使用实时荧光定量PCR方法指示龙须菜琼胶含量的引物及指示龙须菜琼胶含量的方法

摘要

本发明涉及使用实时荧光定量PCR指示龙须菜琼胶含量的引物，所述引物的序列为：GME-Q-S：TGGGTAAGATGGTGCTCGGATTT和GME-Q-A：TCAAAAGTCCTCCTGAGCCCGT。该技术具有以下优点：1、节约材料，只需要1g鲜重龙须菜材料就可以完成检测。2、无需碱处理工序，减少实验的危害性。3、特异性强，灵敏度高。4、操作简单，具有很强的推广性。5、加速良种筛选进程。

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种使用实时荧光定量PCR方法指 示龙须菜琼胶含量的引物及指示龙须菜琼胶含量的方法。

背景技术

琼胶不能人工合成，只能从产琼胶红藻中提取。石花菜属海藻的琼胶质量最 高，但藻体生长缓慢，形不成栽培产业。1960年，广东和海南开展了江蓠属细 基江蓠繁枝变种栽培，但其琼胶含量较低，而且琼胶质量达不到标准，我国产琼 胶海藻栽培基本是空白,迫切需要选择适当的产琼胶海藻物种并开展大规模栽 培。近年来，因为龙须菜具有生长快速、便于人工栽培和采收，且琼胶质量是江 蓠属中最好等特点，被广泛栽培、应用于琼胶产业。龙须菜藻体含胶量可以达到 20％-30％，是产琼胶海藻中的优良品种。

目前，我国龙须菜的栽培品系较少，并且在长期栽培过程中龙须菜出现了种 质退化现象，迫切需要筛选更多的优良品系。筛选龙须菜良种的标准主要是生长 率和耐受高温等。而作为生产上最需要的琼胶含量评估，因检测方法复杂、需要 大量的藻体而一直被人们所忽视，造成筛选出的良种虽然具有高的生长率，但琼 胶含量却不高。因此，急需一种需要藻体材料少，但能快速，准确的检测琼胶含 量的技术。

传统检测琼胶含量的技术：(摘自薛志欣2006龙须菜琼胶的提取方法研究)

高压锅提取法：碱处理后，使用高压锅高温高压提取。

沸水冷凝回流提取法：碱处理后，蒸馏水于盛有龙须菜的圆底烧瓶中，冷凝 回流，100℃沸水提取。

微波辅助高压锅提取法和超声辅助高压锅提取法：用高压锅提取前，先用微 波炉或超声波清洗器进行微波或超声波处理一定时间，其余步骤同高压锅法。

微波提取法：碱处理和提取后的处理和高压锅提取法一样，提取时采用微波 炉代替高压锅加热。

恒温水浴提取法：碱处理后，用90℃恒温水浴提取琼胶。提取时间和加水 量同高压锅提取法。

上述琼胶提取方法存在一些问题：1、需要大约30g鲜重的龙须菜藻体材料 才能完成琼胶的检测，通过传统的选择育种需要很长的时间才能得到足够多的材 料，费时费力。2、提取过程涉及碱处理工序，具有一定的危险性。3、提取过程 操作复杂，误差较大。

实时荧光定量PCR(qPCR)技术是一种对待测样品中特定的序列片段进行定 量分析的方法。自1996年，关于qPCR的第一篇研究被报道后，涉及qPCR的论 文数量每年呈指数增长。目前，qPCR是一种普遍的分析特定性状表达与基因表 达关系的技术。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供使用实时荧光定量PCR 方法指示龙须菜琼胶含量的引物及指示龙须菜琼胶含量的方法。

使用实时荧光定量PCR方法指示龙须菜琼胶含量的引物，所述引物的序列 为：

SEQ ID NO 1：GME-Q-S：TGGGTAAGATGGTGCTCGGATTT和

SEQ ID NO 2：GME-Q-A：TCAAAAGTCCTCCTGAGCCCGT。

一种使用实时荧光定量PCR方法指示龙须菜琼胶含量的方法，其特征在于： 使用荧光定量PCR分析龙须菜样本藻株GME基因相对表达量，以Gapdh和18S  rRNA为内参基因，以双内参基因的Ct值来校准藻株基因GME相对表达量，采 用2^-△△CT法进行数据的分析，样本ΔΔCT＝(CT_GME-CT_内参基因)样本-1.19，当样 本藻株GME基因的2^-△△CT>5时，该样本藻株即为高琼胶含量的藻株。

所述内参基因为：Gapdh和18S rRNA。

所述内参基因的引物为：

SEQ ID NO 3：Gapdh-S：GACCGTGCGTGGAGTCATAC；

SEQ ID NO 4：Gapdh-A:ATGGCTATCCCGAAAGTTGG；

SEQ ID NO 5：18S rRNA-S：GTTGGGGGCATTCGTAT；

SEQ ID NO 6：18S rRNA-A:ATCTCCAGTCCTCATCGTT。

使用实时荧光定量PCR方法指示龙须菜琼胶含量的方法，具体步骤如下：

(1)实验材料的培养与收集：

栽培海区选取一株约1g鲜重龙须菜样本；

(2)RNA提取；

(3)反转录合成的cDNA：

(4)qPCR：

利用反转录cDNA，进行qPCR反应；

qPCR反应体系如下：

荧光实时定量PCR的反应条件如下：

第一步，50℃，2min；

第二步，95℃，5min；

第三步，95℃，15sec；60℃，1min；40个循环；

第四步，做熔解曲线：95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec；60℃，15 sec；

荧光信号的采集设置在第三步；收集每个实验重复的目的基因Ct值和两个

内参基因的Ct值，两个内参基因Ct值计算时取几何平均值。

(5)基因相对表达量分析

采用2^-ΔΔCT的相对定量方法对样本龙须菜目的基因GME的相对表达量进行 分析；样本ΔΔCT＝(CT_GME-CT_内参基因)样本组-1.19；

当样本组2^-ΔΔCT>5，该样本藻株为高琼胶含量的藻株。

该技术具有以下优点：1、节约材料，只需要1g鲜重龙须菜的材料就可以完 成检测。2、无需碱处理工序，减少实验的危害性。3、特异性强，灵敏度高。4、 操作简单，具有很强的推广性。5、双内参基因同时使用，误差小。6、加速良种 筛选进程。

具体实施方式

本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨 姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件来进行操作。

GME是红藻琼胶合成途径中末端的关键酶，它能够催化D型甘露糖转化为L 型半乳糖，之后L型半乳糖和D型半乳糖聚合为琼胶。Gapdh,18S rRNA是广泛 用于荧光定量PCR的内参基因，同时使用两个内参基因在一定程度上消除了由于 内参基因不稳定所造成的误差。

使用Primer 5.0对引物进行设计，引物设计遵守以下原则：产物长度 75bp-200bp，避免二级结构，GC含量45％-55％，引物长度20-25bp，Tm值在58-62° C。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司进行合成。

实施例1

(1)实验材料的培养与收集：

栽培海区选取鲜重约16g的981品系龙须菜作为样本，另选取同等鲜重采自 湛山湾的野生品系作为对照于实验室进行驯化培养，培养条件为：添加Pro培养 基的灭菌海水，温度20℃，盐度33‰，光照20μmol m-²s-¹，培养周期12h光 照：12h黑暗。驯化培养时间为三天，三天后用于琼胶和RNA提取。

(2)琼胶的提取：

琼胶提取按照文献(薛定欣等,2006,Marinho-Soriano et al.,1999)略加改动进 行，具体步骤如下：

样本和对照龙须菜各约15g鲜重藻体，平均分为三份(三个重复)，每份藻 体清洗烘干后，称量记录每份藻体干重。向每份样品中添加NaOH溶液，按照 每0.1g藻体干重添加4mL NaOH(质量体积比2.5％)的比例添加；在85℃恒 温水浴，加热碱处理2h；用2层300目筛绢过滤碱处理后的藻体，再用蒸馏 水洗涤藻体，至约pH＝6.5左右；将上述龙须菜置于锥形瓶中，向每份样品中添 加蒸馏水，添加比例为每0.1g藻体干重添加6mL蒸馏水；将锥形瓶用棉塞封 口，放于高压锅中，温度保持120-125℃，煮2小时；待高压锅温度降温至80℃ 左右后，立即用4层300目筛绢重叠挤压过滤，收集滤液；滤液在室温凝固后， 于-20℃冷冻过夜；取出冷冻滤液，解冻后，用蒸馏水冲洗，再于60℃烘干至 恒重，所得即为粗提琼胶，称量并记录琼胶干重。琼胶含量百分比使用琼胶干重 /藻体干重来表示。对照龙须菜平均琼胶含量18％，样本龙须菜平均琼胶含量 20.9％。

(3)RNA提取：

样本和对照龙须菜0.3g鲜重藻体，平均分为三份(三个重复)，每份0.1g。 总RNA按照Omega Plant RNA Kit步骤略加改动进行提取，具体步骤如下：

取新鲜藻体尖部0.1g液氮研磨至粉末状，加入到含有10μL的巯基乙醇和 500μL裂解液RB的离心管中，涡旋裂解1分钟；14000×g，室温离心5min，转 移上清液置gDNA Fliter Column，柱子置于2mL的收集管；14000×g室温离心2min， 丢弃上面的柱子，向下方收集管中加入1/2体积的无水乙醇。用枪反复吹打混匀； 将混合后的液体转移至RNA Mini Column，置于新的收集管。10000×g，离心1 min，弃下层收集管中废液；将柱子重新放回收集管中，用400μL RWC Wash Buffer 洗脱柱子，10000×g，离心1min。弃掉柱子里的废液；将柱子重新放回收集管 中，用500μL RNA Wash BufferⅡ洗脱两次，同样于10000×g室温离心1min。弃 掉柱子里的废液；空柱离心2min后，将柱子置于1.5mL离心管中，向吸附柱中 央加入30μL DEPC水，室温下放置10min,于10000×g离心1min收集洗脱的RNA 溶液。

(4)反转录：

在提取的每份RNA中取2μL RNA溶液，用于琼脂糖凝胶电泳检测RNA的 提取质量，观察有无降解；另各取1μL RNA溶液，以DEPC水做空白对照，使 用NanoDrop 2000对RNA样品浓度和质量检测。反转录反应使用Takara的RT  reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒，按照以下程序进行：

基因组DNA的去除。

42℃保温2min，立即置于冰上。

反转录反应

配制反应液的过程在冰上进行。按以下表格体积加入各种成分。

反应步骤：37℃，15min；85℃，5sec；立即置于冰上。

合成的cDNA置于-20℃保存。

(5)qPCR实验：

样本和对照各设置三个生物学重复，每个生物学重复再设置三个技术重复， 每个重复反转录的cDNA，利用设计好的引物(如下表)进行qPCR反应。

qPCR反应使用罗氏的FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂盒，在ABI 7500荧光定量机器上进行。qPCR反应体系如下：

荧光实时定量PCR的反应条件如下：

第一步，50℃，2min；

第二步，95℃，5min；

第三步，95℃，15sec；60℃，1min；40个循环；

第四步，做熔解曲线：95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec；60℃， 15sec。

荧光信号的采集设置在第三步；收集每个重复的目的基因Ct值和两个内参基因 的Ct值，两个内参基因Ct值计算时取几何平均值。

(6)基因相对表达量与琼胶含量分析

GME基因的相对表达量分析采用2^-ΔΔCT的相对定量方法。样本ΔΔCT的计算 方法为：ΔΔCT＝(CT_GME-CT_内参基因)样本-对照ΔCT均值。

通过实验发现在实验室驯化培养三天后，对照龙须菜目的基因GME与内参 基因Gapdh的Ct值之差的平均值为0.29；目的基因GME与内参基因18S rRNA 的Ct值之差平均值为4.88。二者的几何平均值为1.19。为了减少实验误差，对 照CT均值我们设置为1.19。荧光定量计算中，当样本的2^-ΔΔCT>5时，表明GME 基因表达极显著增加。经计算，样本组的2^-ΔΔCT为7.84，大于5，说明GME基因 表达量极显著性增加。琼胶含量变化量分析使用SPSS软件的Tukey检验(P＝0.05) 对数据差异显著性进行评价。对照组的琼胶含量平均值为18％，样本组平均值为 20.9％。Tukey检验显示琼胶含量也极显著性增加(p<0.01)，琼胶含量增加了 12.4％。

经对不同来源、不同生长状态下龙须菜材料目的基因GME与内参基因的检 测，作为对照目的的龙须菜其ΔCT均值稳定在1.19附近，因此“对照ΔCT均值” 取1.19。

实施例2

(1)实验材料的培养与收集：

栽培海区选取鲜重约16g的ZC品系龙须菜作为样本，另选取同等鲜重采自 湛山湾的野生品系作为对照于实验室进行驯化培养，培养条件为：添加Pro培养 基的灭菌海水，温度20℃，盐度33‰，光照20μmol m-²s-¹，培养周期12h光 照：12h黑暗。驯化培养时间为三天，三天后用于琼胶和RNA提取。

(2)琼胶的提取：

琼胶提取按照文献(薛定欣等,2006,Marinho-Soriano et al.,1999)略加改动进 行，具体步骤如下：

对照与样本龙须菜各约15g鲜重藻体，平均分为三份(三个重复)，每份藻 体清洗烘干后，称量记录每份藻体干重。向每份样品中添加NaOH溶液，按照 每0.1g藻体干重添加4mL NaOH(质量体积比2.5％)的比例添加；在85℃恒 温水浴，加热碱处理2h；用2层300目筛绢过滤碱处理后的藻体，再用蒸馏 水洗涤藻体，至约pH＝6.5左右；将上述龙须菜置于锥形瓶中，向每份样品中添 加蒸馏水，添加比例为每0.1g藻体干重添加6mL蒸馏水；将锥形瓶用棉塞封 口，放于高压锅中，温度保持120-125℃，煮2小时；待高压锅温度降温至80℃ 左右后，立即用4层300目筛绢重叠挤压过滤，收集滤液；滤液在室温凝固后， 于-20℃冷冻过夜；取出冷冻滤液，解冻后，用蒸馏水冲洗，再于60℃烘干至 恒重，所得即为粗提琼胶，称量并记录琼胶干重。琼胶含量百分比使用琼胶干重 /藻体干重来表示。对照龙须菜平均琼胶含量为18％，样本龙须菜平均琼胶含量 21.3％。

(3)RNA提取：

样本龙须菜各约0.3g鲜重藻体，平均分为三份(三个重复)，每份0.1g。总 RNA按照Omega Plant RNA Kit步骤略加改动进行提取，具体步骤如下：

取新鲜藻体尖部0.1g液氮研磨至粉末状，加入到含有10μL的巯基乙醇和 500μL裂解液RB的离心管中，涡旋裂解1分钟；14000×g，室温离心5min，转 移上清液置gDNA Fliter Column，柱子置于2mL的收集管；14000×g室温离心2min， 丢弃上面的柱子，向下方收集管中加入1/2体积的无水乙醇。用枪反复吹打混匀； 将混合后的液体转移至RNA Mini Column，置于新的收集管。10000×g，离心1 min，弃下层收集管中废液；将柱子重新放回收集管中，用400μL RWC Wash Buffer 洗脱柱子，10000×g，离心1min。弃掉柱子里的废液；将柱子重新放回收集管 中，用500μL RNA Wash BufferⅡ洗脱两次，同样于10000×g室温离心1min。弃 掉柱子里的废液；空柱离心2min后，将柱子置于1.5mL离心管中，向吸附柱中 央加入30μL DEPC水，室温下放置10min,于10000×g离心1min收集洗脱的RNA 溶液。

(4)反转录：

在提取的每份RNA中取2μL RNA溶液，用于琼脂糖凝胶电泳检测RNA的 提取质量，观察有无降解；另各取1μL RNA溶液，以DEPC水做空白对照，使 用NanoDrop 2000对RNA样品浓度和质量检测。反转录反应使用Takara的RT  reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒，按照以下程序进行：

基因组DNA的去除。

42℃保温2min，立即置于冰上。

反转录反应

配制反应液的过程在冰上进行。按以下表格体积加入各种成分。

反应步骤：37℃，15min；85℃，5sec；立即置于冰上。

合成的cDNA置于-20℃保存。

(5)qPCR实验：

样本各设置三个生物学重复，每个生物学重复再设置三个技术重复，每个重 复反转录的cDNA，利用设计好的引物(如下表)进行qPCR反应。

qPCR反应使用罗氏的FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂盒，在ABI 7500荧光定量机器上进行。qPCR反应体系如下：

荧光实时定量PCR的反应条件如下：

第一步，50℃，2min；

第二步，95℃，5min；

第三步，95℃，15sec；60℃，1min；40个循环；

第四步，做熔解曲线：95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec；60℃， 15sec。

荧光信号的采集设置在第三步；收集每个重复的目的基因Ct值和两个内参基因 的Ct值，两个内参基因Ct值计算时取几何平均值。

(6)基因相对表达量与琼胶含量分析

GME基因的相对表达量分析采用2^-ΔΔCT的相对定量方法。样本ΔΔCT的计算 方法为：ΔΔCT＝(CT_GME-CT_内参基因)样本-1.19；

在荧光定量计算中，当样本的2^-ΔΔCT>5时，表明GME基因表达极显著增加。 经计算，样本组的2^-ΔΔCT为8.63，大于5，说明GME基因表达量极显著性增加。 琼胶含量变化量分析使用SPSS软件的Tukey检验(P＝0.05)对数据差异显著性 进行评价。对照组的琼胶含量平均值为18％，样本组平均值为21.3％。Tukey检 验显示琼胶含量也极显著性增加(p<0.01)，琼胶含量增加了15.5％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明 的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。