在大肠杆菌的细胞质和/或培养基中表达真人类表皮生长因子和/或碱性成纤维细胞生长因子的手段和方法

摘要

本发明涉及一种生物工程系统，特别是大肠杆菌宿主。所述宿主整合有DNA构建体组合用来生产至少第一多肽。第一多肽可以是真碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。DNA构建体中有插入片段，该插入片段包括，例如，按顺序，表达盒、内含肽和编码第一多肽的DNA。所述DNA构建体被配置为影响宿主胞内分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在宿主的细胞质中和/或外排到培养宿主的细胞培养基中。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年4月3日提交的美国专利申请No.61/808,062的优先权，将其公开的内容整体合并于本申请中。

序列表

如上即时申请包括序列表，通过整体引用的方式合并于此。

技术领域

本申请涉及在大肠杆菌(Escherichiacoli)的细胞质和/或培养基中表达真(authentic)人类表皮生长因子和/或碱性成纤维细胞生长因子的手段和方法。

背景技术

虽然大肠杆菌不能进行翻译后修饰，但大肠杆菌仍然是用来生产重组人类治疗性蛋白最常用的宿主系统。在这些蛋白中，包括表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在内的皮肤蛋白不需要翻译后修饰，例如维持生物活性和稳定性的糖基化修饰，这些皮肤蛋白已经使用多种策略在大肠杆菌中得到了表达。

可能是由于尺寸小，EGF已经在大肠杆菌中得到了高效表达、分泌甚至外排(excrete)到培养基中。外排的EGF不仅被证实是有生物活性的，更重要的是，其还显示出具有正确的初级(真)结构。此外，由于通过外排生产EGF不需要破坏细胞，所以外排生产的EGF可以免于内毒素的污染。另外，培养基中低水平的细胞质蛋白极大促进了EGF的纯化以达到高同质性。重要的是，这个过程高度可重复并易于扩展。

对于bFGF，尽管它具有分泌性，但是它并没有通过分泌或外排在大肠杆菌中获得成功表达。传统地，bFGF在大肠杆菌中的表达通过使用融合的方式已被局限于细胞质，在这种方式中，bFGF的回收依靠细胞的裂解、融合中间体的蛋白水解消化和通常通过亲和层析进行的后续纯化。bFGF的细胞内表达会导致高的生产成本，因为它要么需要昂贵的蛋白酶以切割融合产物，要么在内含物聚合体(inclusionaggregates)形成时需要劳动密集型的方案来再生bFGF。尽管有这些操作，但是bFGF在大肠杆菌中的表达仍没有圆满完成，因为生产的产物被证实未被正确加工或者没有生物活性。

之前已经尝试使用其它的重组系统来生产bFGF。其中一种尝试是关于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)工程来促进bFGF的分泌生产。通过使用能够精准的对融合前体进行肽酶加工的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)蛋白酶基因的NPR信号肽，并结合一种温和的破坏细胞壁稳定性的方案，具备真正结构和完全的生物活性的bFGF被证实分泌到了枯草芽孢杆菌的培养基中。

本发明提供了一种可替代的和/或改进的方法和系统，以用于可靠且高效地生产bFGF和/或其它有用的多肽。

发明内容

根据本申请的第一方面，提供了一种DNA构建体，以用于在大肠杆菌中生产至少第一多肽，其中，所述第一多肽是真碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，其中，所述DNA构建体中包括插入片段，所述插入片段按顺序包括表达盒、内含肽序列和编码碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的DNA，其中，所述DNA构建体被配置成能够使宿主分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在宿主的细胞质中和/或外排到培养宿主的细胞培养基中。

优选地，所述DNA可以包含编码第二多肽的DNA，其中，编码第二多肽的DNA可以被安排在表达盒和内含肽序列之间。编码第二多肽的DNA以可以编码真人类表皮生长因子(EGF)。所述DNA构建体可以被配置成能够使宿主以非融合多肽的形式分泌第一和/或第二多肽。

在一种实施方式中，所述内含肽序列可以是SceVMA内含肽序列。

在一个实施方式中，所述表达盒可以包括启动子序列，操纵子序列，用于共有核糖体(consensusribsome)结合位点的序列和前导序列。在具体的实施方式中，所述表达盒可以按顺序包括启动子序列、操纵子序列，用于共有核糖体(consensusribsome)结合位点的序列和前导序列。在另一种具体的实施方式中，所述启动子序列可以是lacUV5启动子(lacUV5)，操纵子序列可以是lac操纵子(lacO)，前导序列可以是ompA前导序列(ompA)。

根据本发明的第二方面，提供了一种用来至少生产碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的生物工程系统，其中，所述系统为大肠杆菌宿主，并且其中，所述系统适用于通过分泌到细胞质中和/或培养所述系统的培养基中的方式生产碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。

优选地，所述系统可以包括以上描述的DNA构建体。

所述系统可以被配置成以非融合多肽的形式生产第一多肽。

所述系统可以被配置成以非融合多肽的形式生产第二多肽。

根据本发明的第三方面，提供了一种生产碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的方法，所述碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)为大肠杆菌宿主的细胞外产物和/或来自大肠杆菌宿主的细胞质，该方法包括在DNA构建体中使用内含肽以促进所述bFGF表达的步骤。

优选地，所述内含肽可以是SceVMA内含肽。

在一种实施方式中，所述方法可以适用于在相同的大肠杆菌宿主中以非融合多肽的方式共表达bFGF和真人类表皮生长因子(EGF)。

在一种实施方式中，所述方法可以包括在在宿主细胞质中和/或培养宿主的细胞培养基中生产bFGF和/或EGF的步骤。

优选地，所述方法提供：在DNA构建体中，将内含肽置于bFGF和EGF的DNA编码序列之间的步骤。

在一种实施方式中，bFGF和EGF的DNA编码序列可以置于相同的DNA构建体中。

附图说明

图1是展示用在引导本发明的研究中DNA构建体的示意图。中的上部分展示了使用的3种DNA质粒，即(A)pWKW2FGFR、(B)pWKW20VMA和(C)pWK3R。基因元件的符号如下所示：bfgf＝bFGF基因；VMA＝SceVMA内含肽的编码序列；egf＝EGF基因；ori＝大肠杆菌中的复制起始位点；amp^R＝氨苄青霉素抗性基因。图下部分展示了LacUV5表达盒的5’端区域，按包括lacUV5启动子(lacUV5)、lac操纵子(lacO)、共有核糖体结合位点(RBS)和ompA前导序列(ompA)。箭头指示了从lacUV5启动子的转录方向。所述箭头指示了从lacUV5启动子的转录方向。位于图的最下部分的图(D)展示了在构建体pWKW20VMA和pWK3R中，在VMA内含肽融合边界的DNA编码序列和氨基酸序列。

图2是多种质粒构建体表达的bFGF和EGF的蛋白印迹(WesternBlot)的示意图。将在IPTG诱导下生长8小时的含有pWK3R、pWKW20VMA和pWKW2FGFR三种构建体的大肠杆菌培养物分离成细胞上清液(SN)和细胞裂解液(CL)制品(preparation)。通过使用抗：[凝胶(A)]bFGF和MazG(内参)；[凝胶(B)]bFGF、EGF和MazG的抗体(antibodiesraisedagainst)的蛋白印迹来分析样品的bFGF和EGF产物。样品也用考马斯亮蓝R-250进行染色，并展示在凝胶C中。展示了未成熟的(premature)bFGF(OmpA-bFGF)和未成熟的EGF(OmpA-EGF)的中间体，对应的，也展示了成熟的bFGF(Mat-bFGF)和成熟的EGF(Mat-EGF)产物。SN和CL的上样量分别相当于细胞培养物的10μl和5μl。所述三种构建体的名称显示在凝胶图片下方来表示制备的分离样品所来自的细胞培养物。表明了图2a(泳道2和3)以及图2b(泳道3和4)所示的是前体OmpA-EGF-VMA-bFGF(△)和EGF-VMA-bFGF(■)。其他使用的符号：M＝蛋白分子量标准；+VE＝作为阳性对照的bFGF或bFGF和EGF标准物。

图3是两张展示通过MALDI-TOF测定的纯化EGF的质量图。展示分析(见方法)：(a)具有天然的初级结构的商业化的EGF标准物；(b)从JM101(pW3R)培养物(见方法中的生长和诱导条件)的SN纯化得到的EGF。表明主峰在6213至6217的区域处具有的质荷比(m/z)是期望从真EGF在两处得到的。(a.u.)表示任意单位。

图4是两张展示EGF和bFGF的生物测定的图。成熟的EGF和bFGF样品是从诱导的JM101[pWK3R]的培养上清液中纯化得到的(见方法中的生长和诱导条件)。EGF和bFGF对BALB/C3T3纤维原细胞增殖的有丝分裂影响的分析在方法中做了描述。两种成熟因子的生物活性与具有正确初级结构的EGF和bFGF标准物的生物活性做了比较。两个测试都得到了能够重合的曲线。每个测试重复四次(σ＜0.05)；以及

图5是两张展示成熟的bFGF和成熟的EGF在JM101[pWK3R]培养物中共表达的图。JM101[pWK3R]培养物的生长和诱导条件在方法中做了描述。顶部图表示了：在SN中成熟的bFGF的浓度(-□-)，在CL中成熟的bFGF的浓度(-●-)，在SN中成熟的EGF的浓度(--△--)，以及在CL中成熟的EGF的浓度(＝＝◆＝＝)。表示出的结果是四次不同实验的平均值±SEM值。底部图表示了：普通琼脂平板(plainagarplate)上收获的活细胞数(...◆....)，添加有氨苄青霉素的琼脂平板的活细胞数(-■-)；CFU指的是细胞形成单位。

具体实施方式

大肠杆菌被用来在细胞外生产多种不同来源、功能和尺寸的自然分泌的蛋白。引导本发明的研究提供了在大肠杆菌中通过细胞分泌/外排的方式表达真bFGF的机制，该机制在之前是不可能的或者至少是不可靠的。如后文将要解释的，本发明利用了创新的策略，通过高效外排构建体pWKW2和能够自我切割的SceVMA内含肽的协同作用来促进大肠杆菌中bFGF的分泌表达。研究数据表明，第一次，真bFGF在大肠杆菌中作为外排产物被可靠和/或高效率地生产。另外，EGF也能够共外排至培养上清液(SN)中。值得注意和意外的是，两种多肽因子也在细胞裂解物(CL)中被鉴定了出来，并且它们显示出和它们外排的对应物是相同。更令人意想不到的是，从SN和CL中获取的EGF和bFGF均被证实都具有完全生物活性，并且就初级构建体而言是真实的。重要的是，本发明的结果支持了这样的概念：两种亚细胞分割部分一起展现了用于合算地生产品质卓越的EGF和bFGF的非凡资源。对于外排的bFGF或EGF都经历了原位细胞切割，故不需要后续的加工，例如，在亲和柱辅助下的切割。

实验和结果

构建DNA构建体

在引导本发明的研究中，pWKW2被用作表达载体以产生三种新的用于在大肠杆菌中胞分泌/外排表达EGF和/或bFGF的DNA构建体。在第一种构建体pWKW2FGFR(图1a)中，通过取代egf基因，并与ompA前导序列框内融合克隆了bfgf基因。为了形成第二种构建体pWKW20VMA(图1b)，在pWKW2FGFR中，将SceVMA内含肽(VMA)的编码序列恰好插入到的ompA前导序列和bfgf基因之间。为了获得最后一种构建体pWK3R(图3c)，在pWKW2中，将包括VMA的编码序列和bfgf基因的DNA插入片段与egf基因进行了框内融合。

bFGF和EGF在具有三种质粒的大肠杆菌转化子中的表达

尽管PWKW2被用于提供EGF的高效外排，它的第一个具有bfgf基因的衍生物pWKW2FGFR(图1a)却不能提供相似的性能(图2a)。源自pWKW2FGFR表达的bFGF产物被证实基本上被限制在细胞内，即表明它不是外排的，是以OmpA分泌信号(OmpA)-bFGF融合体存在的(图2a，泳道6)。观察表明OmpA-bFGF融合体可能没有很好的被修饰以用于分泌。

研究发现和内含肽例如VMA融合的信号肽将会降低重组蛋白的分泌水平。为了查明与例如VMA的内含肽融合的信号肽对分泌产物bFGF的影响，在本发明的研究中，在pWKW2FGFR中，将VMA的编码序列插入到的bfgf基因和ompA前导序列之间以形成pWKW20VMA(图1b)。JM101[pWKW20VMA]培养物中表达的bFGF的蛋白印迹分析(WesternBlot)表明仅仅低水平的bFGF，基本上以大的(～73KDa)未切割的VMA-bFGF中间体的形式存在于培养基中(图2a，泳道5)。相似地，VMA-bFGF的前体OmpA-VMA-bFGF，同样以未切割的多肽形式而在细胞质中被检测到(图2a，泳道4)。环境条件的变化对VMA和它的侧翼序列的切割效率并没有任何的有益作用(数据未列出)。推测原因，VMA-bFGF或OmpA-VMA-bFGF都不能形成可自我切割的中间体。然而，尽管有较大的尺寸和细胞内源的VMA，在研究中VMA-bFGF在大肠杆菌中的外排被证明是可行的。

本发明进一步的研究表明高效的分泌蛋白应该具有两种功能，即，首先作为“发动机”以促进VMA-bFGF的分泌/外排，第二作为VMA-bFGF的兼容的“N端外显肽”，因此使后者在外排之前行驶自我切割的活性。考虑到研究中pWKW2在EGF表达中的卓越性能，本发明将编码VMA-bFGF的DNA序列与egf基因进行框内融合(egf基因提前被克隆至LacUV5表达盒的ompA前导序列旁边)，以形成pWK3R构建体(图1c)。蛋白印迹分析(WesternBlot)表明不仅bFGF被有效外排至培养上清液(SN)中(图2a，泳道3)，在同一培养基中也检测到了高水平的EGF(图2b，泳道3)。另外，两种因子都被证实是加工过的非融合产物(图2)。在SN中没有检测到细胞质标识物MazG，这支持了检测到的EGF和bFGF是由于外排而不是细胞裂解(图2A，泳道3和图2B，泳道3)这样意料不到的结论。

JM101[pWK3R]中bFGF和EGF的亚细胞定位

为了进一步分析在具有pWK3R的大肠杆菌中表达的bFGF和EGF的分布，进行了进一步的研究。具体地，在诱导8小时后收获IPTG诱导的JMI0l[pWK3R]培养物，并加工以获得细胞裂解物(CL)和上清液(SN)组分。令人兴奋的是，在SN(图2a，泳道3)和CL(图2a，泳道2)中均检测到了高水平的非融合bFGF，表明了bFGF与VMA的切割既发生在大肠杆菌培养物的胞内部分，也发生在胞外部分。

另外一方面，在研究中发现，EGF被高效表达并外排到JM101[pWK3R]培养物的SN中(图2b，泳道3)。然而，除了外排的EGF的高水平，在CL中也检测到了显著水平的加工过的EGF和未切割的OmpA-EGF中间体(图2b，泳道4)。

JM101[pWK3R]中bFGF和EGF的真实性

通过液相色谱-串联质谱法分析从诱导的JM101[pWK3R]的CL和SN中纯化的加工过的bFGF以确定其真实性。如结果表明的，来源于两种组分的bFGF均含有的N端和C端序列均和天然的bFGF的那些相同(表2)，表明了其从两种前体：OmpA-EGF-VMA-bFGF(细胞质中)(图2a，泳道2)和EGF-VMA-bFGF(培养基中)(图2a，泳道3)中的切除是自动的并精确的，从而成功地产生了真bFGF。

虽然在JM101[pWKW2]的培养基中，OmpA-EGF融合体显示被精确加工以生产真EGF，但是还需要辨别，在SN中，源自EGF-VMA-bFGF中间体切割的EGF在构建体上是否与天然的EGF不同。如质量测定所支持的，可总结为：回收的EGF和天然的EGF是完全相同的(图3)。

来自JM101[pWK3R]的bFGF和EGF的效力

进一步仔细研究和测定从JM101[pWK3R]的SN中纯化得到的bFGF和EGF样品的生物活性，参考之前通过研究表达和表征的真实对应物。结果表明两种产物都和标准物明显共享相同的效力(图4)，支持了JM101[pWK3R]中外排的bFGF和EGF不仅结构正确而且还有完全的生物活性的结论。因为从CL中纯化的bFGF组分显示出与SN中的对应物结构相同，因此这意味着前者和后者效力同样。

JM101[pWK3R]中bFGF和EGF的表达

收获使用IPTG诱导生长8小时的JM101[pWK3R]细胞样品，以制备CL和SN的部分。两部分中的bFGF和EGF的蛋白印迹分析(WesternBlot)结果表明两种因子或多肽都在培养物中高效表达。更重要的是，两种中间产物：从CL中鉴定出的OmpA-EGF-VMA-bFGF(图2a，泳道2)和从SN中鉴定出的EGF-VMA-bFGF(图2a，泳道3)，均被精确加工以生产真bFGF。结合两部分，得到了令人惊奇的bFGF收率大约为103mg·l^-1(图4)。相似地，也获得了高水平的真EGF，在SN中大约为38mg·l^-1(图2b，泳道3；图4)，在CL中大约为36mg·l^-1(图2b，泳道4)。

另外一个值得注意的现象是，尽管在培养物中发生中间体混合物：OmpA-EGF-VMA-bFGF、OmpA-EGF-VMA和OmpA-EGF(图5)的高效胞内表达和分泌，但是JM101[pWK3R]在整个时间过程研究中仍保持良好的增长速率(图2a，泳道2和3；图2b，泳道3和4)。还有待明确的是为什么上述蛋白复合物的分泌表达仅仅和之前报导的单纯含有更小的OmpA-EGF中间体的同源群体(CL)一样弱(debilitating)。

讨论

过去在大肠杆菌中bFGF的表达通常是限制在使用传统的融合方法，传统方法中胞内的融合中间体随后被回收，并使用蛋白酶切割以释放bFGF最多作为衍生物。用于切割的额外手工步骤既繁琐又昂贵，还可能带来不确定因素。本发明使用大肠杆菌以高效表达bFGF作为分泌蛋白，更重要的是，重组的bFGF和它天然的对应物共享相同的蛋白序列。上面描述的结果支持了大肠杆菌也可以作为潜在的宿主进行胞外表达的发现。因此本发明提供了技术上可行的且合算的可替代的方案来生产真bFGF。

之前发展了一种高效的大肠杆菌外排系统JM101[pWKW2]，以促进真EGF的生产。如上所述的，本发明已证明了pWKW2构建体在通用大肠杆菌系统工程上的应用，以用于成功表达作为具有真正结构(表2)和有效生物活性(图4)的非融合产物的bFGF。另外，在相同的宿主中，真正的和具有生物活性的EGF也能得到高效共表达。

在pWKW2中，将bfgf基因(替换egf基因)直接融合到ompA前导序列上并不会导致像之前在EGF的表达中观察到的bFGF的高效外排生产(图2a，泳道6和7)。有趣并超出预料的是，在OmpA和bFGF之间插入VMA会导致在SN中外排生产大的(～73KDa)VMA-bFGF中间体(图2a，泳道5)。预想不到的是，在JM101[pWKW20VMA]中，作为胞内蛋白的VMA没有妨碍OmpA-VMA-bFGF的分泌(图1)。然而，SN中VMA-bFGF的进一步加工却被禁止(图2a，泳道5)，可能是因为VMA的大尺寸在物理学上干扰了切割的过程。

但是有趣的是，通过在VMA-bFGF的N端增加EGF，后者的分泌和切割都显示出了增强(图2a，泳道3；图2b，泳道3)。尽管在尺寸上较大，但是生产的中间体EGF-VMA-bFGF与VMA-bFGF相比，分泌和切割都更高效，不仅产出bFGF，也产出EGF，作为外排产物(图2b，泳道3)。OmpA-EGF-VMA-bFGF前体似乎能够获得扩展的结构，该结构显示出更高效地分泌以生产EGF-VMA-bFGF(图2a，泳道2；图2b，泳道4)。

在内含肽切割位点处存在的脯氨酸残基可能会对该位点的切割产生干扰。有趣的是，尽管脯氨酸残基是在bFGF的N端-外显肽中发现的(图1D)，但是在JM101[pWK3R]培养物中，在前体OmpA-EGF-VMA-bFGF和EGF-VMA-bFGF中，VMA和bFGF之间的切割很高效地发生，在SN和CL组分都生产了EGF和bFGF(图2A和2B)。推测原因可能是脯氨酸的存在趋向于在蛋白的螺旋构建体中引入“扭结”，使前体展现出扩展的，因而更开放的结构来促进切割过程。更进一步，因为中间体VMA-bFGF似乎是不可切割的(图2A，泳道6)，它在JMI0l[pWK3R]的CL和SN中都没有作为中间体存在(图2A，泳道2和3)，支持了这样的假想：从OmpA-EGF-VMA-bFGF和EGF-VMA-bFGF前体进行的bFGF的切割要么比EGF的切割更早，要么和EGF的切割同步。

值得注意的是，在SN和CL部分中，OmpA-EGF-VMA-bFGF和EGF-VMA-bFGF前体的切割都是自发进行的(图2A和2B)。从OmpA-EGF-VMA-bFGF和EGF-VMA-bFGF前体进行bFGF和EGF原位切割的证明和从SN和CL制品中高水平的回收两种多肽呈现了一种从内含肽-介导的表达中提取回收靶标蛋白的温和方法。但是，结果明显和之前的研究结果明显矛盾，在之前的结果中显示，外显肽从VMA融合体的释放需要使用还原剂和/或低pH。尽管本研究的结果有潜在的应用价值，但是仍然需要阐明在SN和CL中检测到的切割活性是否归因于前面假设的两种前体的扩展结构，或对于它们的表现有其它的解释。

尽管如此，在本研究中设计的融合蛋白可以作为研究侧翼序列的改变对VMA切割影响的卓越模型蛋白。迄今为止，外显肽环境对内含肽切割的影响知之甚少。

OmpA-EGF-VMA-bFGF在JMI0l[pWK3R]中表达后不久，这个大的(～82kDa)的前体要么保留在细胞质中要么进入分泌途径；同时，其会在VMA侧翼的两个切割位点处被进行加工以生产更小的中间体，包括OmpA-EGF-VMA、OmpA-EGF、VMA-bFGF和bFGF；前两种中间体被期望进行分泌，后两种将会留在细胞质中。值得注意的是，被证明被正确加工以生产真结构的bFGF分子(表2)，被鉴定为共存在于SN和CL中(图2a，泳道2和3)。这个新发现可以提供新观念，成熟分泌蛋白在细胞质中的表达不需要通过昂贵的和劳动密集型的传统的融合工序。

总而言之，OmpA-EGF-VMA-bFGF前体及其中间体形成了成熟bFGF和EGF的两个独立池，一个是分泌池，另一个是胞内池。值得注意的是，JMI0l[pWK3R]的细胞沉淀物展示出比其分泌的bFGF更大的bFGF储备(图2a，泳道2和3；图5)。另外，在CL中也检测到了显著水平的加工过的EGF。推测可能是，在CL中检测到的加工过的EGF在SecYEG通路中的肽酶切割后被捕获。与之前关于蛋白外排的发现相似，只有低水平的EGF和bFGF在细胞外周质中被检测到(数据未列出)。这些结果表明了这样的观点：OmpA-EGF-VMA-bFGF的切割在细胞质中高效发生以释放bFGF。之前企图使用内含肽来形成EGF融合体，然而，导致了大肠杆菌细胞质中不溶性聚合体的形成。尽管在pWKW2中，在微调的LacUV5盒的控制下，表达了高水平的OmpA-EGF-VMA-bFGF，这个大前体在细胞中保持溶解的能力对于随后作为具有生物活性和真产物的EGF和bFGF的获得是至关重要的。

另一方面，尽管OmpA-EGF-VMA-bFGF的大尺寸(图2B，泳道4)，但是它也能被很容易的分泌，推测可能是通过SecYEG的迁移机制来形成外排中间体：EGF-VMA-bFGF(图2B，泳道3)。但是，显示出，外排中间体能够被赋予高效的自我切割活性以进一步形成真bFGF和EGF(图2B，泳道3)。一般情况下，被推测形成折叠结构的细胞质蛋白不被限制进入分泌途径。因此，在EGF-VMA-bFGF的侧翼VMA中，具有EGF和bFGF作为N端和C端的外显肽，VMA的折叠趋势会被压制和阻止。结果就是EGF-VMA-bFGF能够能够分泌的扩展结构。这些发现对于大范围的胞内蛋白的表达是很重要的，要不然，如果细胞质表达是唯一的选择，细胞内蛋白可能会以融合蛋白或包涵体而结束。

总之，本发明中引入的通用型大肠杆菌系统被证实为至少是真EGF和bFGF或其他蛋白的高效共表达制造工厂。

方法

菌株和化学试剂

本研究中使用的宿主是大肠杆菌菌株JM101。PhusionPCR试剂盒、限制性内切酶和修饰酶购自NewEnglandBiolabs(Ipswich，MA，USA)。所有的寡核苷酸购自Invitrogen(Car1sbad，CA，USA)。如果没有特别说明则其他化学试剂购自Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO，USA)。抗bFGF和EGF以及作为细胞质内标识物的MazG的抗体在兔体内制造。

表达构建体的构建

作为PWKW2的衍生物，pWKW2FGFR，pWKW20VMA和pWK3R是通过下列修饰构建的。敲除包括LacUV5表达盒的EcoRI-EcoRI的片段，LacUV5表达盒中具有egf基因。首先使用寡核苷酸P1-P5(表1)作为引物，使用载体pSO和PWKW2作为模板，通过重叠延伸PCR合成具有bfgf基因的相同表达盒。然后通过EcoRI限制性内切酶和与PWKW2的重新连接来生产质粒pWKW2FGFR(图1a)。啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)血管膜ATP酶基因的SceVMA内含肽融合到bfgf基因的上游的在质粒pWKW20VMA(图1b)通过以下步骤进行构建：首先使用pTYB21和pWKW2FGFR构建体作为模板，寡核苷酸P6-P9(表1)作为引物，通过重叠延伸PCR形成预期的表达盒，然后是使用NruI和amHI对表达盒进行限制性酶切，然后与pWKW2FGFR连接。为了获得质粒pWK3R(图1c)，首先以pWKW2为模板，以寡核苷酸P10-11(表1)为引物，使用重叠延伸RCR形成表达盒，然后通过NruI和KpnI进行限制性酶切，并与pWKW20VMA连接。

震荡培养

大肠杆菌转化子在34℃下，于补充有70μg·ml^-1氨苄青霉素的MMBL培养基中生长。在实验进程中，在含有50ml生长培养基的250ml烧瓶中接种新长成的菌落，在34℃下以250rpm的转速震荡，直到培养物达到A₅₅₀＝8的密度。随后，加入0.1mM的IPTG，所述培养物继续生长8小时。接下来，将培养物离心，保留上清液(SN)。细胞沉淀使用120μ1的Tris.Cl缓冲液(50mM，pH8.0)重悬，接下来加入83μ1的EDTA溶液(0.25M，pH8.0)。将细胞混合物在冰上孵育5分钟，然后37℃下使用120μ1的溶菌酶溶液(10mg·ml^-1)处理20分钟。加入83μ1的裂解缓冲溶液((10mMEDTA，10％TritonX-100，和50mMTris.Cl，pH8.0)后，将离心管轻柔颠倒，然后13000rpm转速离心10分钟。上清液就是细胞裂解液物(CL)。SN和CL部分使用蛋白印迹(WesternBlot)分析bFGF和EGF，分析结果的图像用软件ImageJ(国立卫生研究院，美国)通过密度分析法进行定量。

硫酸铵沉淀

将硫酸铵加入到含有bFGF的SN中使其达到35％的饱和度。离心后，将含有bFGF活性的沉淀物(标记为A)溶解在5ml的50mM的Tris.Cl(pH7.5)中以用于后续的纯化。对于上清液，加入硫酸铵使其获得65％的饱和度。通过离心收集含有EGF活性的沉淀物(标记为B)，并溶解在5ml磷酸盐缓冲液(PB；每升含有1.44gNa₂HPO₄和0.24gKH₂PO₄，pH7.4)中以备后续的使用。

细胞裂解

将从400ml培养物(见上述震荡培养)中获得的细胞沉淀物溶解于50mM的Tris.Cl(pH7.5)中，重悬液使用细胞破碎系统(ConstantSystemsLtd.)在25kPa的压力下重复5次。将裂解产物在13500rpm转速下离心10分钟，保留上清液以纯化细胞内的bFGF。

EGF的纯化

使用QAE-交联葡聚糖A-25(AmershamPharmacia)离子交换色谱分析法纯化EGF的方法在之前已经描述过。合并含有EGF活性的部分，使用离心超滤装置(截留10kDa)(Millipore)过滤。然后，滤液使用Vivaspin500离心过滤装置(截留3kDa)(GEhealthcare)在13500rpm的转速下离心1小时进行净化。

EGF的分析

纯化的EGF使用装配有在355nm操作的smartbeam-II激光器的BrukerultrafleXtremeMALDI-TOF/TOF质量光谱仪(BrukerDaltonics，Bremen，德国)进行分析。使用FlexControl(版本3.3，BrukerDaltonics)软件来控制仪器的操作。通过操作人员调节MALDI激光器强度以获得质谱的最适强度和分辨率。将1μl的样品和1μl的基质芥子酸(BrukerDaltonics)预混合，然后将混合物涂抹(spot)到GroundSteel靶板(BrukerDaltonics)上。使用蛋白校准基准物I(BrukerDaltonics)来进行外部校准。在质谱分析法实验中使用线性模式以获得正离子质谱。

bFGF的纯化分析

使用肝素琼脂糖凝胶色谱分析法纯化bFGF，纯化的bFGF使用之前描述的液相色谱-质谱联用进行分析。

EGF和bFGF的生物测试

纯化的EGF和rbFGF对BALB/C3T3成纤维细胞增殖的促有丝分裂作用通过之前描述的MTT方法进行分析。简要地说，将BALB/C3T3细胞以5×10⁴的细胞密度接种至96孔板中，在补充有1.5％胎牛血清的DMEM培养基中37℃培养24小时。然后，分别使用以下混合物孵育所述细胞培养3天：(1)DMEM和EGF样品；(2)DMEM和商业化的EGF；(3)DMEM和bFGF样品；(4)DMEM和商业化的bFGF²¹；(5)DMEM。随后，向每孔中加入20μ1的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物)溶液，然后在37℃将平板孵育4小时。将液体从每个孔中移除，然后加入150μ1的DMSO来溶解紫色的晶体。使用酶标仪在570nm波长下对所述平板进行读数。相同的测试重复4次。由生长的细胞产生的NADPH还原酶活性造成的MTT的减少导致紫色甲臢的形成(OD570nm下检测)，提供了一种有助于量化细胞增殖的方法。

应当理解的是，在独立的实施方式和实验中为了清除而描述的本发明的一些特征，可以在单个实施方式或实验中进行组合提供。相反的，在单个的实施方式和实验中为了简洁而描述的本发明的多种特征可以独立提供或者在任何合适的亚组合中提供。值得注意的是，实施方式或实验的一些特征是通过非限制性实施例来说明的。同样，本领域的技术人员知晓出于简洁的目的而未列出的现有技术。

将以下参考文献的全文引入本申请中作为参考。

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