施例1

鹅掌楸苷1g，以固液比为1:10的比例加入到含有纤维素酶的0.3M醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，在45℃下水解72小时，离心收集上清液，向上清液中加入等体积的氯仿萃取，分取氯仿液，用适量水洗涤，再用无水硫酸钠脱水，过滤，滤液减压浓缩至干。加入甲醇溶解，放置，结晶，过滤，洗涤，干燥，经核磁共振（NMR）及旋光测定为（+）-丁香脂素（如图2所示）；经HPLC测定（波长为271nm），纯度达95%以上（如图3所示）。

实施例2

鹅掌楸苷5g，以固液比为1:20的比例加入到含有纤维素酶的1M醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，在55℃下水解48小时，离心收集上清液，向上清液中加入等体积的二氯甲烷萃取，分取二氯甲烷液，用适量水洗涤，再用无水硫酸钠脱水，过滤，滤液减压浓缩至干。加甲醇溶解，放置，结晶，过滤，洗涤，干燥，经核磁共振（NMR）及旋光测定为（+）-丁香脂素（如图2所示）；经HPLC测定（波长为271nm），纯度达95%以上（如图3所示）。

二.实验分组

实验动物为C57BL/6小鼠，随机分为四组，每组10只，即对照组、模型组、给药1组和给药2组，分别在造模和造模后6h灌胃给药。造模24h后处死小鼠，进行各项炎症指标的测定；

(1)对照组：小鼠麻醉，开腹后缝合。

(2)模型组：采用结扎并穿孔小鼠盲肠末端（cecalligationandpuncture,CLP），建立败血症动物模型。

(3)鹅掌楸苷组：小鼠败血症动物模型灌胃鹅掌楸苷溶液0.2ml(20mg/kg)。

(4)丁香脂素组：小鼠败血症动物模型灌胃（+）-丁香脂素溶液0.2ml(20mg/kg)。

三.鹅掌楸苷和（+）-丁香脂素对脓毒症小鼠肺部组织学结构的影响

对C57BL/6小鼠CLP模型，在造模和造模后6h灌胃给药鹅掌楸苷或（+）-丁香脂素，24h后取肺组织，固定、石蜡包埋、切片后进行苏木精-伊红(H&E)染色，在光学显微镜下观察。

结果显示对照组（如图4所示）中肺脏肺泡轮廓清晰，有较完整的肺泡结构；肺泡壁炎性细胞含量极少，无出血，无萎缩，提示基本无炎症。模型组（如图5所示）肺泡壁毛细血管明显扩张充血，炎性细胞浸润；肺泡严重弥漫性增厚，肺泡萎缩变形。鹅掌楸苷和（+）-丁香脂素治疗后可以看出较清晰的肺泡轮廓，有较完整的肺泡结构，无明显的肺泡萎缩，毛细血管扩张及炎性细胞浸润现象也均得以改善(如图6、7所示)。

四.鹅掌楸苷或（+）-丁香脂素对脓毒症小鼠肺组织中炎症因子影响

对C57BL/6小鼠CLP模型，在造模和造模后6h灌胃给药鹅掌楸苷或（+）-丁香脂素，24h后进行肺泡灌洗，检测肺泡灌洗液中炎症因子的分泌。

结果显示，造模24h后，模型组肺泡灌洗液中炎症因子，白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、和巨噬细胞炎症因子1（MIP-1）的含量显著增加(p<0.05),但是鹅掌楸苷或（+）-丁香脂素治疗后，炎症因子含量显著降低(p<0.05)(如图8-11所示)。

五.鹅掌楸苷或（+）-丁香脂素对脓毒症小鼠肺毛细血管通透性的影响

对C57BL/6小鼠CLP模型，在造模和造模后6h灌胃给药鹅掌楸苷或（+）-丁香脂素，24h后取肺组织，肺泡灌洗，检测白蛋白含量；匀浆后检测髓过氧化物酶(MPO)活性。

结果显示，CLP造模24h后，小鼠肺泡灌洗液中白蛋白含量和肺组织中MPO含量都明显增加，反映出毛细血管通透性增加，嗜中性粒细胞浸润增多，而鹅掌楸苷或（+）-丁香脂素治疗后肺泡灌洗液中白蛋白含量和肺组织MPO含量都明显降低(如图12、13所示)。

六.鹅掌楸苷或（+）-丁香脂素对脓毒症小鼠生存率的影响

对C57BL/6小鼠CLP模型，在造模和造模后6h灌胃给药鹅掌楸苷或（+）-丁香脂素，在造模24h、48h和72h后观察各组的生存率。

结果显示，CLP造模72小时后，小鼠生存率只有30%，而鹅掌楸苷或（+）-丁香脂素治疗后小鼠的生存率都明显升高(如图14所示)。