一种鉴别生长性能优异的晋南牛的IGF2基因分子标记及其应用

摘要

本发明公开了一种用于鉴别生长性能优异的晋南牛的IGF2基因分子标记SNP及其应用，通过对晋南牛IGF2基因的SNP位点进行基因分型，利用SAS9.2软件的GLM过程把基因分型结果与晋南牛的生长性状进行关联分析发现CC型个体的体重、体斜长和胸围极显著高于TT型个体(P<0.01)，CC型个体的体重和胸围显著高于CT型个体(P<0.05)。该位点的发现为进行分子育种提供了新的标记；本发明提供的鉴定生长性能高的晋南牛优势品种的方法准确可靠，方便易行，而且本发明提供的SNP标记不受年龄、性别等限制，可用于早期选育，加快育种进程。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种鉴别生长性能优异的晋南 牛的IGF2基因分子标记SNP、SNP的引物、SNP的试剂盒及鉴别方法。

背景技术

生长性状是肉牛主要的经济性状，其主要包括体高、体重、体斜长、 胸围、腹围、腰脚宽、坐骨端宽及十字部高等指标。同时生长性状是受多 基因座位控制的数量性状，表型选择遗传进展缓慢，影响生长性状的主基 因的确定对我国地方黄牛品种向肉用方向培育有重要意义。

单核苷酸多态性(SNP)是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组 研究中心学者Lander提出的一类遗传标记，主要是指在基因组水平上由单 个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单 个碱基的变异，表现形式有转换、颠换、插入和缺失等。测序、单链构象 多态性聚合酶链式反应、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应及飞行时 间质谱等技术可以实现SNP的检测。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基 因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。

胰岛素样生长因子2(insulin-likegrowthfactor2)又称为生长调 节素A，是由67个氨基酸残基组成的蛋白质，具有诱导细胞分化、促进有 丝分裂、胚胎形成、调控机体生长发育的作用。前人研究证明IGF2在牛的 骨骼肌再生过程中发挥着重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于鉴别生长性能优异的晋南牛的IGF2基 因分子标记SNP及其应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种用于鉴别生长性能优异的晋南牛的IGF2基因分子标 记SNP，所述分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，第71位点处的 碱基为C或T，此处碱基为C的晋南牛的生长性能显著高于此处碱基为T 的晋南牛。

本发明还提供了检测所述分子标记SNP的引物对，核苷酸序列如下：

正向引物F：5’-TGGCAGCGACTGCTACTATTG-3’，

反向引物R：5’-GAGCACTCCAAAGGCAGCTTT-3’，

SNP分型延伸引物：5’-AGTCGAGAGCCTGGGGCACCAG-3’。

所述引物对特异性扩增出SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种用于鉴别生长性能优异的晋南牛的试剂盒，所述 试剂盒包括引物F、引物R、SNP分型引物、PremixTaqTM、ExoI、FastAP、 ExoIbuffer、SnapshotMix中的一种或多种，其中PremixTaqTM由dNTPs、 DNA聚合酶、Mg2+、PCR缓冲液组成。

本发明还提供了一种利用SNP标记鉴定生长性能高的晋南牛的方法， 包括如下步骤：

(1)提取待检测晋南牛的基因组DNA；

(2)以第一步获得的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引 物F和R进行PCR扩增，获得晋南牛IGF2基因上203bp的目的片段；PCR 反应体系为25μL，其中100ng/μL基因组DNA模板1μL，10pmol/μL 引物F和R各1μL，12.5μLPremixTaqTM，9.5μLddH2O，PCR反应条 件为：95℃10min；94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，35个循环；72℃ 10min；4℃forever；

(3)利用SnaPshot技术检测PCR产物，首先对PCR产物纯化：取PCR 产物用ExoI和FastAP纯化，主要是用ExoI去除反应产物中的剩余引物， 用FastAP去除反应中剩余的DNTP，反应体系为PCR产物3ul，ExoI0.2ul， FastAP0.8ul，ExoIbuffer0.7ul，补水至7ul，反应条件为37℃15min，80℃ 15min；然后进行延伸反应：体系为已纯化PCR产物2ul，SnapshotMix试 剂1ul，延伸引物混合2ul，补水至6ul，条件为96℃1min；96℃10sec， 52℃5sec，60℃30sec，30个循环；取1ul延伸产物，加10ul上样loading， 95℃变性3min，立即冰水浴，上测序仪，如果扩增产物序列中71bp处为 C，则待测晋南牛属于生长性能高的优势个体。

本发明还提供了下述任一应用：

(1)上述分子标记SNP在鉴定生长性能高的晋南牛优势品种中的应用；

(2)上述引物对在鉴定生长性能高的晋南牛优势品种中的应用；

(3)上述试剂盒在鉴定生长性能高的晋南牛优势品种中的应用；

(4)上述方法在鉴定生长性能高的晋南牛优势品种中的应用。

本发明原理及有益效果：

本发明通过对晋南牛IGF2基因的SNP位点进行基因分型，利用SAS9.2 软件的GLM过程把基因分型结果与晋南牛的生长性状进行关联分析发现 CC型个体的体重、体斜长和胸围极显著高于TT型个体(P<0.01)，CC型 个体的体重和胸围显著高于CT型个体(P<0.05)。该位点的发现为进行分 子育种提供了新的标记。

本发明提供的鉴定生长性能高的晋南牛优势品种的方法准确可靠，方 便易行，而且本发明提供的SNP标记不受年龄、性别等限制，可用于早期 选育，加快育种进程。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明中晋南牛三种基因型SnaPshot测序分型图，其中(a)为 CT型，(b)为CC型，(c)为TT型；

图2为本发明中晋南牛三种基因型测序图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进 行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没 有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的 范围。

实施例1与晋南牛生长性状相关的IGF2基因分子标记的获得及鉴定

1.1待测晋南牛血液基因组DNA的提取

尾静脉采集待测晋南牛血液，常温放置3-4小时待血液凝固，此时血液 分为血清和凝血块两部分，血清呈清亮黄色，凝血块为暗红色，牛血液中 只有白细胞内含有DNA，存在于凝血块中。

利用天根血液/细胞/组织基因组DNA样品提取试剂盒从凝血块中提取 基因组DNA，具体步骤如下：

用眼科剪剪取0.2-0.3mL的凝血块放入已灭菌的2mL圆底离心管中， 加入500μL的细胞裂解液CL；

利用手持匀浆仪将血块充分匀浆，振荡15s，12000rpm离心1min，弃 去上层暗红色上清液；

再次加入700μL细胞裂解液CL，充分振荡使下层沉淀散开悬浮， 12000rpm离心1min，弃去上清液；

加入200μL缓冲液GS，充分涡旋至沉淀充分悬浮；

加入20μL蛋白酶K和250μL缓冲液GB，充分混匀；

将离心管用封口膜封好放入到56℃杂交炉中消化3-4小时，为确保充 分消化，消化过程中需要颠倒混匀数次，最终溶液变成清亮透明，简短离 心；

加入200μL冰镇无水乙醇，上下颠倒混匀15s，此时可能会出现絮状沉 淀；

将上一步所得溶液转入吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12000rpm 离心30s，弃去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；

向吸附柱CB3中加入500μL去蛋白缓冲液GD，静置2min，12000rpm 离心30s，弃去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；

向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW,12000rpm离心30s，弃去收集 管中的废液，将吸附柱放入收集管中；

向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW,12000rpm离心30s，弃去收集 管中的废液；

将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，弃去废液，将吸附柱置 于室温放置数分钟，彻底挥发吸附柱上残余的乙醇；

将吸附柱转入至一个新的离心管中，加入100μL56℃预热的TE缓冲液， 室温放置5min，12000rpm离心2min，基因组DNA则存在于离心管中。

1.2目的片段的扩增

根据NCBI上提供的牛IGF2基因序列，利用oligo6设计引物，包括正 向引物F：5’-TGGCAGCGACTGCTACTATTG-3’和反向引物R：5’- GAGCACTCCAAAGGCAGCTTT-3’，以1.1中基因组DNA为模板进行PCR 扩增，目的片段如SEQIDNO.1所示序列，SNP位点位于71bp处，此处碱 基为C或T。

PCR反应体系为25μL，其中100ng/μL基因组DNA模板1μL，10pmol/μL 引物F和R各1μL，12.5μLPremixTaqTM，9.5μLddH2O。

PCR反应条件为：95℃10min；94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec， 35个循环；72℃10min；4℃forever。

1.3基因分型

利用SnaPshot技术进行基因分型，具体步骤如下：

PCR产物纯化：取1.2中得到的PCR产物用ExoI和FastAP纯化，主 要是用ExoI去除反应产物中的剩余引物，用FastAP去除反应中剩余的 DNTP。

反应体系为PCR产物3ul，ExoI0.2ul，FastAP0.8ul，ExoIbuffer0.7ul， 补水至7ul。

反应条件为37℃15min，80℃15min。

延伸反应：体系为已纯化PCR产物2ul，SnapshotMix试剂1ul，延伸 引物混合2ul，补水至6ul。

条件为96℃1min；96℃10sec，52℃5sec，60℃30sec，30个循环；

取1ul延伸产物，加10ul上样loading，95℃变性3min，立即冰水浴， 上测序仪。

根据测序结果判读基因型，如图1所示，图1(a)为CT型，图1(b) 为CC型，图1(c)为TT型。

实施例2SNP位点与晋南牛生长性状的关联分析

本实施例中对中国山西不同晋南牛养殖场的356头晋南牛进行SNP分 型，IGF2基因如SEQIDNO.1所示序列的71bp处分型结果如表1所示。

运用SAS9.2软件的GLM过程进行基因型与生长性状之间的关联分析， 模型如下：

yijl＝μ+gi+hj+al+eijl，

其中，yijl为生长性状的表型值；μ为总体均值；gi为基因型效应；hj 为场效应；al为年龄效应；eijl为随机残差。

表1SNP基因型在所研究群体中的基因频率及等位基因频率

由表1可知，CC纯合型个体数显著高于TT型，C等位基因为优势基 因，卡方适合性检验χ2＝1.08<χ20.05(1)＝3.84,期望值与观测值差异不显著， 说明该SNP位点在群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态。

表2SNP基因型与晋南牛生长性状关联分析

注：不同大写字母表示差异极显著，不同小写字母表示差异显著

由表2可知，基因型对生长性状的影响达到显著水平，CC型个体的体 重、体斜长和胸围极显著高于TT型个体(P<0.01),CC型个体的体重和胸 围显著高于CT型个体(P<0.05)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在 本发明的保护范围之内。