洋桔梗花粉超低温保存方法

摘要

本发明公开一种洋桔梗花粉超低温保存方法，先选取发育正常、无病虫危害的洋桔梗健壮植株，开花后收集花粉，并进行干燥；再将花粉置于2～6℃下冷藏2～5小时后，转入-15～-25℃冷冻3～6小时后，再投入液氮中保存一周，然后再置于-75～-85℃下长期保存，即完成对洋桔梗花粉的超低温保存。本发明的方法简单易行，能有效保证花粉生活力，在本发明的保存方法下花粉贮藏90天其生活力高达65%，新鲜花粉授粉后座果率100%，在本发明的保存方法下贮藏90天花粉授粉后座果率高达70%。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物花粉保存方法，具体是一种洋桔梗花粉超低温保存方法。

背景技术

洋桔梗（Eustomagrandiflorum）为龙胆科（Gentianaceae）草原龙胆属（Eustomarussellianum）1～2年生草本植物，因其花色丰富、姿态优美，被广泛用于鲜切花、园林布景等。洋桔梗是雌雄同花植物，雄蕊比雌蕊早成熟3～5天，在自然环境下属于异花授粉植物。花粉是种子植物的雄配子体，在有性繁殖中发挥着重要作用，对花粉进行贮藏保存是种质保存、杂交育种及商业制种的重要手段之一。

目前，洋桔梗育种主要方式是优势育种，花粉的提前采收和贮藏是必须的。洋桔梗自交系间杂交存在超强杂种优势，在制种过程中往往需要人工授粉来满足制种要求，而具有较高生命力的花粉是确保杂交成功的首要条件，所以，自交系花粉保存成为人工授粉最重要的前提，洋桔梗的花粉寿命很短，离开植株后自然条件下存活时间不长，这给种质保存和杂交育种工作带来极大的不利。花粉的长期保存技术能够克服在种子生产上和杂交育种工作中存在的时间和空间限制，还可以节省人力、物力，防止花粉过剩或缺少，亲本易丢失等一系列问题。花期不遇是洋桔梗杂交过程中经常遇到的问题之一，只有适宜的花粉贮藏条件保存花粉的活力是解决该问题的关键。

超低温技术是进行种质资源保存的一条新途径，是目前唯一可行的长期而稳定地保存种质资源的方法。将超低温保存技术应用于花粉保存，其优点：（1）操作简单易行、占用空间小、安全稳定；（2）保存成本低；（3）可以大大延长花粉的保存时间，使花粉的贮运和交换成为可能，同时还能很好服务于育种工作，提高育种效率；（4）经过低温保存的花粉能保持其遗传完整性和稳定性；（5）低温条件下还可以避免病虫害的引入，为地区间、国际间的种质交换提供方便。

目前，为满足种质资源保存和交换以及杂交育种工作的需求,花粉超低温保存研究日渐兴起并逐步深入,保存材料从农作物、果树逐渐扩展到药用植物、园林植物等各类植物花粉。但不同的植物花粉其超低温保存所采用的方法以及保存参数是不一样的，例如：在花粉超低温保存中，预冷冻的效果因植物种类不同而有较大差异,预冷冻对桃、梨,人参以及牡丹的花粉超低温保存的效果没有显著影响；刺葵花粉经预冷冻处理后比直接投入液氮的花粉生活力有所降低；番茄花粉经-25℃预冷冻能够显著提高超低温保存后花粉的萌发率，因此，对花粉预冷冻的处理完全不能一概而论。再者,超低温保存后化冻处理也因不同种类植物有所不同,例如：番茄花粉用自来水冲洗较理想；茄属花粉超低温保存后在50℃水浴中化冻10s效果最好；牡丹花粉在30℃温水浴化冻花粉有较高的萌发率；梅花花粉在室温化冻效果较差，用自来水冲洗及温水浴化冻效果最好,但二者间差异不明显。

因此，研发一种适合于洋桔梗花粉的可行的贮藏保存的方法是非常必要的。

发明内容

为解决现有洋桔梗花粉在自然条件下保存存在寿命短的问题，本发明提供一种洋桔梗花粉超低温保存方法。

本发明通过下列技术方案实现：一种洋桔梗花粉超低温保存方法，经过下列各步骤：

（1）花粉采集及干燥：选取发育正常、无病虫危害的洋桔梗健壮植株，开花后收集花粉，并进行干燥；

（2）冻存方法：将步骤（1）的花粉放入冻存管中并置于2～6℃下冷藏2～5小时后，转入-15～-25℃冷冻3～6小时后，再投入液氮中保存一周，然后再置于-75～-85℃下长期保存，即完成对洋桔梗花粉的超低温保存。

所述步骤（1）的收集花粉是在开花后1～2天采集洋桔梗花，取出花药，将花药均匀地散在蜡光纸上，置于室温下，用600瓦白炽灯在距离1米远处光照，待花药散粉后，用120目筛子过筛去杂，将过筛后的花粉用硫酸纸包好。

所述步骤（1）的干燥是按干燥剂与花粉质量比为250～350:1，将花粉与干燥剂一起置于室温下进行干燥2～5小时，使花粉含水量为4～7%。

所述干燥剂为变色硅胶。

所述步骤（2）所得洋桔梗花粉在使用时，置于室温下自然解冻后，再按常规方法直接用于授粉。

本发明具备的优点及效果：本发明的方法简单易行，根据需要，可随时随地从冰箱中取出用于制种生产。如果是远距离制种可采用冰盒携带花粉，到制种地后自然解冻，用于授粉。本发明的洋桔梗花粉超低温保存方法能有效保证花粉生活力，在洋桔梗制种生产上具有重要的实践与推广意义。经试验，正常花粉常温贮藏3天花粉活力完全丧失，而在本发明的保存方法下花粉贮藏90天其生活力高达65%，新鲜花粉授粉后座果率100%，在本发明的保存方法下贮藏90天花粉授粉后座果率高达70%。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

以洋桔梗“雪莱香槟”为例

（1）花粉采集及干燥：选取发育正常、无病虫危害的洋桔梗健壮植株，开花后1～2天采集洋桔梗花，取出花药，将花药均匀地散在蜡光纸上，置于室温下，用600瓦白炽灯在距离1米远处光照，待花药散粉后，用120目筛子过筛去杂，将过筛后的花粉用硫酸纸包好，按干燥剂与花粉质量比为300:1，与干燥剂变色硅胶一起置于密闭的玻璃容器内，在室温下进行干燥3小时，使花粉含水量为6%；

（2）冻存方法：将步骤（1）的花粉放入冻存管中并置于4℃下冷藏3小时后，转入-20℃冷冻5小时后，再投入液氮中保存一周，然后再置于-80℃下长期保存，即完成对洋桔梗花粉的超低温保存。

所得洋桔梗花粉在使用时，置于室温下自然解冻后，再按常规方法直接用于授粉。

运用TTC（氯化三苯基四氮唑）染色法对冻存前后花粉生活力进行比较，每处理做3次重复，每重复观察10个视野，并用人工授粉方法对冻存后花粉进行授粉，调查结果情况，每处理授粉10朵花，调查座果数，计算平均值，结果如下表1：

表1不同贮存条件下“雪莱香槟”花粉活力和座果率变化

从表1可看出，正常花粉常温贮藏3天花粉活力完全丧失，而在-80℃条件下花粉贮藏90天其生活力平均为62.1%。新鲜花粉授粉后座果率100%，-80℃贮藏90天花粉授粉后座果率平均为66.5%。

实施例2

以洋桔梗“神话紫边”为例

（1）花粉采集及干燥：选取发育正常、无病虫危害的洋桔梗健壮植株，开花后1～2天采集洋桔梗花，取出花药，将花药均匀地散在蜡光纸上，置于室温下，用600瓦白炽灯在距离1米远处光照，待花药散粉后，用120目筛子过筛去杂，将过筛后的花粉用硫酸纸包好，按干燥剂与花粉质量比为250:1，与干燥剂变色硅胶一起置于密闭的玻璃容器内，在室温下进行干燥5小时，使花粉含水量为7%；

（2）冻存方法：将步骤（1）的花粉放入冻存管中并置于2℃下冷藏2小时后，转入-15℃冷冻3小时后，再投入液氮中保存一周，然后再置于-85℃下长期保存，即完成对洋桔梗花粉的超低温保存。

所得洋桔梗花粉在使用时，置于室温下自然解冻后，再按常规方法直接用于授粉。

花粉活力和座果率变化见下表2：

表2不同贮存条件下“神话紫边”花粉活力和座果率变化

从表2可看出，正常花粉常温贮藏3天花粉活力完全丧失，而在-85℃条件下花粉贮藏90天其生活力平均为58%。新鲜花粉授粉后座果率100%，-85℃贮藏90天花粉授粉后座果率平均为63.3%。

实施例3

以洋桔梗“露西塔”为例

（1）花粉采集及干燥：选取发育正常、无病虫危害的洋桔梗健壮植株，开花后1～2天采集洋桔梗花，取出花药，将花药均匀地散在蜡光纸上，置于室温下，用600瓦白炽灯在距离1米远处光照，待花药散粉后，用120目筛子过筛去杂，将过筛后的花粉用硫酸纸包好，按干燥剂与花粉质量比为350:1，与干燥剂变色硅胶一起置于密闭的玻璃容器内，在室温下进行干燥2小时，使花粉含水量为4%；

（2）冻存方法：将步骤（1）的花粉放入冻存管中并置于6℃下冷藏5小时后，转入-25℃冷冻6小时后，再投入液氮中保存一周，然后再置于-75℃下长期保存，即完成对洋桔梗花粉的超低温保存。

所得洋桔梗花粉在使用时，置于室温下自然解冻后，再按常规方法直接用于授粉。

花粉活力和座果率变化见下表3：

表3不同贮存条件下“露西塔”花粉活力和座果率变化

从表3可看出，正常花粉常温贮藏3天花粉活力完全丧失，而在-75℃条件下花粉贮藏90天其生活力平均为58.2%。新鲜花粉授粉后座果率100%，-75℃贮藏90天花粉授粉后座果率平均为60%。

实施例4

以洋桔梗“波浪黄色”为例

（1）花粉采集及干燥：选取发育正常、无病虫危害的洋桔梗健壮植株，开花后1～2天采集洋桔梗花，取出花药，将花药均匀地散在蜡光纸上，置于室温下，用600瓦白炽灯在距离1米远处光照，待花药散粉后，用120目筛子过筛去杂，将过筛后的花粉用硫酸纸包好，按干燥剂与花粉质量比为300:1，与干燥剂变色硅胶一起置于密闭的玻璃容器内，在室温下进行干燥4小时，使花粉含水量为5%；

（2）冻存方法：将步骤（1）的花粉放入冻存管中并置于3℃下冷藏3小时后，转入-20℃冷冻5小时后，再投入液氮中保存一周，然后再置于-80℃下长期保存，即完成对洋桔梗花粉的超低温保存。

所得洋桔梗花粉在使用时，置于室温下自然解冻后，再按常规方法直接用于授粉。

花粉活力和座果率变化见下表4：

表4不同贮存条件下“波浪黄色”花粉活力和座果率变化

从表4可看出，正常花粉常温贮藏3天花粉活力完全丧失，而在-80℃条件下花粉贮藏90天其生活力平均为50.1%。新鲜花粉授粉后座果率100%，-80℃贮藏90天花粉授粉后座果率平均为53.3%。