一种基于固定化微生物技术修复土壤中雌二醇的方法

摘要

一种基于固定化微生物技术用于修复土壤中雌二醇的方法，涉及一种修复土壤的方法，包括以下过程：以叶腊石、棉仁饼与松针按重量份数比4:1:1混合为微生物固定化载体材料，灭菌后按照载体总重量的2-5%接入菌悬液，然后每天按l.5毫升每克载体的量补加增殖培养基，制得固定化微生物颗粒，将制备好的固定化微生物颗粒按土壤重量确定合适的投粒比，用于雌二醇污染土壤进行修复；本发明利用固定化微生物技术降解土壤中的雌二醇，并探求在不同的土壤环境条件下，即不同环境温度、不同的pH值以及土壤含水率条件下，考查雌二醇的降解效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种修复土壤的方法，具体的说是一种基于固定化微生物技术用于修复土壤中雌二醇的方法。

背景技术

环境雌激素（EnvironmentalEstrogens）是一类通过干扰生物体自身激素的合成、分泌、转运、结合、活性反应、代谢、消解或产生类似生物体自身激素的作用，对生物有机体维护正常的动态平衡、繁殖、生长及行为有不利影响的环境化学物质（生物体外源物质），也称为内分泌干扰物（EndocrineDisruptingChemicals，EDCs）。

人与动物的排泄物是自然环境中雌二醇的主要来源。一些养殖场为了促进畜禽生长，缩短养殖周期，在饲料中添加了大量的生长激素，这些激素会随着畜禽粪便排放到环境中用于施肥后，不仅会在农作物体内富集，还会随着降雨与灌溉过程进入到土壤乃至地下水中，从而对生态环境与人体健康均产生威胁。

雌二醇进入人和动物体内后可模拟细胞内雌激素作用或改变该雌激素活性、干扰内分泌系统的正常功能，甚至能使动物致死、致癌和致畸变性、影响性分化和生殖、改变动物行为以及影响动物体内正常代谢功能，且环境中纳克级浓度的雌二醇浓度就会影响生物体行为。由于雌二醇的正辛醇水分配系数高（3.8-4.01），水溶性差（溶解度一般为5.4-13.3毫克每升），排放到环境中后常被吸附于土壤或沉积物上，因此，土壤就成为其主要载体。目前针对雌二醇的处理主要集中在水环境中的去除，常见的处理方法有吸附法、化学氧化、光催化降解与生物降解等；而对于土壤中的雌二醇由于土壤介质的多相性，以及土壤环境的复杂性与非均质性，使得针对水环境中的处理方法应用于土壤受到限制且效果较差。综上，开发出实用性强、高效低能、安全环保的雌二醇污染土壤修复方法具有重要的实际意义。

随着固定化微生物技术在石油与农药污染治理领域内的成功应用，关于固定化微生物技术的深入研究越来越受到关注。固定化微生物技术主要是指通过物理或化学的方法将分散、游离的微生物固定在某一限定空间区域内，以提高微生物细胞的浓度，使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。与游离微生物修复技术相比，其特点是可以提高细胞的生物稳定性，增强了其耐环境冲击的能力，降低与土著菌的恶性竞争、避免被噬菌体吞噬，降低极端pH值和被污染土壤中毒性物质对微生物的毒害，使其在复杂环境中也可稳定地发挥高效能，且加快了微生物降解的反应启动速度，从而增强了微生物去除土壤中污染物的效率．另外，固定化材料还可以起到疏松剂的作用，加快氧气的输送，因而加速有机污染物的矿化作用。

发明内容

本发明涉及一种基于固定化微生物对雌二醇污染土壤的修复方法，其目的是利用固定化微生物技术降解土壤中的雌二醇，并探求在不同的土壤环境条件下，即不同环境温度、不同的pH值以及土壤含水率条件下，考查雌二醇的降解效果。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

以叶腊石、棉仁饼与松针按重量份数比4:1:1混合为微生物固定化载体材料，灭菌后按照载体总重量的2-5%接入菌悬液，然后每天按l.5毫升每克载体的量补加增殖培养基，制得固定化微生物颗粒，将制备好的固定化微生物颗粒按土壤重量确定合适的投粒比，用于雌二醇污染土壤进行修复，具体实施过程为：

（1）固定化载体材料的预处理

将新鲜的棉仁饼与松针在室温下风干后按重量比1:1混合，粉碎或辗碎过40目标准筛备用，将粒径为0.2-1毫米的叶腊石颗粒与过筛后的棉仁饼与松针按重量比4:1:1混合均匀后装入灭菌锅，121°C条件下高温蒸汽灭菌2.5小时，装入塑料桶内置于无菌室中待温度降到室温，备用；

（2）固定化微生物颗粒的制备

将含有雌二醇降解菌的菌悬液，均匀地加入经预处理后的固定化载体表面并混合均匀，接种量按照载体重量2-5%接入，密封后放入28°C恒温培养箱中避光培养，每天按l.5毫升每克载体的量补加增殖培养基（酵母0.5、酪蛋白酸水解物0.5、可溶性淀粉0.5、MgSO₄·7H₂O0.05、胰蛋白胨0.3、葡萄糖0.5、丙酮酸钠0.3、KH₂PO₄0.25，单位：克每升），增殖培养3天后制得固定化微生物颗粒。

（3）雌二醇污染土壤的制备

用天平准确称取10毫克雌二醇标准品于10毫升容量瓶内，用甲醇定容制得浓度为1克每升的雌二醇标准储备液，-20℃保存，备用。取一定量的雌二醇标准储备液利用超纯水稀释至10毫克每升制得标准工作液，4℃保存，备用。标准工作液现用现配。将采集的天然土壤经风干，121℃高温灭菌后，向其均匀喷洒浓度为10毫克每升的雌二醇标准工作液，使土壤中雌二醇含量为1毫克每千克。

（4）固定化微生物颗粒对雌二醇的降解效果

将制备好的固定化微生物颗粒按土壤重量5-15%的投粒比，投入雌二醇污染土壤中并混匀，利用缓冲溶液调节土壤pH为6-8，土壤含水率为15%至饱和，降解过程中每天对土壤补水一次以维持土壤含水率。整个降解过程中温度控制在10-40℃。14-15天后考查土壤中雌二醇的去除率。

所述菌悬液为假单胞菌与芽孢杆菌的混合菌液，均从雌二醇污染的土壤中富集、分离与纯化得到，菌液的菌体浓度为10⁶个/毫升。

本发明用于雌二醇污染土壤修复的固定化微生物颗粒以叶腊石为主要固定载体，并以棉仁饼与松针为辅助固定化载体为微生物的生产提供了生长所需的营养物质。由于叶腊石为2:1层状结构，层间以较弱的范德华力连接，在外加的机械力研磨条件下其结构易于沿层间破坏，使得离子或微生物可以较容易地进入层间，具有较强的吸附活性，成为良好的微生物固定化载体。若混合载体中叶腊石含量较高，虽然微生物的固定化效果较好，但因营养物质缺乏，不利于微生物的生长；相反，若叶腊石含量较低，对微生物的固定效果较差，微生物活性较低。因此，本发明选择叶腊石、棉仁饼与松针按重量4:1:1进行混合，不仅具有较好的微生物固定化效果，还能保证微生物所需营养物质。

本发明提出了一种基于固定化微生物技术对雌二醇污染土壤的修复方法，具有如下优点：

1、主要固定化载体材料叶腊石具有适合的孔隙度与良好的吸附性能，易于微生物的固定；且叶腊石、棉仁饼与松针均为环境友好型材料，来源广泛易获取，成本低，通气性良好，无毒，不会造成土壤的二次污染，亦可改良土壤结构、增加土壤肥力。

2、固定化微生物颗粒的制备过程操作简便，因而应用广泛。载体材料对微生物有良好的亲和力，固定化效率高，微生物增殖速度快，对环境中污染物的抗性得以大大改善，适用于污染土壤的大规模原位生物修复。

3、固定化微生物颗粒可以在较大的温度、pH值及土壤含水率范围内处理较高浓度的污染物，降解速度较快，修复时间为14-15天的条件下降解率高达60-85%，且修复后固定化颗粒仍然具有较高的活性。

具体实施方案

下面将通过实例对本发明作进一步详细说明，但下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

实施例1.一种基于固定化微生物技术修复土壤中雌二醇的方法

（1）固定化载体材料的预处理

将新鲜的棉仁饼与松针在室温下风干后按重量比1:1混合，粉碎或辗碎过40目标准筛备用，将粒径为0.2-1毫米的叶腊石颗粒与过筛后的棉仁饼与松针按重量比4:1:1混合均匀后装入灭菌锅，121°C条件下高温蒸汽灭菌2.5小时，装入塑料桶内置于无菌室中待温度降到室温，备用；

（2）固定化微生物颗粒的制备

将含有雌二醇降解菌的菌悬液，均匀地加入经预处理后的固定化载体表面并混合均匀，接种量按照载体重量3.5%接入，密封后放入28°C恒温培养箱中避光培养，每天按l.5毫升每克载体的量补加增殖培养基（酵母0.5、酪蛋白酸水解物0.5、可溶性淀粉0.5、MgSO₄·7H₂O0.05、胰蛋白胨0.3、葡萄糖0.5、丙酮酸钠0.3、KH₂PO₄0.25，单位：克每升），增殖培养3天后制得固定化微生物颗粒。

（3）雌二醇污染土壤的制备

用天平准确称取10毫克雌二醇标准品于10ml容量瓶内，用甲醇定容制得浓度为1克每升的雌二醇标准储备液，-20℃保存，备用。取一定量的雌二醇标准储备液利用超纯水稀释至10毫克每升制得标准工作液，4℃保存，备用。标准工作液现用现配。将采集的天然土壤经风干，121℃高温灭菌后，向其均匀喷洒浓度为10毫克每升的雌二醇标准工作液，使土壤中雌二醇含量为1毫克每千克，备用。

（4）固定化微生物颗粒对雌二醇的降解效果

将制备好的固定化微生物颗粒按土壤重量10%的投粒比，投入雌二醇污染土壤中并混匀，利用缓冲溶液调节土壤pH为7，土壤含水率为25%，降解过程中每天对土壤补水一次以维持土壤含水率。整个降解过程中温度控制在25℃。14天后土壤中雌二醇的去除率为82.3%（表1）。可见，固定化微生物颗粒对雌二醇的降解速度较快，且14天后固定化颗粒仍然具有85%以上的活性。说明利用固定化微生物颗粒修复雌二醇污染土壤是可行的。

表1不同固定化微生物颗粒投粒比的降解效果

实施例2，固定化微生物颗粒对雌二醇的降解效果

（1）固定化载体材料的预处理

将新鲜的棉仁饼与松针在室温下风干后按重量比1:1混合，粉碎或辗碎过40目标准筛备用，将粒径为0.2-1毫米的叶腊石颗粒与过筛后的棉仁饼与松针按重量比4:1:1混合均匀后装入灭菌锅，121°C条件下高温蒸汽灭菌2.5小时，装入塑料桶内置于无菌室中待温度降到室温，备用；

（2）固定化微生物颗粒的制备

将含有雌二醇降解菌的菌悬液，均匀地加入经预处理后的固定化载体表面并混合均匀，接种量按照载体重量3%接入，密封后放入28°C恒温培养箱中避光培养，每天按l.5毫升每克载体的量补加增殖培养基（酵母0.5、酪蛋白酸水解物0.5、可溶性淀粉0.5、MgSO₄·7H₂O0.05、胰蛋白胨0.3、葡萄糖0.5、丙酮酸钠0.3、KH₂PO₄0.25，单位：克每升），增殖培养3天后制得固定化微生物颗粒。

（3）雌二醇污染土壤的制备

用天平准确称取10毫克雌二醇标准品于10ml容量瓶内，用甲醇定容制得浓度为1克每升的雌二醇标准储备液，-20℃保存，备用。取一定量的雌二醇标准储备液利用超纯水稀释至10毫克每升制得标准工作液，4℃保存，备用。标准工作液现用现配。将采集的天然土壤经风干，121℃高温灭菌后，向其均匀喷洒浓度为10毫克每升的雌二醇标准工作液，使土壤中雌二醇含量为1毫克每千克，备用。

（4）固定化微生物颗粒对雌二醇的降解效果

将制备好的固定化微生物颗粒按土壤重量5%的投粒比，投入雌二醇污染土壤中并混匀，利用缓冲溶液调节土壤pH为7，土壤含水率为25%，降解过程中每天对土壤补水一次以维持土壤含水率。整个降解过程中温度控制在25℃。降低投粒比后，对土壤中雌二醇的降解效率略有降低，在5%投粒比情况下，14天后对土壤中的雌二醇仍具有较高的降解率，为76.7%（表1）。

实施例3，固定化微生物颗粒对雌二醇的降解效果

（1）固定化载体材料的预处理

将新鲜的棉仁饼与松针在室温下风干后按重量比1:1混合，粉碎或辗碎过40目标准筛备用，将粒径为0.2-1毫米的叶腊石颗粒与过筛后的棉仁饼与松针按重量比4:1:1混合均匀后装入灭菌锅，121°C条件下高温蒸汽灭菌2.5小时，装入塑料桶内置于无菌室中待温度降到室温，备用；

（2）固定化微生物颗粒的制备

将含有雌二醇降解菌的菌悬液，均匀地加入经预处理后的固定化载体表面并混合均匀，接种量按照载体重量4%接入，密封后放入28°C恒温培养箱中避光培养，每天按l.5毫升每克载体的量补加增殖培养基（酵母0.5、酪蛋白酸水解物0.5、可溶性淀粉0.5、MgSO₄·7H₂O0.05、胰蛋白胨0.3、葡萄糖0.5、丙酮酸钠0.3、KH₂PO₄0.25，单位：克每升），增殖培养3天后制得固定化微生物颗粒。

（3）雌二醇污染土壤的制备

用天平准确称取10毫克雌二醇标准品于10ml容量瓶内，用甲醇定容制得浓度为1克每升的雌二醇标准储备液，-20℃保存，备用。取一定量的雌二醇标准储备液利用超纯水稀释至10毫克每升制得标准工作液，4℃保存，备用。标准工作液现用现配。将采集的天然土壤经风干，121℃高温灭菌后，向其均匀喷洒浓度为10毫克每升的雌二醇标准工作液，使土壤中雌二醇含量为1毫克每千克，备用。

（4）固定化微生物颗粒对雌二醇的降解效果

将制备好的固定化微生物颗粒按土壤重量15%的投粒比，投入雌二醇污染土壤中并混匀，利用缓冲溶液调节土壤pH为7，土壤含水率为25%，降解过程中每天对土壤补水一次以维持土壤含水率。整个降解过程中温度控制在25℃。可见，当增加投粒比至15%时，14天后固定化微生物颗粒对土壤中雌二醇的降解率提高，为88.4%（表1）。

实施例4，温度对固定化微生物颗粒降解效果的影响。

（1）固定化载体材料的预处理

将新鲜的棉仁饼与松针在室温下风干后按重量比1:1混合，粉碎或辗碎过40目标准筛备用，将粒径为0.2-1毫米的叶腊石颗粒与过筛后的棉仁饼与松针按重量比4:1:1混合均匀后装入灭菌锅，121°C条件下高温蒸汽灭菌2.5小时，装入塑料桶内置于无菌室中待温度降到室温，备用；

（2）固定化微生物颗粒的制备

将含有雌二醇降解菌的菌悬液，均匀地加入经预处理后的固定化载体表面并混合均匀，接种量按照载体重量3.5%接入，密封后放入28°C恒温培养箱中避光培养，每天按l.5毫升每克载体的量补加增殖培养基（酵母0.5、酪蛋白酸水解物0.5、可溶性淀粉0.5、MgSO₄·7H₂O0.05、胰蛋白胨0.3、葡萄糖0.5、丙酮酸钠0.3、KH₂PO₄0.25，单位：克每升），增殖培养3天后制得固定化微生物颗粒。

（3）雌二醇污染土壤的制备

用天平准确称取10毫克雌二醇标准品于10ml容量瓶内，用甲醇定容制得浓度为1克每升的雌二醇标准储备液，-20℃保存，备用。取一定量的雌二醇标准储备液利用超纯水稀释至10毫克每升制得标准工作液，4℃保存，备用。标准工作液现用现配。将采集的天然土壤经风干，121℃高温灭菌后，向其均匀喷洒浓度为10毫克每升的雌二醇标准工作液，使土壤中雌二醇含量为1毫克每千克，备用。

（4）固定化微生物颗粒对雌二醇的降解效果

将制备好的固定化微生物颗粒按土壤重量10%的投粒比，投入雌二醇污染土壤中并混匀，利用缓冲溶液调节土壤pH为7，土壤含水率为25%，降解过程中每天对土壤补水一次以维持土壤含水率。设置4个平行降解过程分别控制在不同的温度条件下进行，分别设定温度为10、20、25、40℃。不同温度下，固定化微生物颗粒的降解效果均可以达到60%以上，且与温度呈正相关关系（表2）。

表2不同温度下固定化微生物颗粒的降解效果

温度（℃）10202540降解率（%）61.576.882.385.2

实施例5，pH值对固定化微生物颗粒降解效果的影响。

（1）固定化载体材料的预处理

将新鲜的棉仁饼与松针在室温下风干后按重量比1:1混合，粉碎或辗碎过40目标准筛备用，将粒径为0.2-1毫米的叶腊石颗粒与过筛后的棉仁饼与松针按重量比4:1:1混合均匀后装入灭菌锅，121°C条件下高温蒸汽灭菌2.5小时，装入塑料桶内置于无菌室中待温度降到室温，备用；

（2）固定化微生物颗粒的制备

将含有雌二醇降解菌的菌悬液，均匀地加入经预处理后的固定化载体表面并混合均匀，接种量按照载体重量3.5%接入，密封后放入28°C恒温培养箱中避光培养，每天按l.5毫升每克载体的量补加增殖培养基（酵母0.5、酪蛋白酸水解物0.5、可溶性淀粉0.5、MgSO₄·7H₂O0.05、胰蛋白胨0.3、葡萄糖0.5、丙酮酸钠0.3、KH₂PO₄0.25，单位：克每升），增殖培养3天后制得固定化微生物颗粒。

（3）雌二醇污染土壤的制备

用天平准确称取10毫克雌二醇标准品于10ml容量瓶内，用甲醇定容制得浓度为1克每升的雌二醇标准储备液，-20℃保存，备用。取一定量的雌二醇标准储备液利用超纯水稀释至10毫克每升制得标准工作液，4℃保存，备用。标准工作液现用现配。将采集的天然土壤经风干，121℃高温灭菌后，向其均匀喷洒浓度为10毫克每升的雌二醇标准工作液，使土壤中雌二醇含量为1毫克每千克，备用。

（4）固定化微生物颗粒对雌二醇的降解效果

将制备好的固定化微生物颗粒按土壤重量10%的投粒比，投入雌二醇污染土壤中并混匀。利用缓冲溶液调节土壤pH值，设置3个平行降解过程分别控制在不同的土壤pH值条件下进行，分别设定pH值为6、7、8。土壤含水率为25%，降解过程中每天对土壤补水一次以维持土壤含水率。整个降解过程中温度控制在25℃。14天后，不同pH值条件下，固定化微生物颗粒对土壤中雌二醇具有较好的降解效果，降解率均可以达到60%以上，其中在pH为7，即中性条件下降解率最高，酸性或碱性环境均会影响降解效果（表3）。

表3不同pH值条件下固定化微生物颗粒的降解效果

pH678降解率（%）67.482.373.3

实施例6，土壤含水率值对固定化微生物颗粒降解效果的影响。

（1）固定化载体材料的预处理

将新鲜的棉仁饼与松针在室温下风干后按重量比1:1混合，粉碎或辗碎过40目标准筛备用，将粒径为0.2-1毫米的叶腊石颗粒与过筛后的棉仁饼与松针按重量比4:1:1混合均匀后装入灭菌锅，121°C条件下高温蒸汽灭菌2.5小时，装入塑料桶内置于无菌室中待温度降到室温，备用；

（2）固定化微生物颗粒的制备

将含有雌二醇降解菌的菌悬液，均匀地加入经预处理后的固定化载体表面并混合均匀，接种量按照载体重量3.5%接入，密封后放入28°C恒温培养箱中避光培养，每天按l.5毫升每克载体的量补加增殖培养基（酵母0.5、酪蛋白酸水解物0.5、可溶性淀粉0.5、MgSO₄·7H₂O0.05、胰蛋白胨0.3、葡萄糖0.5、丙酮酸钠0.3、KH₂PO₄0.25，单位：克每升），增殖培养3天后制得固定化微生物颗粒。

（3）雌二醇污染土壤的制备

用天平准确称取10毫克雌二醇标准品于10ml容量瓶内，用甲醇定容制得浓度为1克每升的雌二醇标准储备液，-20℃保存，备用。取一定量的雌二醇标准储备液利用超纯水稀释至10毫克每升制得标准工作液，4℃保存，备用。标准工作液现用现配。将采集的天然土壤经风干，121℃高温灭菌后，向其均匀喷洒浓度为10毫克每升的雌二醇标准工作液，使土壤中雌二醇含量为1毫克每千克，备用。

（4）固定化微生物颗粒对雌二醇的降解效果

将制备好的固定化微生物颗粒按土壤重量10%的投粒比，投入雌二醇污染土壤中并混匀，利用缓冲溶液调节土壤pH为7，整个降解过程中温度控制在25℃。设置3个平行降解过程分别控制在不同的土壤含水率条件下进行，分别设定土壤含水率为15%、25%以及饱水，降解过程中每天对土壤补水一次以维持土壤含水率。14天后，不同土壤含水率下，固定化微生物颗粒对土壤中雌二醇降解率较高，均可以达到70%以上，且降解率随土壤含水率的增加而增大。

表4不同土壤含水率条件下固定化微生物颗粒的降解效果

含水率15%25%饱水降解率（%）75.582.386.4