在空气-液体界面处培养人胚胎干细胞以用于分化成胰腺内分泌细胞

摘要

本发明提供了通过在培养容器中的空气-液体界面处培养，来促进多能干细胞分化成表达PDX1、NKX6.1和HB9的胰腺内分泌细胞的方法、细胞培养物和分化培养基。本发明还提供了在所述空气-液体界面处培养的细胞的体内成熟。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请61/747,662(提交于2012年12月31日)的优先权，所述美国临时申请全文以引用的方式并入。

技术领域

本发明属于细胞分化领域。更具体地，本发明提供用于通过在空气-液体界面处培养细胞来从人多能干细胞生成胰腺内胚层细胞、胰腺内分泌前体细胞和单激素胰腺内分泌细胞的方法、细胞培养物和培养基。

背景技术

用于Ⅰ型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得人们把注意力集中在开发适于移植的胰岛素分泌细胞(即β细胞)的来源上。一种方法是从多能干细胞诸如胚胎干细胞生成功能性β细胞。

在脊椎动物胚胎发育中，多能细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群。组织诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏将从内胚层经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是定形内胚层的形成。

到原肠胚形成为止，内胚层划分成可通过一组因子的表达来识别的前-后域，所述因子唯一地标记内胚层的前、中和后区。例如，HHEX和SOX2识别内胚层的前区，而CDX1、CDX2和CDX4识别内胚层的后区。

内胚层组织的迁移使内胚层与有助于肠管的区域化的不同的中胚层组织紧密接近。这通过多种分泌因子诸如FGF、WNT、TGF-β、视黄酸(RA)和BMP配体及其拮抗剂来完成。例如，FGF4和BMP促进假定后肠内胚层中的CDX2的表达并阻遏前基因Hhex和SOX2的表达(2000 Development,127:1563–1567)。WNT信号转导也已显示与FGF信号转导平行工作，以促进后肠发育并抑制前肠命运(2007 Development,134:2207–2217)。最后，由间充质分泌的视黄酸调节前肠-后肠边界(2002 CurrBiol,12:1215-1220)。

特异性转录因子的表达水平可用于指定组织的身份。在定形内胚层转化成原肠管期间，肠管变得区域化成广泛域，所述广泛域可通过限制性基因表达模式在分子水平上进行观察。该肠管中的区域化胰腺域显示PDX1的极高表达以及CDX2和SOX2的极低表达。PDX1、NKX6.1、PTFlA和NKX2.2在胰腺组织中高度表达；而CDX2在肠组织中高度表达。

定形内胚层分化成胰内胚层从而形成胰腺。背侧和腹侧胰腺域产生自前肠上皮。前肠也产生食道、气管、肺、甲状腺、胃、肝脏和胆管系统。

胰腺内胚层的细胞表达胰-十二指肠同源盒基因PDX1。在不存在PDX1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，PDX1表达标志着胰腺器官形成的一个关键步骤。成熟的胰腺包括胰腺内胚层分化成的外分泌组织和内分泌组织。

D’Amour等人描述了在高浓度活化素和低血清的存在下，产生人胚胎干细胞衍生的定形内胚层的富集培养物(Nature Biotechnology 2005,23:1534-1541；美国专利7,704,738)。将这些细胞移植在小鼠的肾包膜下，据报道导致分化成具有内胚层组织特征的更成熟的细胞(美国专利7,704,738)。在添加FGF10和视黄酸后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞可进一步分化成PDX1阳性细胞(美国专利申请公布2005/0266554)。这些胰腺前体细胞在免疫缺陷小鼠的脂肪垫中的后续移植导致在3-4个月成熟期后形成功能胰腺内分泌细胞(美国专利7,993,920和美国专利7,534,608)。

Fisk等人报道用于由人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(美国专利7,033,831)。在这种情况下，分化途径分成三个阶段。人胚胎干细胞首先使用丁酸钠和活化素A的组合而分化成内胚层(美国专利7,326,572)。然后将细胞和与EGF或β细胞素(betacellulin)结合的BMP拮抗剂诸如头蛋白(Noggin)一起培养，以生成PDX1阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。

小分子抑制剂也已用于诱导胰腺内分泌前体细胞。例如，TGF-β受体和BMP受体的小分子抑制剂(Development 2011,138:861-871；Diabetes 2011,60:239-247)已用于显著提高胰腺内分泌细胞的数目。另外，小分子活化剂也已用于生成定形内胚层细胞或胰腺前体细胞(Curr Opin Cell Biol 2009,21:727-732；Nature Chem Biol 2009,5:258-265)。

HB9(也称为HlXB9和MNX1)是一种在胰腺发育早期表达的BHLH转录活化因子蛋白，该表达始于大约胚胎期第8天。HB9也在脊索和脊髓中表达。在以PDX1和NKX6.1表达细胞表达的胰腺上皮中，HB9的表达是短暂的并且在大约第10.5天达到峰值。在大约第12.5天时，HB9表达下降，并且在后期阶段其表达仅局限于β细胞。在HB9的无效突变的纯合子小鼠中，胰腺的背瓣无法发育(Nat Genet 23:67-70,1999；Nat Genet 23:71-75,1999)。HB9-/-β-细胞表达低水平的葡萄糖转运蛋白、GLUT2和NKX6.1。此外，HB9-/-胰腺显示出胰岛素阳性细胞数目显著降低，但是并未显著影响其他胰腺激素的表达。因此，对HB9的时间控制对于正常的β细胞发育和功能而言是至关重要的。虽然对关于调控β细胞中HB9表达的因子知之甚少，但是对斑马鱼的近期研究表明视黄酸可正向调控HB9的表达(Development,138,4597-4608,2011)。

甲状腺激素，即四碘甲状腺原氨酸(“T4”)和三碘甲状腺原氨酸(“T3”)是由甲状腺腺体产生的基于酪氨酸的激素，并且主要负责代谢调控。甲状腺激素在血液中的主要形式是T4，T4相较于T3具有更长的半衰期。释放到血液中的T4与T3的比率是大致20比1。在细胞中由脱碘酶将T4转变成活性更强的T3(活性是T4的三至四倍)。

T3结合至甲状腺激素受体TRα1和TRβ1(TR)。TR是一种核激素受体，该受体与类视黄醇X受体形成异源二聚体。当不存在配体时，所述二聚体结合至四碘甲状腺原氨酸应答元件(TRE)，并且充当转录抑制子。T3结合至TR降低了对TRE依赖性基因的抑制并且引发各种靶基因的表达。虽然多项研究已显示T3对增进β细胞增殖、减少细胞凋亡以及改善胰岛素分泌的作用，但是T3对细胞分化的作用尚不明确。

转化生长因子β(“TGF-β”)是多种生物学过程中所涉及的多效性细胞因子大家族的一员，所述生物学过程包括生长控制、分化、迁移、细胞存活、纤维变性和发育命运的特化。TGF-β超家族成员通过包括II型受体和I型受体在内的受体复合物传导信号。TGF-B配体(诸如活化素和生长分化因子(“GDF”))使II型受体与I型受体结合在一起。所述II型受体磷酸化并活化所述复合物中的I型受体。哺乳动物有五种II型受体：TβR-II、ActR-II、ActR-IIB、BMPR-II和AMHR-II，以及七种I型受体(ALK 1–7)。活化素和相关的配体经由ActR-II或ActR-IIB与ALK4或ALK5的组合来传导信号，并且BMP通过ALK2、ALK3和ALK6与ActR-II、ActR-IIB或BMPR-II的组合来传导信号。AMH通过AMHR-II与ALK6的复合物来传导信号，并且Nodal已经显示为通过ActR-IIB和ALK7的复合物来传导信号(Cell.2003,113(6):685-700)。在TGF-β配体结合至适当的受体之后，所产生的信号主要通过Smads复合物的活化来转导至细胞核。在活化时，所述I型受体磷酸化由受体调控的Smads亚族的成员。所述磷酸化使所述成员活化并且使得它们能够与常见的中介体Smad(Smad4)一起形成复合物。Smad1、Smad5和Smad8是ALK1、ALK2、ALK3和ALK6的底物，而Smad2和Smad3是ALK4、ALK5和ALK7的底物(FASEB J 13:2105–2124)。活化的Smad复合物在细胞核中积聚，在细胞核中所述复合物直接参与通常与其他特异性DNA结合转录因子相关联的靶基因的转录。选择性抑制TGF-β受体的化合物已被开发用于治疗应用，以及在从各种干细胞群重新编程和分化的情形中用于调控细胞命运。具体地，ALK5抑制剂已经早就用于将胚胎干细胞的分化引导至内分泌命运(Diabetes,2011,60(1):239-47)。

一般来讲，祖细胞分化成功能性β细胞的过程经历多个阶段；并且对从祖细胞诸如人多能干细胞生成胰腺细胞的方案的改善已经取得了显著进展。虽然有这些研究进展，但是祖细胞分化过程中的每一步骤均提出独特的挑战。因此，仍然存在针对形成功能性内分泌细胞的方案的需要，并且具体地功能性β细胞。

附图说明

图1A至图1H示出使用实例1中所述的方法在空气-液体界面处培养的细胞在以下时间点的相位对比图像：第1天(图1A)；第5天(图1B)；第6天(图1C)；第7天(图1D)；第9天(图1E)；第13天(图1F)；第16天(图1G)；以及第21天(图1H)。

图2A至图2K示出使用在实例1中所述的方法在空气-液体界面处分化一周并且针对以下物质进行免疫染色的细胞的图像：DAPI(图2A)；胰岛素(图2B)；HB9(图2C)；DAPI(图2D)；胰高血糖素(图2E)；胰岛素(图2F)；DAPI(图2G)；胰岛素(图2H)；生长抑素(图2I)；NKX6.1(图2J)；以及胰岛素(图2K)。实验组A-C、D-F、G-I和J-K取自相同的视野。

图3A至图3H示出使用在实例1中所述的方法在空气-液体界面处分化两周并且针对以下物质进行免疫染色的细胞的图像：胰岛素(图3A)；胰高血糖素(图3B)；胰岛素(图3C)；生长抑素(图3D)；胰岛素(图3E)；NKX6.1(图3F)；HB9(图3G)；以及NKX6.1(图2H)。实验组A-B、C-D、E-F和G-H取自相同的视野。

图4A至图4D示出使用在实例1中所述的方法在空气-液体界面处分化三周并且针对以下物质进行免疫染色的细胞的图像：胰岛素(图4A)，胰高血糖素(图4B)，胰岛素(图4C)，以及生长抑素(图4D)。实验组A-B和C-D取自相同的视野。

图5A至图5R示出了如实例1中所概述分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：PDX1(图5A)；NKX6.1(图5B)；PAX4(图5C)；PAX6(图5D)；NGN3(图5E)；NKX2.2(图5F)；ABCC8(图5G)；嗜铬粒蛋白-A(图5H)；PCSK1(图5I)；IAPP(图5J)；胰岛素(图5K)；胰高血糖素(图5L)；生长抑素(图5M)；生长素释放肽(图5N)；PTFlA(图5O)；ZIC1(图5P)；CDX2(图5Q)；以及SOX9(图5R)。细胞是在第5阶段(S5)之后在空气-液体界面处培养的。

图6A至图6L示出了如实例2中所概述分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：PDX1(图6A)；NKX6.1(图6B)；PAX4(图6C)；PAX6(图6D)；NGN3(图6E)；NKX2.2(图6F)；ABCC8(图6G)；嗜铬粒蛋白-A(图6H)；PCSK1(图6I)；IAPP(图6J)；胰岛素(图6K)；以及胰高血糖素(图6L)。

图7A至图7L示出了如实例3中所概述分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：PDX1(图7A)；NKX6.1(图7B)；PAX4(图7C)；PAX6(图7D)；NGN3(图7E)；NKX2.2(图7F)；ABCC8(图7G)；嗜铬粒蛋白-A(图7H)；PCSK1(图7I)；IAPP(图7J)；胰岛素(图7K)；以及胰高血糖素(图7L)。

图8A至图8H示出了如实例4中所概述分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：PDX1(图8A)；NKX6.1(图8B)；NGN3(图8C)；ABCC8(图8D)；PCSK1(图8E)；生长素释放肽(图8F)；胰高血糖素(图8G)；以及胰岛素(图8H)。

图9A至图9F示出了如实例4中所概述分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：PDX1(图9A)；NKX6.1(图9B)；NGN3(图9C)；ABCC8(图9D)；胰高血糖素(图9E)；以及胰岛素(图9F)。

图10A至图10B示出对根据实例4在空气-液体界面处培养并用1微摩尔SD208抑制剂(图10A)或1微摩尔ALK5抑制剂II(图10B)处理并且针对嗜铬粒蛋白-A(胰腺内分泌标志物)和NKX6.1(胰腺前体标志物和β细胞特异性标志物)进行染色的第6阶段细胞的免疫染色结果。

图11A至图11H示出了如实例6中所述分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：ABCC8(图11A)；胰高血糖素(图11B)；淀粉不溶素(图11C)；胰岛素(图11D)；NGN3(图11E)；NKX2.2(图11F)；NKX6.1(图11G)；以及PDX1(图11H)。所述数据示出为相对于未分化的H1细胞系成倍增长。

图12A至图12H示出了如实例7中所概述分化的并且在ALI处培养的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：ABCC8(图12A)；胰高血糖素(图12B)；淀粉不溶素(图12C)；胰岛素(图12D)；NGN3(图12E)；NKX2.2(图12F)；NKX6.1(图12G)；以及PDX1(图12H)。

图13A至图13H示出了如实例8中所概述分化的并且在ALI处培养的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：ABCC8(图13A)；胰高血糖素(图13B)；淀粉不溶素(图13C)；胰岛素(图13D)；NGN3(图13E)；NKX2.2(图13F)；NKX6.1(图13G)；以及PDX1(图13H)。

图14A至图14H示出了如实例9中所概述分化的并且在ALI处培养的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：ABCC8(图14A)；胰高血糖素(图14B)；淀粉不溶素(图14C)；胰岛素(图14D)；ISL-1(图14E)；MNX1(图14F)；NKX6.1(图14G)；以及SLC30A8(图14H)。

图15A至图15J示出根据实例10分化并且针对下列基因进行染色的第5阶段第3天(S5D3)的细胞的FACS分布图：同种型对照(图15A)；NKX6.1(图15B)；NKX2.2(图15C)；NKX6.1(Y轴)与胰岛素(X轴)共染色(图15D)；PDX1(X轴)与KI-67(Y轴)共染色(图15E)；PAX6(图15F)；ISL-1(图15G)；FOXA2(图15H)；NeuroD(图15I)；以及胰高血糖素(Y轴)与胰岛素(X轴)共染色(图15J)。

图16A至图16I示出根据实例10分化并且针对下列基因进行染色的第6阶段第5天的细胞的FACS分布图：同种型对照(图16A)；NKX6.1(Y轴)与嗜铬粒蛋白-A(X轴)共染色(图16B)；NKX2.2(Y轴)与嗜铬粒蛋白-A(X轴)共染色(图16C)；NKX6.1(Y轴)与胰岛素(X轴)共染色(图16D)；PDX1(X轴)与KI-67(Y轴)共染色(图16E)；PAX6(图16F)；ISL-1(图16G)；FOXA2(图16H)；以及NeuroD(图16I)。

图17A至图17I示出根据实例10分化并且针对下列基因进行染色的第6阶段第15天的FACS(细胞的荧光活化细胞分选)(Fluorescence-activatedcell sorting；FACS)分布图：同种型对照(图17A)；NKX6.1(Y轴)与嗜铬粒蛋白-A(X轴)共染色(图17B)；NKX2.2(Y轴)与嗜铬粒蛋白-A(X轴)共染色(图17C)；胰高血糖素(Y轴)与胰岛素(X轴)共染色(图17D)；NKX6.1(Y轴)与胰岛素(X轴)共染色(图17E)；PDX1(X轴)与KI-67(Y轴)共染色(图17F)；ISL-1(图17G)；FOXA2(图17H)；以及NeuroD(图17I)。

图18A至图18C示出根据实例1分化并且针对下列基因进行染色的第4阶段第4天(S4D4)的FACS(细胞的荧光活化细胞分选)分布图：NKX6.1(Y轴)与嗜铬粒蛋白-A(X轴)共染色(图18A)；PDX1(X轴)与KI-67(Y轴)共染色(图18B)；以及NKX6.1(Y轴)与胰岛素(X轴)共染色(图18C)。

图19A至图19C示出根据实例11分化并且针对下列基因进行染色的第6阶段第6天的FACS(细胞的荧光活化细胞分选)分布图：NKX6.1(Y轴)与嗜铬粒蛋白-A(X轴)共染色(图19A)；PDX1(X轴)与KI-67(Y轴)共染色(图19B)；以及NKX6.1(Y轴)与胰岛素(X轴)共染色(图19C)。

图20示出如实例11所述移植有各种细胞群的NOD-SCID小鼠中的人C肽制备的体内动力学。

图21A至图21F示出如实例12中所概述分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：淀粉不溶素(图21A)；胰岛素(图21B)；MAFA(图21C)；NKX6.1(图21D)；PTF1a(图21E)；以及SOX9(图21F)。

图22A至图22D示出如实例13中所概述分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的实时PCR数据：MAFA(图22A)；胰岛素(图22B)；淀粉不溶素(图22C)；以及NKX6.1(图22D)。

图23A至图23F示出如实例5中所概述的分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：PDX1(图23A)；NKX6.1(图23B)；NGN3(图23C)；ABCC8(图23D)；胰高血糖素(图23E)；以及胰岛素(图23F)。

具体实施方式

在结合附图阅读以下对本发明的详细说明时能够更好地进行理解。提供附图是出于说明本发明的某些实施例的目的。然而，本发明不限于示出的精确布置方式、实例和工具。为了清晰说明本公开内容，以非限制性方式将本发明的具体实施方式分成描述或阐明本发明某些特征、实施例或应用的小节。

本发明涉及通过以下方法使内胚层祖细胞诸如多能干细胞分化成表现出胰腺内分泌细胞特征的细胞：至少部分地在存在于开放培养容器中或部分填充有培养基的培养容器中的空气-液体界面处培养所述祖细胞。虽然为了方便起见而在本文中称作“空气”，但是本发明不限于在周围环境中存在的气体和组合物的混合物。本发明具体地设想和包括具有与周围环境不同的组合物的气态混合物，包括例如富含特定组分或其中特定组分已经被耗尽或消除的混合物。

另外，本发明提供用于使多能干细胞分化成表现出胰腺内分泌细胞特征的细胞的细胞培养物，以及引发和促进此类分化的分化培养基。有利地，这些细胞培养物和分化培养基可与空气-液体界面处的分化结合使用来提供先前未达到的表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞的收率。

培养可在从多能干细胞至胰腺内分泌细胞的分化途径中所涉及的所有阶段在空气-液体界面处发生，或培养可涉及在分化的早期阶段在浸没于培养基中的平坦培养物上培养，而在分化的后期阶段在空气-液体界面处培养。优选地，本发明的过程涉及早期阶段期间在浸没于培养基中的支撑表面上培养多能干细胞和随后在分化的后期阶段在空气-液体界面处培养的组合。在此类实施例中，可将所述细胞初始接种在固体表面上以进行浸没培养，随后将细胞从所述固体载体去除并且重新接种到多孔支承体上以进行在空气-液体界面处的培养。作为另一种选择，可将所述细胞初始接种在多孔支承体上，随后在分化的早期阶段将该支承体浸没于培养基中，并且随后在分化的后期阶段将该支承体定位在空气-液体界面处。相较于在整个过程中以浸没状态培养细胞，于分化的后期阶段在空气-液体界面处培养显著提升了分泌性标志物的表达，指示更大百分比的细胞已分化成胰腺内分泌细胞。

在一个实施例中，本发明涉及在部分填充有培养基的培养容器的空气-液体界面处使内胚层祖细胞分化成对于NKX6.1、PDX1和HB9呈阳性的胰腺内胚层祖细胞。本发明部分地基于以下发现：在空气-液体界面处培养显著提升了内分泌标志物的表达。此外，已经发现胰腺内分泌前体细胞可容易地在空气-液体界面处生成，从而使得主要生成单激素胰岛素阳性细胞。已发现空气-液体界面处的单细胞接种改善了胰岛素制备的一致性。

定义

干细胞是通过其在单细胞水平上既自我更新又分化的能力来定义的未分化细胞。干细胞可产生子代细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和终末分化细胞。干细胞的特征还在于其在体外分化成来自多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的多种细胞谱系的功能细胞的能力。干细胞还在移植后产生多种胚层的组织，并且在注射到胚泡内之后，促成基本上至大部分(如果不是所有的话)组织。

干细胞是根据其发育潜能分类的。多能干细胞能够产生所有胚胎细胞类型。

分化是这样一个过程，通过该过程，非特化的(“非定向的”)或少特化的细胞可获得特化细胞(例如，神经细胞或肌细胞)的特征。分化细胞是已在细胞的谱系内占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用于分化过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型亚群，且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或退回到分化程度较低的细胞类型。“去分化”指细胞退回到细胞的谱系内特化(或定向)程度较低的地位的过程。本文所用的“细胞的谱系”限定细胞的遗传，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞的谱系将细胞定位于发育和分化的遗传方案内。谱系特异性标志物指与感兴趣谱系的细胞的表型明确相关的特征，并且可用来评估未定向细胞向感兴趣的谱系的分化。

本文所用的“标志物”是在感兴趣的细胞中差异表达的核酸或多肽分子。在该语境中，差异表达意指与未分化细胞相比针对阳性标志物的升高的水平以及针对阴性标志物的下降的水平。标志物核酸或多肽在感兴趣的细胞中的可检测水平充分地高于或低于在其他细胞中的那些，使得可使用本领域已知的多种方法中的任何一种将感兴趣的细胞与其他细胞鉴别和区分开来。

如本文所用，当在细胞中充分地检测到特定标志物时，细胞“对于特定标志物是阳性的”或是“阳性的”。相似地，当在细胞中未充分检测到特定标志物时，细胞“对于特定标志物是阴性的”或是“阴性的”。具体地，用FACS检测到的阳性通常大于2％，而用FACS检测到的阴性阈值通常小于1％。用PCR检测到的阳性通常小于34个循环(Cts)；而用PCR检测到的阴性通常大于34.5个循环。

为了尝试在静态体外细胞培养物中将多能干细胞的分化复制到功能性胰腺内分泌细胞中，所述分化过程通常被视为通过多个连续阶段进化。具体地，所述分化过程常常被视为通过六个阶段进化。在该逐步进化中，“第1阶段”是指该分化过程的第一步骤，其中使多能干细胞分化成表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞(在下文被替代地称为“第1阶段细胞”)。“第2阶段”是指第二步骤，其中使表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞分化成表达肠管细胞的特征性标志物的细胞(在下文被替代地称为“第2阶段细胞”)。“第3阶段”是指第三步骤，其中使表达肠管细胞的特征性标志物的细胞分化成表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞(在下文被替代地称为“第3阶段细胞”)。“第4阶段”是指第四步骤，其中使表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞(在下文被替代地称为“第4阶段细胞”)。“第5阶段”是指第五步骤，其中使表达胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层细胞和/或胰腺内分泌前体细胞的特征性标志物的细胞(在下文被统称为“胰腺内胚层/内分泌前体细胞”或被替代地称为“第5阶段细胞”)。“第6阶段”是指使表达胰腺内胚层/内分泌前体细胞的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞(在下文被替代地称为“第6阶段细胞”)。

然而应当指出的是，并非具体群体中的所有细胞都以相同速率通过这些阶段进化。因此，在体外细胞培养物中检测到存在比群体中存在的大部分细胞沿分化途径进化更少或更多的细胞的情况并不少见，具体地在后期分化阶段。例如，在第5阶段的细胞培养期间观察到胰腺内分泌细胞的特征性标志物的出现的情况并不少见。出于说明本发明的目的，与上文识别的各阶段相关联的各种细胞类型的特性如本文所述。

本文所用的“定形内胚层细胞”指具有在原肠胚形成期间从上胚层产生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达下述标志物中的至少一种：FOXA2(也被称为肝细胞核因子3β(“HNF3β”))、GATA4、SOX17、CXCR4、Brachyury、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99和MIXL1。定形内胚层细胞的特征性标志物包括CXCR4、FOXA2和SOX17。因此，定形内胚层细胞可通过其对CXCR4、FOXA2和SOX17的表达来表征。此外，取决于允许细胞保持在第1阶段的时长，可观察到HNF4α的增长。

如本文所用的“肠管细胞”是指源于定形内胚层的细胞，所述细胞能够产生所有的内胚层器官，诸如肺、肝、胰腺、胃和肠。肠管细胞可通过相较于由定形内胚层细胞对HNF4α的表达，对HNF4α的基本上增长的表达来表征。例如，在第2阶段期间可观察到HNF4α的mRNA表达的十到四十倍的增长。

如本文所用的“前肠内胚层细胞”指产生食道、肺、胃、肝、胰腺、胆囊和一部分十二指肠的内胚层细胞。前肠内胚层细胞表达下述标志物中的至少一种：PDX1、FOXA2、CDX2、SOX2和HNF4α。前肠内胚层细胞可通过其相较于肠管细胞，对PDX1的表达的增长来表征。例如，通常第3阶段培养物中大于百分之五十的细胞表达PDX1。

如本文所用，“胰腺前肠前体细胞”是指表达下述标志物中的至少一种的细胞：PDX1、NKX6.1、HNF6、NGN3、SOX9、PAX4、PAX6、ISL1、胃泌素、FOXA2、PTF1a、PROX1和HNF4α。胰腺前肠前体细胞可通过对PDX1、NKX6.1和SOX9的表达为阳性来表征。

如本文所用，“胰腺内胚层细胞”是指表达下述标志物中的至少一种的细胞：PDX1、NKX6.1、HNF1β、PTF1α、HNF6、HNF4α、SOX9、NGN3；胃泌素；HB9或PROX1。胰腺内胚层细胞可通过其缺乏对CDX2或SOX2的基本的表达来表征。

如本文所用，“胰腺内分泌前体细胞”是指能够变成胰腺激素表达细胞的胰腺内胚层细胞。胰腺内分泌前体细胞表达下述标志物中的至少一种：NGN3；NKX2.2；NeuroD1；ISL1；PAX4；PAX6；或ARX。胰腺内分泌前体细胞可通过其对NKX2.2和NeuroD1的表达来表征。

如本文所用，“胰腺内分泌细胞”指能够表达至少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、生长素释放肽和胰多肽。除了这些激素以外，胰腺内分泌细胞的特征性标志物还包括以下一种或多种标志物：NGN3、NeuroD1、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4、ARX、NKX2.2和PAX6。表达β细胞的特征性标志物的胰腺内分泌细胞可通过其对胰岛素以及至少一种下列转录因子的表达来表征：PDX1、NKX2.2、NKX6.1、NeuroD1、ISL1、HNF3β、MAFA和PAX6。

在本文中可互换使用的是“d1”、“1d”和“第1天”；“d2”、“2d”和“第2天”等等。这些数字字母组合是指在本专利申请的逐步分化方案过程中的不同阶段中温育的具体天数。

在本文使用的“葡萄糖”是指右旋糖，在自然界中通常发现的糖。

本文所用的“NeuroD1”识别在胰腺内分泌祖细胞中表达的蛋白质及其编码基因。

“LDN-193189”是指((6-(4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯基)-3-(吡啶-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶，盐酸盐；DM-3189))，一种可以商标STEMOLECULE^TM购自Stemgent,Inc.,Cambridge,MA,USA的BMP受体抑制剂。

多能干细胞的表征、来源、扩增和培养

A.多能干细胞的表征

多能干细胞可表达一种或多种指定的TRA-1-60和TRA-1-81抗体(Thomson等人，1998，Science 282:1145-1147)。多能干细胞在体外的分化导致TRA-1-60和TRA-1-81丧失表达。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，所述碱性磷酸酶活性可通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用以商标Red出售的碱性磷酸酶底物试剂盒显色来检测，如由制造商(Vector Laboratories,CA,USA)描述的。未分化的多能干细胞通常也表达OCT4和TERT，如通过RT-PCR检测。

增殖的多能干细胞的另一理想表型是分化成所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞的潜能。可以例如通过如下方式来确认干细胞的多能性：将细胞注射入重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠，使用4％的多聚甲醛固定形成的畸胎瘤，然后针对来自该三个胚层的细胞类型的证据进行组织学检测。作为另一种选择，可以通过产生胚状体并评估胚状体中与三个胚层相关的标志物的存在来确定多能性。

增殖的多能干细胞系可用标准G显带技术进行核型分析并与公开的相应灵长类物种的核型相比较。希望获得具有“正常核型”(其意指细胞是整倍体的)的细胞，其中所有人染色体都存在并且无明显的改变。

B.多能干细胞的来源

可使用的多能干细胞的示例性类型包括建立的多能细胞系，包括在妊娠期间的任何时间取得的胚胎前组织(诸如胚泡)、胚胎组织或胎儿组织，所述时间通常但不一定是在约10至12周妊娠前。非限制性例子是建立的人胚胎干细胞系或人胚胎干细胞，诸如人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCell Research Institute,Madison,WI,USA)。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群的细胞。还可使用诱导多能细胞(IPS)或重新编程的多能细胞，其可使用多种多能相关的转录因子的被迫表达而来源于成人体细胞，所述转录因子诸如OCT4、NANOG、SOX2、KLF4和ZFP42(Annu Rev Genomics Hum Genet 2011,12:165-185)；还参见IPS,Cell,126(4):663-676)。在本发明的方法中使用的人胚胎干细胞也可如由Thomson等人描述的进行制备(美国专利5,843,780；Science,1998,282:1145-1147；Curr Top Dev Biol 1998,38:133-165；Proc Natl Acad SciU.S.A.1995,92:7844-7848)。也可使用突变的人胚胎干细胞系，诸如BG01v(BresaGen,Athens,Ga.)；或衍生自成人体细胞的细胞，诸如在Takahashi等人，Cell 131:1-12(2007)中公开的细胞。在某些实施例中，适用于本发明的多能干细胞可以根据在以下文献中描述的方法来获得：Li等人(Cell StemCell 4:16-19,2009)；Maherali等人(CellStem Cell 1:55-70,2007)；Stadtfeld等人(Cell Stem Cell 2:230-240)；Nakagawa等人(Nature Biotechnol 26:101-106,2008)；Takahashi等人(Cell 131:861-872,2007)；以及美国专利申请公布2011/0104805的正式申请。在某些实施例中，所述多能干细胞可为非胚胎来源的。所有这些参考文献、专利和专利申请全文以引用方式并入本文中，尤其当它们与多能细胞的分离、培养、扩增和分化有关时。

C.多能干细胞的扩增和培养

通常在饲养细胞层上培养多能干细胞，饲养细胞可以多种方式支持多能干细胞。作为另一种选择，可在培养系统中培养多能干细胞，所述培养系统基本上不含饲养细胞，但支持多能干细胞的增殖而不会经历基本的分化。往往使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。作为另一种选择，可用化学限定的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。

多能细胞在培养物中可使用多种饲养层或通过使用基质蛋白质涂布的容器容易地扩增。作为另一种选择，与限定的培养基诸如以商标出售的培养基(StemCell Technologies,Vancouver,Canada)组合的化学限定的表面可用于细胞的常规扩增。多能细胞可使用酶促消化、机械分离或使用多种钙螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)容易地从培养皿中取出。作为另一种选择，多能细胞可在不存在任何基质蛋白质或饲养层的情况下悬浮扩增。

在受权利要求保护的本发明中可以使用多种不同的扩增和培养多能干细胞的方法。例如，本发明的方法可使用Reubinoff等人、Thompson等人、Richard等人和美国专利申请公布2002/0072117的正式申请。Reubinoff等人(Nature Biotechnology 18:399-404(2000))和Thompson等人(Science282:1145-1147(1998))公开了用小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层来培养来自人胚泡的多能干细胞系。Richards等人(Stem Cells 21:546-556,2003)评估了一组十一种不同的成人、胎儿和新生儿饲养细胞层在支持人多能干细胞培养方面的能力，注意到在成人皮肤成纤维饲养细胞上培养的人胚胎干细胞系保持人胚胎干细胞形态并且保留多能性。美国专利申请公布2002/0072117公开了产生支持灵长类多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长的培养基的细胞系。所采用的细胞系是从胚胎组织获得或从胚胎干细胞分化而来的间质细胞系和成纤维细胞样细胞系。美国专利申请公布2002/072117还公开了所述细胞系作为原代饲养细胞层的用途。

扩增和培养多能干细胞的其他合适方法公开于例如Wang等人、Stojkovic等人、Miyamoo等人和Amit等人的文献中。Wang等人(Stem Cells23:1221-1227,2005)公开了用于在衍生自人胚胎干细胞的饲养细胞层上长期生长的人多能干细胞的方法。Stojkovic等人(Stem Cells 200523:306-314,2005)公开了一种衍生自人胚胎干细胞自发分化的饲养细胞系统。Miyamoto等人(Stem Cells 22:433-440,2004)公开了从人胎盘获得的饲养细胞源。Amit等人(Biol.Reprod 68:2150-2156,2003)公开了衍生自人包皮的饲养细胞层。

扩增和培养多能干细胞的其他合适方法公开于例如Inzunza等人的文献、美国专利6,642,048、WO 2005/014799、Xu等人的文献和美国专利申请公布2007/0010011的正式申请。Inzunza等人(Stem Cells 23:544-549,2005)公开了来自人出生后包皮成纤维细胞的饲养细胞层。美国专利6,642,048公开了可支持灵长类多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长的培养基以及可用于产生此类培养基的细胞系。美国专利6,642,048报道从胚胎组织获得或从胚胎干细胞分化成的间质细胞系和成纤维样细胞系，以及获得此类细胞系、处理培养基以及使用此类培养基培育干细胞的方法。WO2005/014799公开了一种用于哺乳动物细胞的维持、增殖和分化的条件培养基。WO 2005/014799报道，通过鼠细胞(那些分化并永生化的转基因肝细胞，称为MMH(Met鼠肝细胞))的细胞分泌活性对根据本发明制备的培养基进行调理。Xu等人(Stem Cells 22:972-980,2004)公开了一种从人胚胎干细胞衍生物获得的条件培养基，所述人胚胎干细胞衍生物已被基因修饰而过表达人端粒酶逆转录酶。美国专利申请公布2007/0010011公开了一种用于维持多能干细胞的化学限定的培养基。

一种替代的培养系统采用补充有能促进胚胎干细胞增殖的生长因子的无血清培养基。此类培养系统的例子包括但不限于Cheon等人、Levenstein等人的文献和美国专利申请公布2005/0148070。Cheon等人(BioReprodDOI:10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公开了一种无饲养细胞的无血清培养系统，其中胚胎干细胞维持在补充有能引发胚胎干细胞自我更新的不同生长因子的未经调理的血清替代(SR)培养基中。Levenstein等人(Stem Cells 24:568-574,2006)公开了使用补充有bFGF的培养基，在不存在成纤维细胞或条件培养基的情况下长期培养人胚胎干细胞的方法。美国专利申请公布2005/0148070公开了一种在无血清且无成纤维细胞饲养细胞的限定的培养基中培养人胚胎干细胞的方法，该方法包括：在含有白蛋白、氨基酸、维生素、矿物质、至少一种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、至少一种胰岛素或胰岛素替代品的培养基中培养干细胞，该培养基基本上无哺乳动物胎血清且含有至少约100ng/ml的能够对成纤维细胞生长因子信号转导受体进行活化的成纤维细胞生长因子，其中该生长因子的供给来源不是仅为成纤维细胞饲养层，该培养基支持干细胞在无饲养细胞或条件培养基的情况下以未分化状态增殖。

培养和扩增多能干细胞的其他合适的方法公开于美国专利申请公布2005/0233446、美国专利6,800,480、美国专利申请公布2005/0244962和WO 2005/065354中。美国专利申请公布2005/0233446公开了一种可用于培养干细胞的限定的培养基，所述干细胞包括未分化的灵长类原始干细胞。在溶液中，此培养基与培养中的干细胞相比基本上是等渗的。在给定的培养物中，特定的培养基包含基础培养基和各为一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸，所述一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸为支持原始干细胞进行基本上非分化性生长所必需的。美国专利6,800,480报道，提供了用于使灵长类来源的原始干细胞以基本上未分化状态生长的细胞培养基，其包括低渗透压、低内毒素基础培养基，此培养基对于支持灵长类来源的原始干细胞的生长是有效的。美国专利6,800,480的公开内容还报道，该基础培养基混合了有效支持灵长类来源的原始干细胞生长的营养血清以及选自饲养细胞和衍生自饲养细胞的胞外基质组分的基质。还应注意该培养基包括非必需氨基酸、抗氧化剂和选自核苷和丙酮酸盐的第一生长因子。美国专利申请公布2005/0244962报道，本公开的一个方面提供一种培养灵长类胚胎干细胞的方法，并且该培养物中的干细胞基本上不含哺乳动物胎儿血清(优选地也基本上不含任何动物血清)并且处于存在从除成纤维细胞饲养细胞层以外的来源供应的成纤维细胞生长因子的情况下。

WO 2005/065354公开了一种限定的等渗培养基，该培养基基本上不含饲养细胞且不含血清，包含：基础培养基、bFGF、胰岛素和抗坏血酸，所述基础培养基、bFGF、胰岛素和抗坏血酸的量足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长。此外，WO 2005/086845公开了一种维持未分化的干细胞的方法，所述方法包括使干细胞暴露于转化生长因子-β(TGF-β)蛋白家族的成员、成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族的成员或烟酰胺(NIC)，所述成员或烟酰胺的量足以维持所述细胞处于未分化状态达足以实现所需结果的一段时间。

可将多能干细胞接种至合适的培养基质上。在一个实施例中，合适的培养基质是细胞外基质组分，例如衍生自基底膜的组分，或可形成粘着分子受体-配体偶联物的一部分的组分。一种合适的培养基质是以商标MATRIGEL^TM(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)出售的重构基底膜。MATRIGEL^TM是来自Engelbreth-Holm Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂，其在室温下胶凝而形成重构的基底膜。

在本领域中已知的其他细胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物。取决于所扩增的细胞类型，这可包括层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等，单独的或呈各种组合。

可在存在可促进细胞存活、增殖和保持理想特性的培养基存在的情况下，以合适的分布将多能干细胞接种于所述基质上。所有这些特性可得益于对接种分布的认真考虑并可易于由本领域技术人员确定。合适的培养基可用以下组分制备：Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，由LifeTechnologies Corporation,Grand Island,NY以商标GIBCO^TM(货号11965-092)出售；敲除的Dulbecco改良的Eagle培养基(KO DMEM)，由LifeTechnologies Corporation,Grand Island,NY以商标GIBCO^TM(货号10829-018)出售；Ham的F12/50％DMEM基础培养基；200mM的L-谷氨酰胺，由Life Technologies Corporation,Grand Island,NY以商标GIBCO^TM(货号15039-027)出售；非必需氨基酸溶液，由Life Technologies Corporation,Grand Island,NY以商标GIBCO^TM(货号11140-050)出售；β-巯基乙醇，Sigma-Aldrich Company,LLC Saint Louis,MO，(货号M7522)；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，由Life Technologies Corporation,GrandIsland,NY以商标GIBCO^TM(货号13256-029)出售。

多能干细胞的分化

当多能细胞向β细胞分化时，所述细胞通过多个阶段分化，每一阶段可通过特定标志物的存在或不存在来表征。细胞分化至这些阶段是通过特定培养条件实现的，所述培养条件包括存在和缺乏添加至培养基中的某些因子。一般来讲，这种分化可涉及多能干细胞分化成定形内胚层细胞。这些定形内胚层细胞可随后进一步分化成肠管细胞，所述肠管细胞可继而分化成前肠内胚层细胞。前肠内胚层细胞可分化成胰腺前肠前体细胞，该胰腺前肠前体细胞可继而进一步分化成胰腺内胚层细胞、胰腺内分泌前体细胞，或胰腺内胚层细胞和胰腺内分泌前体细胞两者。这些细胞可随后分化成产生胰腺激素的细胞(诸如β细胞)。本发明通过以下步骤提供多能干细胞向胰腺内分泌细胞的分阶段分化：在部分填充有培养基的培养容器中存在的空气-液体界面处培养细胞，具体地在空气-液体界面处培养第4阶段至第6阶段的细胞。

多能干细胞向表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞的分化

多能干细胞的特征是本领域技术人员熟知的，并且多能干细胞的其他特征有待继续识别。多能干细胞标志物包括例如一种或多种下列标志物的表达：ABCG2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81。

示例性的多能干细胞包括人胚胎干细胞系H9(NIH代码：WA09)、人胚胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)、人胚胎干细胞系H7(NIH代码：WA07)，以及人胚胎干细胞系SA002(Cellartis,Sweden)。表达下述多能细胞特征性标志物中的至少一种的细胞也是合适的：ABCG2、cripto、CD9、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81。

还适用于本发明的是表达定形内胚层谱系的特征性标志物中的至少一种的细胞。在本发明的一个实施例中，表达定形内胚层谱系的特征性标志物的细胞为原条前体细胞。在一个替代实施例中，表达定形内胚层谱系的特征性标志物的细胞是中内胚层细胞。在一个替代实施例中，表达定形内胚层谱系的特征性标志物的细胞是定形内胚层细胞。

还适用于本发明的是表达胰腺内胚层谱系的特征性标志物中的至少一种的细胞。在本发明的一个实施例中，表达胰腺内胚层谱系的特征性标志物的细胞是胰腺内胚层细胞，其中PDX1和NKX6.1的表达基本上高于CDX2和SOX2的表达。在某些实施例中，大于百分之三十的细胞表达PDX1和NKX6.1，并且小于百分之三十的细胞表达CDX2或SOX2，如用FACS所测量的。特别有用的是其中PDX1和NKX6.1的表达比CDX2或SOX2的表达至少高两倍的细胞。

还适用于本发明的是表达胰腺内分泌谱系的特征性标志物中的至少一种的细胞。在本发明的一个实施例中，表达胰腺内分泌谱系的特征性标志物的细胞为胰腺内分泌细胞。在一个实施例中，胰腺内分泌细胞能够表达以下激素中的至少一种：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素或胰多肽。在一个优选的实施例中，所述胰腺内分泌细胞是产生胰岛素的β细胞。

在本发明的某些实施例中，为了得到表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞，利用从多能干细胞或诱导多能细胞开始的方案，优选地从多能干细胞开始的方案。该方案包括以下阶段：

第1阶段：将从细胞培养系获得的多能干细胞，诸如胚胎干细胞，用合适的因子处理以诱导分化成表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞。

第2阶段：将从第1阶段获得的细胞用合适的因子处理以进一步诱导分化成表达肠管细胞的特征性标志物的细胞。

第3阶段：将从第2阶段获得的细胞用合适的因子处理以进一步诱导分化成表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞。

第4阶段：将从第3阶段获得的细胞用合适的因子处理以进一步诱导分化成表达胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞。将所述细胞任选地在第4阶段后期时在空气-液体界面处培养。

第5阶段：将从第4阶段获得的细胞用合适的因子处理并且在空气-液体界面处培养以进一步诱导分化成表达胰腺内胚层/内分泌前体细胞的特征性标志物的细胞。

第6阶段：将从第5阶段获得的细胞用合适的因子处理并且在空气-液体界面处培养以进一步诱导分化成表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞。

虽然在某些实施例中本发明涵盖使多能干细胞(例如，第1阶段之前的细胞)分化成第6阶段细胞，但是本发明也涵盖使其他中间阶段的细胞向第6阶段分化。具体地，本发明涵盖第4阶段细胞至第6阶段细胞的分化。此外，虽然该过程被描述为离散的阶段，但是处理以及细胞经历分化过程的进程可为顺序的或连续的。

第1阶段：使多能干细胞分化成表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞

可通过本领域已知的任何方法或通过本文提出的任何方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞。可用于使多能干细胞分化成表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞的方法公开于：美国专利申请公布2007/0254359；美国专利申请公布2009/0170198；美国专利申请公布2009/0170198；美国专利申请公布2011/0091971；美国专利申请公布2010/0015711；美国专利申请公布2010/0015711；美国专利申请公布2012/0190111；美国专利申请公布2012/0190112；美国专利申请公布2012/0196365；美国专利申请公布20100015711；美国专利申请公布2012/0190111；美国专利申请公布2012/0190112；美国专利申请公布2012/0196365；美国专利申请公布20100015711；美国专利申请公布2012/0190111；美国专利申请公布2012/0190112；美国专利申请公布2012/0196365；美国临时专利申请61/076,900；美国临时专利申请61/076,908；以及美国临时专利申请61/076,915，所述专利申请全文以引用方式并入，因为它们涉及多能干细胞并且涉及使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系的特征性标志物的细胞。

在本发明的一个实施例中，用补充有活化素A和WNT3A的培养基处理多能干细胞，以导致生成表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞。处理可涉及使多能干细胞与包含约50ng/ml至约150ng/ml、或约75ng/ml至约125ng/ml、或约100ng/ml的活化素A的培养基接触。所述处理还可涉及使所述细胞与约10ng/ml至约50ng/ml、或约15ng/ml至约30ng/ml、或约20ng/ml的WNT3A接触。可培养所述多能细胞约两至五天，优选地约三天，以促进所述多能细胞分化成表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞。在一个实施例中，在活化素A和WNT3A的存在下培养细胞一天，接着在活化素A(不存在WNT3A)的存在下培养细胞剩余的时间。

在本发明的另一个实施例中，用补充有生长分化因子8(“GDF8”)和糖原合成酶激酶-3β(“GSK3β”)抑制剂(诸如在美国专利申请公布2010/0015711中公开的环苯胺-吡啶三嗪化合物；该专利全文以引用方式并入本文)的培养基处理多能干细胞，以诱导分化成表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞。优选的GSK3β抑制剂是14-丙-2-烯-1-基-3,5,7,14,17,23,27-七氮杂四环[19.3.1.1～2,6～.1～8,12～]二十七-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-壬-16-酮，在本文中被称作(“MCX化合物”)。处理可涉及使多能干细胞与补充有约50ng/ml至约150ng/ml、或约75ng/ml至约125ng/ml、或约100ng/ml的GDF8的培养基接触。所述处理还可涉及使所述细胞与约0.1μM至5μM、或约0.5μM至约2.5μM，优选地约1μM的MCX化合物接触。可培养所述多能细胞约两至五天，优选地约两至三天，以促进所述多能细胞分化成表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞。

在一个实施例中，在GDF8和MCX化合物的存在下培养细胞一天，接着在GDF8和较低浓度的MCX化合物的存在下培养细胞一天，接着在存在GDF8并且缺乏MCX化合物的情况下培养细胞一天。具体地，在GDF8和约1μM的MCX化合物的存在下培养细胞一天，接着在GDF8和约0.1μM的MCX化合物的存在下培养细胞一天，接着在存在GDF8并且缺乏MCX化合物的情况下培养细胞一天。在一个替代实施例中，在GDF8和约1μM的MCX化合物的存在下培养细胞一天，接着在GDF8和约0.1μM的MCX化合物的存在下培养细胞一天。

表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞的生成可通过在进行特定方案之前或之后检测该标志物的存在来确定。多能干细胞通常不表达这类标志物。因此，当细胞开始表达定形内胚层细胞的特征性标志物时，可检测到多能细胞的分化。用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern印迹、原位杂交(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑，2001增刊)，以及免疫测定(诸如切片材料的免疫组织化学分析)、Western印迹和在完整细胞中可接近的标志物的流式细胞术分析(FACS)(参见，例如，Harlow和Lane，Using Antibodies:A Laboratory Manual,New York:Cold Spring HarborLaboratory Press(1998))。

另外，可通过将处理过的细胞群暴露于可特异性识别由感兴趣的分化细胞表达的蛋白质标志物的试剂(诸如抗体)来确定分化效率。

还可将分化的细胞进一步纯化。例如，在用本发明方法处理多能干细胞后，可通过使处理过的细胞群暴露于特异性识别由经纯化的分化细胞特征性表达的蛋白质标志物的试剂(诸如抗体)来纯化分化的细胞。

第2阶段：使表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞分化成表达肠管细胞的特征性标志物的细胞

表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞可进一步分化成表达肠管细胞的特征性标志物的细胞。在一个实施例中，表达肠管细胞的特征性标志物的细胞的形成包括：用包含成纤维细胞生长因子(“FGF”)7或FGF10的培养基来培养表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞，从而分化这些细胞。例如，该培养基可包含从约25ng/ml至约75ng/ml、或从约30ng/ml至约60ng/ml、或约50ng/ml的FGF7或FGF10，优选地是FGF7。可在这些条件下培养细胞约两至三天，优选地约两天。

在另一个实施例中，分化成表达肠管细胞的特征性标志物的细胞包括：用FGF7或FGF10和抗坏血酸(维生素C)培养表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞。该培养基可包括从约0.1mM至约0.5mM的抗坏血酸，或从约0.2mM至约0.4mM，或约0.25mM的抗坏血酸。该培养基还可包括从约10ng/ml至约35ng/ml，或从约15ng/ml至约30ng/ml，或约25ng/ml的FGF7或FGF10，优选地FGF7。例如，该培养基可包括约0.25mM的抗坏血酸和约25ng/ml的FGF7。在一个实施例中，用FGF7和抗坏血酸处理第1阶段细胞2天。

第3阶段：使表达肠管细胞的特征性标志物的细胞分化成表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞

表达肠管细胞的特征性标志物的细胞可进一步分化成表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞。在一个实施例中，第2阶段细胞通过以下方式而进一步分化成第3阶段细胞：在补充有Smoothened(“SMO”)受体抑制剂(诸如“MRT10”(N-[[[3-苯甲酰基氨基)苯基]氨基]硫代甲酰]-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺))或环杷明)或Sonic Hedgehog(“SHH”)信号转导途径拮抗剂(诸如Smoothened拮抗剂1(“SANT-1”)((E)-4-苯甲基-N-((3,5-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)亚甲基-哌嗪-1-胺))，或Hedgehog途径抑制剂1(“HPI-1”)(2-甲氧基乙基1,4,5,6,7,8-六氢化-4-(3-羟基苯基)-7-(2-甲氧基苯基)-2-甲基-5-氧代-3-喹啉羧酸酯))、视黄酸、以及头蛋白的培养基中培养这些细胞。作为另一种选择，第2阶段细胞可通过以下步骤分化成第3阶段细胞：在补充有SMO受体抑制剂、SHH信号转导途径拮抗剂、视黄酸、以及头蛋白的培养基中培养这些细胞。可培养细胞约两至四天，优选地约两天。在一个实施例中，该培养基补充有从约0.1μM至约0.3μM的SANT-1、从约0.5μM至约3μM的视黄酸、以及从约75ng/ml至约125ng/ml的头蛋白。在另一个实施例中，该培养基补充有约0.25μM的SANT-1、约2μM的视黄酸和约100ng/ml的头蛋白。

在一个替代实施例中，第2阶段细胞通过以下方式进一步分化成第3阶段细胞：用补充有FGF7或FGF10、视黄酸、SMO受体抑制剂(诸如MRT10或环杷明)或SHH信号转导途径拮抗剂(诸如SANT-1或HPI-1)、蛋白激酶C(“PKC”)活化剂(诸如((2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-戊二烯酰氨基)苯并内酰胺(“TPB”))，EMD Chemicals,Inc.,Gibbstown,NJ)、12,13-二丁酸佛波醇(“PDBu”)、佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(“PMA”)或吲哚内酰胺V(“ILV”))、骨形态发生蛋白(“BMP”)抑制剂(诸如LDN-193189、头蛋白或脊索发生素)、以及抗坏血酸的培养基处理第2阶段细胞。在另一个实施例中，该培养基可补充有FGF7或FGF10、视黄酸、SMO受体抑制剂、SHH信号转导途径拮抗剂(诸如SANT-1)、PKC活化剂(诸如TPB)、BMP抑制剂(诸如LDN-193189)、以及抗坏血酸。可在存在这些生长因子、小分子激动剂和拮抗剂的情况下培养细胞约两至四天，优选地约两至三天。

在另一个实施例中，该培养基补充有从约15ng/ml至约35ng/ml的FGF7、从约0.5μM至约2μM的视黄酸、从约0.1μM至约0.4μM的SANT-1、从约100至约300nM的TPB、从约50nM至约200nM的LDN-193189、以及从约0.15mM至约0.35mM的抗坏血酸。在另一个实施例中，该培养基补充有约25ng/ml的FGF7、约1μM的视黄酸、约0.25μM的SANT-1、约200nM的TPB、约100nM的LDN-193189、以及约0.25mM的抗坏血酸。

通过在空气-液体界面处培养产生第4阶段细胞至第6阶段细胞

虽然本发明设想在从多能细胞至胰腺内分泌细胞的途径中的所有阶段中在空气-液体界面处培养，但是本发明优选地提供在浸没的培养物中形成第1阶段至第3阶段细胞，以及通过在空气-液体界面处培养细胞形成第4阶段至第6阶段细胞。因此在某些实施例中，本发明提供使多能细胞逐步分化的方法，所述方法包括在第4阶段至第6阶段期间在空气-液体界面处培养。在某些实施例中，可在整个第4阶段至第6阶段期间在空气-液体界面处培养细胞。在其他实施例中，仅第4阶段后期至第6阶段，或仅第5阶段和第6阶段，或仅第4阶段和第5阶段，或仅第4阶段和第6阶段包括在空气-液体界面处培养。

当在空气-液体界面(空气-液体界面)处培养细胞时，可在多孔基质上培养细胞，使得所述细胞的顶侧与空气接触，并且底侧与细胞培养基接触。例如，可将足够体积的培养基添加至包含所述多孔基质(例如，滤器芯子(filter insert))的培养容器的底部，使得培养基接触存在于基质上的细胞的底表面但是不包封或浸没它们。合适的多孔基质可由将不会对细胞的生长和分化产生不利影响的任意材料形成。示例性多孔基质是由聚合物制成的，诸如聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚酯或聚碳酸酯。合适的多孔基质可经涂覆或未经涂覆。在一个实施例中，多孔基质可涂覆有MATRIGEL^TM。在本发明的一个实施例中，多孔基质是可涂覆有MATRIGEL^TM的多孔滤器芯子。然而优选地，多孔基质是未经涂覆的滤器芯子。基质的孔隙率应当足以维持细胞活力并且促进细胞的分化。合适的基质包括具有以下孔尺寸：从约0.3至约3.0μm、约0.3至约2.0μm、约0.3至约1.0μm、约0.3至约0.8μm、约0.3至约0.6μm、约0.3至约0.5μm、约0.5至约3.0μm、约0.6至约3.0μm、约0.8至约3.0μm、约1.0至约3.0μm、约2.0μm至约3.0μm，优选地约0.4μm；以及以下孔密度：从约50至约120百万个孔/cm²、约60至约110百万个孔/cm²、约70至约100百万个孔/cm²，优选地约80至约100百万个孔/cm²、约90至约100百万个孔/cm²，更优选地约100百万个孔/cm²的滤器芯子。

该培养基可有利地每天或每隔一天替换或更换。在多孔基质顶部上生长的细胞一般不是单个细胞，相反它们是以片形式或以细胞团簇形式存在的。相较于浸没在培养基中的细胞，在空气-液体界面处培养的细胞可经历更高的氧张力。

本发明因而涵盖在空气-液体界面处产生第4阶段至第6阶段细胞，优选地第5阶段和第6阶段细胞。可完全在空气-液体界面处完全在平面的培养物中培养第4阶段细胞，或可在第4阶段的早期部分期间在浸没的平面培养物中培养细胞并且随后在第4阶段的后期部分期间在空气-液体界面处培养细胞。这些细胞可通过使多能干细胞分化产生，或通过进一步分化来源于其他装置的第3阶段、第4阶段或第5阶段细胞而产生。

在一个实施例中，本发明提供了一种用于从多能干细胞产生表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞，优选地是β细胞的方法，所述方法包括培养多能干细胞，使所述多能干细胞分化成表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞；以及通过在空气-液体界面处培养来使表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌/β细胞的特征性标志物的细胞。

在另一个实施例中，本发明提供了一种用于从多能干细胞产生表达胰腺内分泌细胞(优选地是β细胞)的特征性标志物的细胞的方法，所述方法包括培养多能干细胞，使所述多能干细胞分化成表达胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞；以及通过在空气-液体界面处培养来使表达胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞。

该方法可包括用补充有三碘甲状腺原氨酸(T3)、四碘甲状腺原氨酸(T4)、T3或T4的类似物、或它们的混合物(在下文被统称为“T3/T4”)、或活化素受体样激酶(“ALK”)5抑制剂、或T3/T4和ALK5抑制剂两者的培养基进行处理。合适的甲状腺激素类似物可包括：得自R&D Systems,Inc.的GC-1(Sobertirome)，目录号4554；DITPA(3,5-二碘甲状腺丙酸)；KB-141，在J.Steroid Biochem.Mol.Biol.2008，111:262-267和Proc.Natl.Acad.Sci.US 2003,100:10067-10072中有所论述；MB07344，在Proc.Natl.Acad.Sci.US 2007,104:15490-15495中有所论述；T0681，在PLoS One,2010,5e8722和J.Lipid Res.2009，50:938-944中有所论述；以及GC-24，在PLoS One,2010e8722和Endocr.Pract.2012,18(6):954-964中有所论述，所述文献的公开内容全文并入本文。可用的ALK5抑制剂包括：ALK5抑制剂II(Enzo,Farmingdale,NY)；ALK5i(Axxora,San Diego,CA)；SD208(R&D systems(MN))；TGF-B抑制剂SB431542(Xcess Biosciences(San Diego,CA))；ITD-1(XcessBiosciences(San Diego,CA))；LY2109761(Xcess Biosciences(San Diego,CA))；A83-01(Xcess Biosciences(San Diego,CA))；LY2157299(XcessBiosciences(San Diego,CA))；TGF-β受体抑制剂V(EMD Chemicals,Gibstown,NJ))；TGF-β受体抑制剂I(EMD Chemicals,Gibstown,NJ))；TGF-β受体抑制剂IV(EMD Chemicals,Gibstown,NJ))；TGF-β受体抑制剂VII(EMD Chemicals,Gibstown,NJ))；TGF-β受体抑制剂VIII(EMDChemicals,Gibstown,NJ))；TGF-β受体抑制剂II(EMD Chemicals,Gibstown,NJ))；TGF-β受体抑制剂VI(EMD Chemicals,Gibstown,NJ))；TGF-β受体抑制剂III(EMD Chemicals,Gibstown,NJ))。该方法可包括通过用补充有T3/T4或ALK5抑制剂的培养基处理并且在平面培养物中培养，来使表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞。该方法还可包括通过用补充有T3/T4、或ALK5抑制剂、或T3/T4和ALK5抑制剂两者的培养基处理并且在空气-液体界面处培养，来使表达胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞分化成表达β细胞的特征性标志物的细胞。

在一个实施例中，该方法包括用补充有T3/T4和ALK5抑制剂的培养基处理。在其他实施例中，该方法包括用补充有T3/T4或ALK5抑制剂的培养基处理第3阶段细胞。该方法还可包括用补充有T3/T4和ALK5抑制剂的培养基处理表达胰腺内胚层/内分泌前体细胞的特征性标志物的细胞。

本发明的一个实施例是一种形成表达β细胞的特征性标志物的细胞的方法，所述方法包括通过在空气-液体界面处培养，来使表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞分化成表达β细胞的特征性标志物的细胞。表达β细胞的特征性标志物的细胞表达胰岛素以及至少一种下列转录因子：PDX1、NKX2.2、NKX6.1、NeuroD1、1SL1、HNF3β、MAFA、PAX4和PAX6。在一个实施例中，本发明的方法导致形成对于NKX6.1、PDX1和HB9呈阳性的细胞。因此，本发明提供了一种通过在足以诱导PDX1、NKX6.1和HB9在人类细胞中表达的条件下在空气-液体界面处培养胰腺内胚层细胞来诱导此类表达的方法。本发明还提供了一种通过在空气-液体界面处培养胰腺内胚层细胞来诱导PDX1、NKX6.1和NGN3在人类细胞中表达的方法。该方法可包括用补充有T3、ALK5抑制剂，或T3和ALK5抑制剂两者的培养基处理。因此，在一个实施例中，培养基可补充有T3，而在另一个实施例中，培养基可补充有ALK5抑制剂。在另一个实施例中，培养基可补充有T3和ALK5抑制剂两者。第6阶段细胞可为对NKX6.1、PDX1和HB9呈阳性的细胞。在其他实施例中，第6阶段细胞是单激素阳性细胞。例如，第6阶段细胞可为(a)共表达NKX6.1和嗜铬粒蛋白-A或(b)共表达NKX6.1和胰岛素的细胞。

在空气-液体界面处培养细胞包括将细胞接种到多孔基质诸如多孔滤器芯子上。在某些实施例中，基质的孔尺寸范围可为从约0.4至约3微米，或本文所提及的任意孔尺寸。接种可通过以下方式实现：将细胞作为单细胞或细胞簇从单层培养物释放到悬浮液中，随后将所述细胞悬浮液等分到定位于空气-液体界面处的多孔基质上。可从悬浮液中将所述细胞接种到多孔基质上，所述悬浮液包含约1000个细胞/μl至约100,000个细胞/μl、约1000个细胞/μl至约90,000个细胞/μl、约1000个细胞/μl至约80,000个细胞/μl、约1000个细胞/μl至约70,000个细胞/μl、约1000个细胞/μl至约60,000个细胞/μl、约1000个细胞/μl至约50,000个细胞/μl、约1000个细胞/μl至约40,000个细胞/μl、约1000个细胞/μl至约30,000个细胞/μl、约1000个细胞/μl至约20,000个细胞/μl、约1000个细胞/μl至约10,000个细胞/μl、约1000个细胞/μl至约5000个细胞/μl、约5000个细胞/μl至约100,000个细胞/μl、约10,000个细胞/μl至约100,000个细胞/μl、约20,000个细胞/μl至约100,000个细胞/μl、约30,000个细胞/μl至约100,000个细胞/μl、约40,000个细胞/μl至约100,000个细胞/μl、约50,000个细胞/μl至约100,000个细胞/μl、约60,000个细胞/μl至约100,000个细胞/μl、约20,000个细胞/μl至约80,000个细胞/μl、约30,000个细胞/μl至约70,000个细胞/μl、约40,000个细胞/μl至约60,000个细胞/μl，优选地约50,000个细胞/μl。所述细胞可作为包含个别细胞或细胞团的细胞悬浮液的液滴而接种。所得的细胞沉积物可包含从约5×10⁶至约5×10⁷个细胞/cm²、约6×10⁶至约5×10⁷个细胞/cm²、约7×10⁶至约5×10⁷个细胞/cm²、约8×10⁶至约5×10⁷个细胞/cm²、约9×10⁶至约5×10⁷个细胞/cm²、约1×10⁷至约5×10⁷个细胞/cm²、约2×10⁷至约5×10⁷个细胞/cm²、约2×10⁷至约5×10⁷个细胞/cm²、约3×10⁷至约5×10⁷个细胞/cm²、约3×10⁷至约5×10⁷个细胞/cm²、约4×10⁷至约5×10⁷个细胞/cm²、约5×10⁶至约4×10⁷个细胞/cm²、约5×10⁶至约3×10⁷个细胞/cm²、约5×10⁶至约2×10⁷个细胞/cm²、约5×10⁶至约1×10⁷个细胞/cm²、约5×10⁶至约9×10⁶个细胞/cm²、约5×10⁶至约8×10⁶个细胞/cm²、约5×10⁶至约7×10⁶个细胞/cm²、约5×10⁶至约6×10⁶个细胞/cm²、约7×10⁶至约4×10⁷个细胞/cm²、约8×10⁶至约3×10⁷个细胞/cm²、约9×10⁶至约2×10⁷个细胞/cm²，优选地大约或约1×10⁷个细胞/cm²。

在一个实施例中，本发明涉及一种通过在多孔基质上的空气-液体界面处培养并且使PDX1和NKX6.1共阳性的胰腺内胚层前体细胞群分化成PDX1和NKX6.1共阳性的胰腺内分泌细胞来提升HB9蛋白的表达的方法。作为另一种选择，可以通过在空气-液体界面处培养并且使主要由PDX1阳性细胞构成的前肠内胚层细胞群分化来诱导HB9蛋白表达。在一些实施例中，胰腺内胚层细胞群是通过使多能细胞至少部分地在空气-液体界面处逐步分化而获得的。

在另一个实施例中，本发明提供一种通过在空气-液体界面处培养和分化PDX1和NKX6.1共表达细胞群来增加单激素阳性细胞(例如，共表达NKX6.1和胰岛素的细胞，或产生NKX6.1和嗜铬粒蛋白-A的细胞)的数目的方法。在另一个实施例中，通过用选自以下的化合物处理，将在空气-液体界面处培养的胰腺内胚层细胞进一步分化成胰腺内分泌细胞：ALK5抑制剂、BMP抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、Ephrin配体、EphB抑制剂、PKC抑制剂、EGFr抑制剂、视黄酸、维生素C、T3/T4、葡萄糖、细胞周期调节因子、WNT调节因子、SHH抑制剂、或它们的组合。

在一些实施例中，在空气-液体界面处培养的胰腺内胚层细胞进一步分化成胰腺内分泌前体细胞和表达胰腺激素的细胞。在一个替代实施例中，本发明涵盖用本发明的方法制备的表达胰岛素但不表达NKX6.1的细胞。在一些实施例中，将在空气-液体界面处生成的胰腺内胚层群体移植到糖尿病动物体内，以在体内进一步成熟为功能性胰腺内分泌细胞。

第4阶段：使表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞

在一个实施例中，本发明的方法包括用包含补充有以下一种或多种物质的生长培养基的分化培养基处理第3阶段细胞：(a)ALK5抑制剂，选自：TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI、TGF-β受体抑制剂III、TGF-B抑制剂SB431542、SD208、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、ALK5i和ALK5抑制剂II；(b)甲状腺激素，选自：T3、T4、T3的类似物、T4的类似物、以及它们的混合物；(c)smoothened受体抑制剂，选自MRT10或环杷明；(d)SHH信号转导途径拮抗剂，选自SANT-1或HPI-1；(e)BMP受体抑制剂，选自LDN-193189、头蛋白或脊索发生素；(f)PKC活化剂，选自TPB、PDBu、PMA和ILV；(g)成纤维细胞生长因子，选自FGF7或FGF10；(h)视黄酸；(i)抗坏血酸；(j)肝素；以及(k)硫酸锌。例如，生长培养基，诸如MCDB131或BLAR，可补充有SMO抑制剂(诸如MRT10或环杷明)或SHH信号转导途径拮抗剂(诸如SANT-1或HPI-1)、BMP抑制剂(诸如LDN-193189、头蛋白或脊索发生素)、抗坏血酸，以及PKC活化剂(诸如TPB、PDBu、PMA或ILV)，以提供可用的分化培养基。在此类培养基中培养第3阶段细胞约两至四天，优选地约三天，往往足以使第3阶段细胞分化成第4阶段细胞。在另一个实施例中，培养基可补充有SMO抑制剂和SHH信号转导途径拮抗剂。在一个优选的实施例中，可用补充有约0.25μM的SANT-1；约100nM的视黄酸；约2ng/ml的FGF7；约100nM的LDN-193189；约0.25mM的抗坏血酸；以及约100nM的TPB的培养基处理第3阶段细胞三天。在另一个实施例中，培养基还补充有T3，诸如从约5nM至约25nM、或约10nM的T3。

在第4阶段中，可在平面培养物上或在空气-液体界面处培养细胞。具体地，本发明提供了一种用于使衍生自多能干细胞的细胞在空气-液体界面处分化的体外细胞培养物，所述体外细胞培养物包括：(a)培养容器；(b)在所述容器内一定体积的生长培养基，所述体积足以填充所述容器的体积的仅一部分；(c)所述容器内的空气，所述空气填充所述容器邻接所述培养基的部分；(d)多孔基质，所述多孔基质定位在所述培养基和所述空气之间的界面处；以及(e)衍生自多能干细胞的细胞，所述细胞设置在所述基质的表面上，使得所述培养基接触所述细胞表面的仅一部分。作为另一种选择，通过用如上所述经补充的培养基在平面培养物中处理，表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞可分化成表达胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞。

在另一个实施例中，在第4阶段结束时可用Rho相关激酶(“ROCK”)抑制剂处理细胞，所述抑制剂诸如Y27632((1R,4r)-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)环己甲酰胺)、GSK269962(N-[3-[[2-(4-氨基-1,2,5-二唑-3？-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧]苯基]-4-[2-(4-吗啉基)乙氧基]苯甲酰胺)、H1152((S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰]高哌嗪二盐酸盐)和SR3677(N-[2-[2-(二甲氨基)乙氧基]-4-(1H-吡唑-4-基)苯基-2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂苯-2-甲酰胺二盐酸盐)。在某些实施例中可使用约10μM的ROCK抑制剂。

在某些实施例中，仅在第4阶段的后期在空气-液体界面处培养细胞。在一个实施例中，仅在第4阶段的后期在空气-液体界面处培养用ROCK抑制剂处理过的细胞。在某些实施例中，在空气-液体界面处培养之前，可用细胞脱附溶液处理细胞，所述细胞脱附溶液为诸如包含蛋白水解酶和胶原蛋白酶的溶液。

在一个替代实施例中，可用包含补充有ALK5抑制剂、头蛋白和PKC活化剂(诸如TPB)的生长培养基的分化培养基处理第3阶段细胞。在某些实施例中，培养基可补充有约0.1μM的ALK5抑制剂、约100ng/ml的头蛋白、以及约500nM的TPB。细胞培养物可为单层形式。处理可持续总共约三天。在某些实施例中，可处理所述细胞两天，随后在最后一天可用蛋白水解酶、胶原蛋白酶，或蛋白水解酶和胶原蛋白酶两者，诸如分散酶处理细胞，使细胞分散成直径小于约100微米的细胞簇，接着在ALK5抑制剂和LDN-193189的存在下培养。在某些实施例中，可在补充有约200nM的ALK5抑制剂和约100nM的LDN-193189的培养基中培养直径小于约100微米的细胞簇。

第5阶段：使表达胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层/内分泌前体细胞的特征性标志物的细胞

在一个实施例中，本发明的方法包括用包含补充有以下一种或多种物质的生长培养基的分化培养基处理第4阶段细胞：(a)ALK5抑制剂，选自：TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI、TGF-β受体抑制剂III、TGF-B抑制剂SB431542、SD208、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、ALK5i和ALK5抑制剂II；(b)甲状腺激素，选自：T3、T4、T3的类似物、T4的类似物、以及它们的混合物；(c)smoothened受体抑制剂，选自MRT10或环杷明；(d)SHH信号转导途径拮抗剂，选自SANT-1或HPI-1；(e)BMP受体抑制剂，选自LDN-193189、头蛋白或脊索发生素；(f)PKC活化剂，选自TPB、PDBu、PMA和ILV；(g)成纤维细胞生长因子，选自FGF7或FGF10；(h)视黄酸；(i)抗坏血酸；(j)肝素；以及(k)硫酸锌；以及在空气-液体界面处培养细胞约两至四天，优选地约三天，以使所述细胞分化成第5阶段细胞。在另一个实施例中，生长培养基补充有SMO抑制剂(诸如MRT10或环杷明)或SHH信号转导途径拮抗剂(诸如SANT-1或HPI-1)、视黄酸、T3、抗坏血酸、BMP受体抑制剂(诸如LDN-193189、头蛋白或脊索发生素)、以及ALK5抑制剂。在另一个实施例中，本发明的方法包括：用补充有SMO抑制剂、SHH信号转导途径拮抗剂、视黄酸、T3、抗坏血酸、BMP受体抑制剂和ALK5抑制剂的培养基处理第4阶段细胞，以及在空气-液体界面处培养细胞约两至四天，优选地约三天，以使所述细胞分化成第5阶段细胞。在一个实施例中，通过用补充有约0.25μM的SANT-1、约50nM的视黄酸、约0.25mM的抗坏血酸、约50nM的LDN-193189、约10nM的T3和约1000nM的ALK5抑制剂的培养基处理第4阶段细胞，来使第4阶段细胞分化成第5阶段细胞。在某些实施例中，ALK5抑制剂是SD208((2-(5-氯-2-氟苯基)-N-4-吡啶基-4-蝶啶胺)。在一个实施例中，培养基补充有约1000nM的SD208。

在另一个实施例中，本发明的方法包括：用补充有肝素、SMO抑制剂或SHH信号转导途径拮抗剂、视黄酸、BMP受体抑制剂和ALK5抑制剂的培养基处理第4阶段细胞，以及在空气-液体界面处培养细胞约两至四天，优选地约三天，以使所述细胞分化成第5阶段细胞。在一个替代实施例中，培养基可补充有SMO抑制剂和SHH信号转导途径拮抗剂两者，以及视黄酸、BMP受体抑制剂和ALK5抑制剂。

培养基还可补充有ZnSO₄。例如，可添加约10μM的ZnSO₄。因此，在一个实施例中，可通过用补充有肝素、ZnSO₄、SMO抑制剂或SHH信号转导途径拮抗剂、视黄酸、LDN-193189和ALK5抑制剂II的培养基处理第4阶段细胞，来使第4阶段细胞分化成第5阶段细胞。在一个替代实施例中，培养基可补充有SMO抑制剂和SHH信号转导途径拮抗剂两者。在一个实施例中，通过用补充有约10μg/ml的肝素、约0.25μM的SANT-1、约50nM的视黄酸、约50nM的LDN-193189、约10nM的T3和约1000nM的ALK5抑制剂的培养基处理第4阶段细胞，来使第4阶段细胞分化成第5阶段细胞。合适的ALK5抑制剂包括但不限于SD208、ALK5抑制剂II、TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI、TGF-β受体抑制剂III，以及它们的组合。

在一个实施例中，ALK5抑制剂是ALK5抑制剂II。在另一个实施例中，使用约1000nM的ALK5抑制剂II。在一个替代实施例中，用补充有约10μg/ml的肝素、约0.25μM的SANT-1、约50nM的视黄酸、约100nM的LDN-193189，以及约10000nM的ALK5抑制剂II的培养基处理第4阶段细胞。

在另一个另选实施例中，本发明的方法包括：用补充有SMO抑制剂或SHH信号转导途径拮抗剂、视黄酸以及ALK5抑制剂的培养基处理第4阶段细胞，以及在空气-液体界面处培养细胞约2天，以使所述细胞分化成第5阶段细胞。在一个替代实施例中，培养基可补充有SMO抑制剂和SHH信号转导途径拮抗剂两者。在一个实施例中，通过用补充有约0.25μM的SANT-1、约50nM的视黄酸、约50nM的LDN-193189，以及约1000nM的ALK5抑制剂(诸如SD208或ALK5抑制剂II)的培养基处理第4阶段细胞，来使第4阶段细胞分化成第5阶段细胞。在某些实施例中，培养基可为MCDB-131(Life Technologies Corporation,Grand Island,NY)。

用于在空气-液体界面处培养的接种细胞量可变化。例如，为了在空气-液体界面处培养所述细胞，可将包含从约2×10⁵个细胞/μl至约6×10⁵个细胞/μl、3×10⁵个细胞/μl至约6×10⁵个细胞/μl、4×10⁵个细胞/μl至约6×10⁵个细胞/μl、5×10⁵个细胞/μl至约6×10⁵个细胞/μl、2×10⁵个细胞/μl至约5×10⁵个细胞/μl、2×10⁵个细胞/μl至约4×10⁵个细胞/μl，或约3×10⁵个细胞/μl的细胞悬浮液的液滴接种到多孔基质上，诸如定位在空气-液体界面处的过滤器。在一些实施例中，将包含从约0.5×10⁵个细胞/μl至约0.75×10⁵个细胞/μl、约0.6×10⁵个细胞/μl至约0.75×10⁵个细胞/μl，或约0.5×10⁵个细胞/μl至约0.6×10⁵个细胞/μl的细胞悬浮液的液滴接种到多孔支承体上，以在空气-液体界面处培养。

在另一个实施例中，本发明的方法包括：用补充有BMP受体抑制剂(例如，LDN-193189、头蛋白或脊索发生素)和ALK5抑制剂的培养基处理第4阶段细胞约1天，以使第4阶段细胞分化成第5阶段细胞。例如，培养基可补充有约100nM的LDN-193189和约200nM的ALK5抑制剂。优选地，该实施例还包括用分散酶预处理所述细胞。所述细胞可为细胞簇形式。在某些实施例中，在空气-液体界面处培养之前，可用细胞脱附溶液处理细胞，所述细胞脱附溶液为诸如包含蛋白水解酶和胶原蛋白酶的溶液。在一个实施例中，利用根据本发明的实施例培养的第4阶段细胞并且使所述细胞分化成第5阶段细胞，而在其他实施例中可利用根据其他方案培养的第4阶段细胞。

根据前述方法，本发明还提供了一种用于使表达胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层/胰腺内分泌前体细胞的特征性标志物的细胞的细胞培养物，所述细胞培养物包括：(a)培养容器；(b)在所述容器内一定体积的生长培养基，所述体积足以填充所述容器的体积的仅一部分；(c)所述容器内的空气，所述空气填充所述容器邻接所述培养基的部分；(d)多孔基质，所述多孔基质定位在所述培养基和所述空气之间的界面处；以及(e)衍生自多能干细胞的表达胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞，所述细胞设置在所述基质的表面上，使得所述培养基接触所述细胞表面的仅一部分。

在某些实施例中，在第5阶段中在空气-液体界面处培养细胞可提升胰腺激素的表达。因此，本发明还提供通过在空气-液体界面处培养细胞来提升胰腺激素的表达的方法。在一些实施例中，第5阶段细胞可如本文所述并且如在下表VIII至XIII中所示出地处理。在某些实施例中，该方法还可减少PTF1a、SOX9、CDX2(肠标志物)、ZIC1(外胚层标志物和SOX2(前内胚层标志物)的表达。

在一个实施例中，该方法包括通过用补充有T3/T4，或ALK5抑制剂，或T3/T4和ALK5抑制剂两者的培养基处理并且在空气-液体界面处培养，来使表达胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞。

第6阶段：使表达胰腺内胚层/胰腺内分泌前体细胞的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞

在本发明的一个实施例中，该方法包括：用包含补充有以下一种或多种物质的生长培养基的分化培养基处理第5阶段细胞：(a)ALK5抑制剂，选自：TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI、TGF-β受体抑制剂III、TGF-B抑制剂SB431542、SD208、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、ALK5i和ALK5抑制剂II；(b)甲状腺激素，选自：T3、T4、T3的类似物、T4的类似物、以及它们的混合物；(c)smoothened受体抑制剂，选自MRT10或环杷明；(d)SHH信号转导途径拮抗剂，选自SANT-1或HPI-1；(e)BMP受体抑制剂，选自LDN-193189、头蛋白或脊索发生素；(f)PKC活化剂，选自TPB、PDBu、PMA和ILV；(g)成纤维细胞生长因子，选自FGF7或FGF10；(h)视黄酸；(i)抗坏血酸；(j)肝素；以及(k)硫酸锌；以及在空气-液体界面处培养第5阶段细胞约两至四天，优选地约三天，以使第5阶段细胞分化成第6阶段细胞。在一个实施例中，生长培养基补充有SMO抑制剂(诸如MRT10或环杷明)或SHH信号转导途径拮抗剂(诸如SANT-1或HPI-1)、视黄酸、抗坏血酸、T3/T4，以及ALK5抑制剂。在一个替代实施例中，培养基可补充有SMO抑制剂和SHH信号转导途径拮抗剂两者。可通过用补充有约0.25μM的SANT-1、约50nM的RA、约0.25mM的抗坏血酸、约500mM的ALK5抑制剂，以及约0.1nM的T3的培养基处理第5阶段细胞约三天，来使第5阶段细胞分化成第6阶段细胞。作为另一种选择，可通过用补充有约0.25μM的SANT-1、约50nM的视黄酸、约0.25mM的抗坏血酸、约500nM的ALK5抑制剂和10nM的T3的培养基处理第5阶段细胞约三天，来使第5阶段细胞分化成第6阶段细胞。可根据需要，将细胞在此类培养基中再培养两天或以上。

作为另一种选择，可通过用补充有肝素、SMO抑制剂或SHH信号转导途径拮抗剂、BMP抑制剂、T3/T4和ALK5抑制剂的培养基处理并且在空气-液体界面处培养第5阶段细胞约六至十四天、或约6天、或约7天、或约8天、或约9天、或约10天、或约11天、或约12天、或约13天，以及或约14天，来使第5阶段细胞分化成第6阶段细胞。在一个替代实施例中，培养基可补充有SMO抑制剂和SHH信号转导途径拮抗剂两者。例如，可在补充有约10μg/ml的肝素；约0.25μM的SANT-1；约100nM的LDN-193189；约1000nM的T3和约500至约10,000nM、约1000至约10,000nM、约5000至约10,000nM、约600至约5000nM、约700至约5000nM、约800至约5000nM、约900至约5000nM、约1000nM至约5000nM、约600至约1000nM、约700至约1000nM、约800至约1000nM、约600至约1200nM、约700至约1200nM、约800至约1200nM、约900至约1200nM、或约500nM、或约1000mM，以及或约10,000nM的ALK5抑制剂的培养基中培养所述细胞。

合适的ALK5抑制剂包括但不限于SD208、ALK5抑制剂II、TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI、TGF-β受体抑制剂III，以及它们的组合。

在一个实施例中，ALK5抑制剂是ALK5抑制剂II。在另一个实施例中，使用约1000nM的ALK5抑制剂II。因此，在一个实施例中，可通过用补充有肝素、SMO抑制剂或SHH信号转导途径拮抗剂、BMP抑制剂、T3/T4，以及ALK5抑制剂的培养基处理并且在空气-液体界面处培养第5阶段细胞约六天来使第5阶段细胞分化成第6阶段细胞。在一个替代实施例中，培养基可补充有SMO抑制剂和SHH信号转导途径拮抗剂两者。在某些实施例中，在空气-液体界面处培养之前，可用细胞脱附溶液处理细胞，所述细胞脱附溶液为诸如包含蛋白水解酶和胶原蛋白酶的溶液。

在另一个实施例中，可通过用补充有肝素、SMO抑制剂或SHH信号转导途径拮抗剂、BMP抑制剂、T3，以及ALK5抑制剂II的培养基处理并且在空气-液体界面处培养第5阶段细胞约5天至约15天、约6天至约14天、约7天至约13天、约8天至约12天、约9天至约11天、约5天至约10天、约10天至约15天、或约5天、或约6天、或约7天、或约8天、或约9天、或约10天、或约11天、或约12天、或约13天、或约14天，或约15天，使第5阶段细胞分化成第6阶段细胞。在一个实施例中，在空气-液体界面处培养细胞5天或以上、6天或以上、7天或以上、8天或以上、9天或以上、10天或以上、11天或以上、12天或以上、13天或以上、14天或以上、15天或以上。在一个实施例中，在空气-液体界面处培养细胞15天或以下、14天或以下、13天或以下、12天或以下、11天或以下、10天或以下、9天或以下、8天或以下、7天或以下、6天或以下、5天或以下。在一个实施例中，将细胞在空气-液体界面处培养约10天。在另一个实施例中，将细胞在空气-液体界面处培养约11天。在一个替代实施例中，将细胞在空气-液体界面处培养约12天。在另一个实施例中，将细胞在空气-液体界面处培养约15天。在这些实施例中，培养基可补充有约10μg/ml的肝素、约0.25μM的SANT-1、约100nM的LDN-193189、约1000nM的T3、以及约10,000nM的ALK5抑制剂II。在某些实施例中，培养基还可补充有硫酸锌(ZnSO₄)。例如，培养基还可补充有约10μM的ZnSO₄。在一个替代实施例中，培养基可补充有SMO抑制剂和SHH信号转导途径拮抗剂两者。

根据前述方法，本发明还提供了一种用于使表达胰腺内胚层/胰腺内分泌前体细胞的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞的细胞培养物，所述细胞培养物包括：(a)培养容器；(b)在所述容器内一定体积的生长培养基，所述体积足以填充所述容器的体积的仅一部分；(c)所述容器内的空气，所述空气填充所述容器邻接所述培养基的部分；(d)多孔基质，所述多孔基质定位在所述培养基和所述空气之间的界面处；以及(e)衍生自多能干细胞的表达胰腺内胚层/胰腺内分泌前体细胞的特征性标志物的细胞，所述细胞设置在所述基质的表面上，使得所述培养基接触所述细胞表面的仅一部分。

在一个实施例中，利用根据本发明的实施例培养的第5阶段细胞并且使所述细胞分化成第6阶段细胞，而在其他实施例中可利用根据其他方案培养的第5阶段细胞。

在另一个实施例中，本发明的方法导致第6阶段细胞的产生，所述第6阶段细胞是单激素阳性的。因此，在一个实施例中，本发明的方法产生共表达NKX6.1和嗜铬粒蛋白-A的第6阶段细胞。在另一个实施例中，本发明的方法产生共表达NKX6.1和胰岛素的第6阶段细胞。

在本发明的某些实施例中，该方法在第4阶段至第6阶段采用BLAR定制培养基(参见表II)。培养基可优选地每天更换或另选地每隔一天更换。在本发明的某些实施例中，所述方法包括：用指定组分按照在本文表VIII至XIII中示出的量处理第4阶段至第6阶段细胞。

在另一个实施例中，本发明涉及一种用于产生共表达NKX6.1和嗜铬粒蛋白-A的第6阶段细胞的方法，该方法包括在第4至第6阶段中，优选地在第5阶段和第6阶段在空气-液体界面处培养细胞。在另一个实施例中，本发明涉及一种通过在第4至第6阶段中，优选地在第5阶段和第6阶段在空气-液体界面处培养细胞，来产生表达NKX6.1细胞的单激素胰岛素阳性细胞的方法。

在第4阶段期间或之后在空气-液体界面处培养细胞可显著提升胰腺内胚层标志物和内分泌相关标志物的表达。因此，本发明提供通过在第4阶段期间或之后在空气-液体界面处培养细胞来提升胰腺内胚层标志物和内分泌相关标志物的表达的方法。

在另一个实施例中，本发明还提供通过在存在ALK5抑制剂的情况下，在空气-液体界面处培养第4阶段细胞和后续细胞，来增加共表达胰岛素、嗜铬粒蛋白-A、或嗜铬粒蛋白-A和胰岛素两者的NKX6.1阳性细胞的收率的方法。在一个实施例中，ALK5抑制剂是ALK5抑制剂II。其他合适的ALK5抑制剂包括但不限于TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI、TGF-β受体抑制剂III、以及它们的组合。在一些实施例中，除了ALK5抑制剂之外，还可如下表VIII至XIII所述地处理细胞。

在一个实施例中，本发明提供通过在存在ALK5抑制剂II的情况下在第5阶段期间在空气-液体界面处培养细胞，来增加共表达胰岛素、嗜铬粒蛋白-A、或嗜铬粒蛋白-A和胰岛素两者的NKX6.1阳性细胞的方法。在一个实施例中，该方法还包括在第5阶段期间在ALK5抑制剂II和T3的存在下培养细胞。

第6阶段细胞的体内成熟

在本发明的某些实施例中，根据本发明的方法制备的第6阶段细胞可进一步在体内成熟。在一个实施例中，这些细胞可通过移植到哺乳动物的体内而进一步成熟。例如，可将细胞移植到小鼠肾包膜下方。在一个实施例中，在体内进一步成熟的第6阶段细胞是共表达NXK6.1和胰岛素的细胞。在另一个实施例中，在体内进一步成熟的第6阶段细胞是共表达NXK6.1和嗜铬粒蛋白的细胞。在一个替代实施例中，(a)共表达NXK6.1和胰岛素的细胞或(b)共表达NXK6.1和嗜铬粒蛋白的细胞的体内成熟导致早期的C肽产生。在某些实施例中，从移植约3百万个第6阶段细胞产生的C-肽水平类似于通过移植约3,000个人类胰岛产生的C-肽量。

根据本文所述的方法在空气-液体界面处培养还适用于根据化合物对胰腺激素和内分泌标志物的分泌的影响来筛选化合物。具体地，在空气-液体界面处培养的第4阶段至第6阶段细胞可以多种培养形式使用，包括从384至6孔形式，以评估以多种剂量和时间间隔包含多种小分子制剂或生物制剂对胰腺内胚层、胰腺内分泌前体、胰腺内分泌标志物和胰腺β细胞标志物的后续表达的影响。此类评估可通过以下方式实现：用PCR测量基因表达，用FACS、免疫染色测量蛋白质表达，或用ELISA来测量受到小分子制剂或生物制剂的添加影响的细胞的细胞因子分泌。

可使用本发明的方法获得的细胞

本发明还提供通过本发明的方法可获得的细胞或细胞群。本发明还提供已通过本发明的方法获得的细胞或细胞群。

本发明还提供优选地表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞或细胞群，所述细胞或细胞群通过显著共表达NKX6.1和嗜铬粒蛋白-A来表征。本发明还提供一种优选地表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物的胰岛素阳性细胞或胰岛素阳性细胞群，所述细胞或细胞群通过NKX6.1表达(任选地>30％)来表征。这些细胞或细胞群是先前未描述的细胞群，如在实例10中所解释的。

治疗方法

本发明提供治疗方法。具体地，本发明提供了一种用于治疗患有糖尿病，或有发展糖尿病风险的患者的方法。

本发明还提供可通过本发明的方法获得或已通过本发明的方法获得以用于治疗方法的细胞或细胞群。具体地，本发明提供可通过本发明的方法获得或已通过本发明的方法获得以用于治疗患有糖尿病，或有发展糖尿病风险的患者的方法的细胞或细胞群。

糖尿病可为1型糖尿病或2型糖尿病。

在一个实施例中，治疗方法包括将已通过本发明的方法获得或可通过本发明的方法获得的细胞植入患者。

在一个实施例中，治疗方法包括：

例如如本文所述，使多能干细胞体外分化成第1阶段、第2阶段、第3阶段、第4阶段、第5阶段或第6阶段细胞，

以及将分化的细胞植入患者。

在一个实施例中，该方法还包括在使多能干细胞分化的步骤之前，例如如本文所述的培养多能干细胞的步骤。

在一个实施例中，该方法还包括在植入步骤之后，使细胞体内分化的步骤。

在一个实施例中，患者是哺乳动物，优选地是人类。

在一个实施例中，可将这些细胞可作为分散的细胞植入，或可使这些细胞形成簇，可将这些细胞簇输注进肝门静脉内。作为另一种选择，可将细胞设置在生物相容性的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性装置中或可进行封装以保护其免受宿主免疫应答的破坏。可将细胞植入到受体中的适当位置内。植入位点包括例如肝脏、天然的胰腺、肾包膜下空间、网膜、腹膜、浆膜下空间、肠、胃或皮下袋。

为了增强植入细胞在体内的进一步分化、存活率或活性，可在施用细胞之前、与之同时或之后施用额外的因子，例如生长因子、抗氧化剂或抗炎剂。这些因子可由内源性细胞分泌并原位暴露于所施用的细胞。可通过本领域已知的内源施用的生长因子或外源施用的生长因子的任意组合来诱导植入细胞进行分化。

移植中所用的细胞量取决于多种因素，包括患者的状况和对该疗法的响应，并且可由本领域技术人员确定。

在一个实施例中，治疗方法还包括在移植前将所述细胞结合到三维支持物中。在移植进患者前，可将该细胞体外保持在该支持物上。作为另一种选择，可将包含该细胞的支持物直接植入到患者中而无需进行额外的体外培养。可任选将至少一种有利于植入细胞的存活和功能的药剂掺入该支持物中。

实例

实例1

在空气-液体界面处培养胰腺内分泌前体细胞

该实例检查并证实胰腺内分泌前体细胞(第5阶段细胞)当在空气-液体界面处培养时可进一步成熟。为了在空气-液体界面处培养胰腺内分泌前体细胞，基于如下所论述的方案将胚胎干细胞分化成胰腺内分泌前体细胞。

将人胚胎干细胞系H1的细胞作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在MATRIGEL^TM(1:30的稀释度；BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)涂覆的培养皿上的培养基(StemCell Technologies,Vancouver,Canada)中，所述培养基补充有10μM的Y27632(Rock抑制剂，目录号Y0503，Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。接种后四十八小时，将培养物在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸盐缓冲盐水溶液)中洗涤。随后根据以下方案使所述细胞分化：

a)第1阶段：(3天)：使接种在用1:30的MATRIGEL^TM涂覆的表面上的未分化H1细胞的60-70％汇合贴壁培养物暴露于RPMI 1640培养基(Life Technologies Corporation,Grand Island,NY)仅一天，所述RPMI 1640培养基补充有0.2％的胎牛血清(FBS)(Hyclone,Utah)、100ng/ml的活化素-A(AA；Pepro-tech；Rocky Hill,NJ)以及20ng/ml的Wnt3A(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)。在接下来的两天，在补充有0.5％的FBS和100ng/ml的AA的RPMI培养基中培养细胞。

b)第2阶段：(3天)：随后使第1阶段细胞暴露于Dulbecco改良的eagle培养基(DMEM-F12)(Life Technologies Corporation,NY)三天，所述培养基补充有2％的FBS和50ng/ml的FGF7(Pepro-tech)。

c)第3阶段：(4天)：第2阶段细胞随后在DMEM-HG培养基(Life Technologies Corporation,Grand Island,NY)中培养四天，所述DMEM-HG培养基补充有0.25μM的SANT-1(Sigma-Aldrich；St.Louis,MO)、2μM的视黄酸(Sigma-Aldrich)、100ng/ml的头蛋白(R&D Systems)，以及由Life Technologies Corporation,Grand Island,NY以商标出售的1％(v/v)的补充剂(目录号：17504044)。

d)第4阶段：(3天)：第3阶段细胞随后可在单层形式的DMEM-HG培养基中培养三天，所述DMEM-HG培养基补充有0.1μM的ALK5抑制剂(ALK5i；Axxora,San Diego,CA)、100ng/ml的头蛋白、500nM的TPB((2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-戊二烯酰氨基)苯并内酰胺；EMD Chemicals Inc,Gibbstown NJ)和1％的B27。在培养的最后一天，用5mg/ml的分散酶(BectonDickinson,Bedford,MA,#354235)处理细胞5分钟，接着温和地吹打混匀细胞并使细胞分散成细胞簇(<100微米)。将所述细胞簇移入一次性的125ml聚苯乙烯转瓶(Corning)，并且使所述细胞在含补充有200nM的ALK5抑制剂、100nM的LDN-193189(Stemgent,CA)和1％的B27的DMEM-HG培养基的悬浮液中以80至100rpm旋转过夜。

e)第5阶段：(1天)：第4阶段细胞随后用5mg/ml的分散酶处理5分钟，接着温和地吹打混匀细胞并使细胞分散成细胞簇(<100微米)。将所述细胞簇移入一次性的125ml聚苯乙烯转瓶(Corning,NY)，并且使所述细胞在含补充有200nM的ALK5抑制剂、100nM的LDN-193189(Stemgent,CA)和1％的B27的DMEM-HG的悬浮液中以80至100rpm旋转过夜。

将第5阶段第1天(S5D1)的细胞簇接种到6孔板中的0.4微米多孔细胞培养物滤器芯子(BD Biosciences，PET膜，#353493)上(在10微升等分试样中包含约1百万个细胞)，以及通过在滤芯的底部添加1.5ml的DMEM-HG+1％的B27并且在所述滤芯上方无培养基来在空气-液体界面处培养所述细胞簇3周。图1A至图1H示出在空气-液体界面处在各个接种后时间点的细胞簇的相位对比图像。图2A至图2K示出在细胞簇接种到过滤器上后一周时下列蛋白的免疫染色结果：DAPI(图2A)；胰岛素(图2B)；HB9(图2C)；DAPI(图2D)；胰高血糖素(图2E)；胰岛素(图2F)；DAPI(图2G)；胰岛素(图2H)；生长抑素(图2I)；NKX6.1(图2J)；以及胰岛素(图2K)。而图3A至图3H示出了在接种到过滤器上后2周时下列蛋白的免疫染色结果：胰岛素(图3A)；胰高血糖素(图3B)；胰岛素(图3C)；生长抑素(图3D)；胰岛素(图3E)；NKX6.1(图3F)；HB9(图3G)；以及NKX6.1(图3H)。在图2中，实验组A-C、D-F、G-I和J-K取自相同的视野。在图3中，实验组A-B、C-D、E-F和G-H分别取自相同的视野。图4A至图4D示出了在接种到过滤器上后3周时下列蛋白的免疫染色结果：胰岛素(图4A)；胰高血糖素(图4B)；胰岛素(图4C)；以及生长抑素(图4D)。在图4中，实验组A-B和C-D分别取自相同的视野。

在第4阶段和随后的培养中，采集mRNA以进行对相关胰腺内胚层/内分泌基因的PCR分析。用小量提取试剂盒(Mini Kit)(Qiagen；Valencia,CA)提取总RNA，并且用高容量cDNA逆转录试剂盒(High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit)(Applied Biosystems,FosterCity,CA)根据制造商的使用说明逆转录所述总RNA。cDNA使用Taqman通用预混液(Taqman Universal Master Mix)和预加载到定制的Taqman阵列(Taqman Arrays)(Applied Biosystems)上的Taqman基因表达分析(TaqmanGene Expression Assays)进行扩增。所述数据使用序列检测软件(AppliedBiosystems)进行分析，并且使用ΔΔCt方法(即，用内部对照校准的qPCR结果(ΔΔCt＝ΔCt_sample-ΔCt_reference))对未分化的人胚胎干(hES)细胞进行归一化。所有引物均购自Applied Biosystems。FACS和免疫荧光分析是如先前所描述地进行的(Diabetes,61,20126,2012)。

图5A至图5R示出了如实例1中所概述分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：PDX1(图5A)；NKX6.1(图5B)；Pax4(图5C)；Pax6(图5D)；NGN3(图5E)；NKX2.2(图5F)；ABCC8(图5G)；嗜铬粒蛋白-A(图5H)；PCSK1(图5I)；IAPP(图5J)；胰岛素(图5K)；胰高血糖素(图5L)；生长抑素(图5M)；生长素释放肽(图5N)；Ptf1a(图5O)；Zic1(图5P)；CDX2(图5Q)；以及SOX9(图5R)。在空气-液体界面处培养3周之后，与内分泌细胞的成熟相关联的标志物诸如ABCC8、IAPP(淀粉不溶素)和PCSK1的表达存在显著的时间依赖性增加。存在PTF1a和SOX9表达的显著下降和非常低的CDX2(肠标志物)、ZIC1(外胚层标志物)和SOX2(前内胚层标志物)表达，而NKX6.1和PDX1的表达维持在非常高的水平。所有胰腺激素的表达通过在空气-液体界面处培养3周而得到显著的提升。

实例2

使用各种滤器芯子在空气-液体界面处培养胰腺内分泌前体细胞

该实例检查在胰腺内胚层细胞在空气-液体界面处的分化中滤器芯子的类型和孔隙率。为了检查滤器芯子的类型和孔隙率的影响，使用以下论述的方案来使胚胎干细胞分化。

将人胚胎干细胞系H1的细胞(传代40代)作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在MATRIGEL^TM(1:30的稀释度；BD Biosciences,NJ)涂覆的培养皿上或MATRIGEL^TM涂覆的滤器芯子(Millipore PIHT 30R 48)上的培养基中，所述培养基包含DMEM-F12(Invitrogen,Ca)、GlutaMax^TM(1:100的稀释度，Invitrogen)、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)、100ng/ml的FGF2(R&D systems,MN)、1ng/ml的TGF-β(R&D systems)、ITS-X(1:100的稀释度)、2％无脂肪酸BSA(Lampire,PA)，以及20ng/ml的IGF-1(R&Dsystems)，所述培养基补充有10μM的Y27632(Rock抑制剂，目录号Y0503，Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。接种后四十八小时，将培养物在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸盐缓冲盐水溶液)中洗涤。随后根据以下方案使所述细胞分化：

a.第1阶段(3天)：细胞在MCDB-131培养基(Invitrogen，目录号10372-019)中培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA(Proliant，目录号68700)、0.0012g/ml的碳酸氢钠(Sigma-Aldrich，目录号S3187)、1X的GlutaMax^TM(Invitrogen，目录号35050-079)、4.5mM的D-葡萄糖(Sigma-Aldrich，目录号G8769)、100ng/ml的GDF8(R&D Systems)和1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。接着，细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖和100ng/ml的GDF8。

b.第2阶段(2天)：第1阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)和25ng/ml的FGF7(R&DSystems,MN)。

c.第3阶段(2天)：第2阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有1:200稀释度的ITS-X(Invitrogen,CA)、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1(Sigma,MO)、1μM的RA(Sigma,MO)、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗坏血酸、200nM的TPB(PKC活化剂；目录号565740；EMDChemicals,Gibbstown,NJ)，以及100nM的LDN-193189(BMP受体抑制剂；目录号04-0019；Stemgent)。

d.第4阶段(3天)：第3阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1、100nM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗坏血酸、10nM的T3(T6397,Sigma)和100nM的TPB。

e.第5阶段(3天)：第4阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、0.25mM的抗坏血酸、10nM的T3、50nM的LDN-193189、1000nM的ALK5抑制剂SD208。SD208((2-(5-氯-2-氟苯基)-N-4-吡啶基-4-蝶啶胺)是一种2,4-二取代的蝶啶，是TGF-βR I激酶的ATP-竞争性抑制剂，公开于Molecular Pharmacology 2007,72:152-161中并且具有如式I中所示出的结构。

式1：

f.第6阶段(5天)：第5阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、0.25mM的抗坏血酸、500nM的ALK5抑制剂、0.1nM的T3。

在一些培养物中，在第3阶段至第6阶段，在平皿上培养的细胞在室温下用1X的ACCUTASE^TM(StemCell Tech,Vancouver)处理1-3分钟，之后去除所述酶并且用细胞刮棒刮擦所述细胞。将所得的细胞悬浮液以约2-6×10⁶个细胞的密度接种到6孔板中的0.4微米多孔细胞培养物滤器芯子上，所述滤器芯子具有约4.2cm²的表面积。所使用的各种滤器芯子在表I中示出。将1.5ml的培养基添加至每一滤芯的底部，并且不另外添加培养基至过滤器的顶上侧。在一些培养物中，将过滤器用MATRIGEL^TM(1:30的稀释度)在室温下涂覆1小时，并将所述细胞接种到在空气-液体界面处的经涂覆滤芯的顶部上，或在所述滤芯的顶端部上有培养基。培养基在研究持续期间每隔一天更换。

图6示出了如实例2中所概述分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：PDX1(图6A)；NKX6.1(图6B)；PAX4(图6C)；PAX6(图6D)；NGN3(图6E)；NKX2.2(图6F)；ABCC8(图6G)；嗜铬粒蛋白-A(图6H)；PCSK1(图6I)；IAPP(图6J)；胰岛素(图6K)；以及胰高血糖素(图5L)。在滤器芯子(Corning，3412；BD，353493；以及Millipore PIHT 30R 48)上培养第4阶段(S4)细胞显著增加胰腺内胚层标志物以及内分泌相关的标志物。用MATRIGEL^TM涂覆过滤器显著地减弱在空气-液体界面处的过滤器上培养的益处。此外，在低孔隙密度的滤器芯子(BD 353090,Corning 3452)上培养的细胞显示出较少的存活率和分化。

实例3

相较于平面培养物或维持在液体-液体界面处的过滤器上的培养物，在空气-液体界面处培养的胰腺内胚层细胞显示出提升的内分泌标志物表达

该实例涉及在平面基质上培养的胰腺内胚层细胞相较于在空气-液体界面处培养的那些胰腺内胚层细胞的分化倾向差异。此外，空气-液体界面的效果通过在滤芯上使细胞分化但是将培养基同时添加至所述滤芯的顶部和底部而进一步突出。

将人胚胎干细胞系H1的细胞(传代40代)作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在MATRIGEL^TM(1:30的稀释度；BD Biosciences,NJ)涂覆的培养皿上或MATRIGEL^TM涂覆的滤器芯子(Millipore PIHT 30R 48)上的培养基中，所述培养基包含DMEM-F12(Invitrogen,Ca)、GlutaMax^TM(1:100的稀释度，Invitrogen)、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)、100ng/ml的FGF2(R&D systems,MN)、1ng/ml的TGF-β(R&D systems)、ITS-X(1:100的稀释度)、2％无脂肪酸BSA(Lampire,PA)，以及20ng/ml的IGF-1(R&Dsystems))，所述培养基补充有10μM的Y27632(Rock抑制剂，目录号Y0503，Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。接种后四十八小时，将培养物在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸盐缓冲盐水溶液)中洗涤。对于在滤器芯子上培养的细胞，在第1阶段开始时，在一些培养物中仅将培养基添加至滤芯的底部，而滤芯的顶部则保持在空气-液体界面处，而在其他培养中还将培养基添加至滤器芯子的顶部以及滤芯的底部。随后根据以下方案使所述细胞分化：

a)第1阶段(3天)：细胞在MCDB-131培养基(Invitrogen，目录号10372-019)中培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA(Proliant，目录号68700)、0.0012g/ml的碳酸氢钠(Sigma-Aldrich，目录号S3187)、1X的GlutaMax^TM(Invitrogen，目录号35050-079)、4.5mM的D-葡萄糖(Sigma-Aldrich，目录号G8769)、100ng/ml的GDF8(R&D Systems)和1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。接着，细胞在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖和100ng/ml的GDF8。

b)第2阶段(2天)：第1阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)和25ng/ml的FGF7(R&DSystems,MN)。

c)第3阶段(2天)：第2阶段细胞随后用BLAR定制培养基(由Invitrogen制备，BLAR培养基的组分请参见表II)处理两天，所述BLAR定制培养基补充有1:200稀释度的ITS-X(Invitrogen,CA)、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1(Sigma,MO)、1μM的RA(Sigma,MO)、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗坏血酸、200nM的TPB(PKC活化剂；目录号565740；EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)，以及100nM的LDN-193189(BMP受体抑制剂；目录号04-0019；Stemgent)。

d)第4阶段(3天)：第3阶段细胞随后用BLAR培养基处理三天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1、100nM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗坏血酸、10nM的T3(T6397,Sigma)和100nM的TPB。

e)第5阶段(3天)：第4阶段细胞用BLAR培养基处理三天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、0.25mM的抗坏血酸、10nM的T3、50nM的LDN-193189、1000nM的ALK5抑制剂(SD208)。

f)第6阶段(5天)：第5阶段细胞随后用BLAR培养基处理三天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、0.025mM的抗坏血酸、500nM的ALK5抑制剂、0.1nM的T3。

在一些培养物中，在第3阶段结束时，在平皿上培养的细胞在室温下用1X的ACCUTASE^TM(StemCell Tech,Vancouver)处理1-3分钟，之后去除所述酶并且用细胞刮棒刮擦所述细胞。将所得的细胞悬浮液以2-6×10⁶个细胞的密度(在50-100μl的等分试样中)接种到6孔板中的0.4微米多孔细胞培养物滤器芯子(BD 353493)上。将1.5ml的培养基添加至每一滤芯的底部，并且不另外添加培养基至过滤器的顶上侧。培养基在研究持续期间每隔一天更换。

图7示出了如实例3中所概述分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：PDX1(图7A)；NKX6.1(图7B)；PAX4(图7C)；PAX6(图7D)；NGN3(图7E)；NKX2.2(图7F)；ABCC8(图7G)；嗜铬粒蛋白-A(图7H)；PCSK1(图7I)；IAPP(图7J)；胰岛素(图7K)；以及胰高血糖素(图7L)。

在第4阶段至第6阶段中在空气-液体界面处的滤器芯子上培养细胞显著提升了与胰腺内分泌相关的标志物。此外，相较于在平面培养物上或在空气-液体界面处培养的细胞，在滤器芯子的顶部和底部上都有培养基的情况下从第1阶段开始时在MATRIGEL^TM涂覆的滤器芯子上培养和分化的细胞确实显示出较低水平的胰腺内胚层和内分泌表达。此外，相较于所有测试的构型，在空气-液体界面处的滤器芯子上培养的胰腺内胚层细胞显示出最高的胰腺内分泌细胞表达。

这一页的其余部分故意保留空白

实例4

在空气-液体界面处培养并且用ALK5抑制剂II处理的胰腺内胚层细胞显示出显著更多数量的共表达嗜铬粒蛋白-A和胰岛素的NKX6.1阳性细胞

进行该实例以显示ALK5抑制剂II独特地在空气-液体界面处产生表达NKX6.1和胰岛素或嗜铬粒蛋白-A的大量细胞群。此外，这种观察结果是在空气-液体界面处的培养物所特有的。在单层平面培养物中的浸没培养未能显示出表达胰岛素或嗜铬粒蛋白-A的大量NKX6.1细胞。

将人胚胎干细胞系H1的细胞(传代40代)作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在MATRIGEL^TM(1:30的稀释度；BD Biosciences,NJ)涂覆的培养皿上或Matrigel涂覆的滤器芯子(Millipore PIHT 30R 48)上的培养基中，所述培养基包含DMEM-F12(Invitrogen,Ca)、GlutaMax^TM(1:100的稀释度，Invitrogen)、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)、100ng/ml的FGF2(R&D systems,MN)、1ng/ml的TGF-β(R&D systems)、ITS-X(1:100的稀释度)、2％的无脂肪酸BSA(Lampire,PA)，以及20ng/ml的IGF-1(R&D systems)，所述培养基补充有10μM的Y27632(Rock抑制剂，目录号Y0503，Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。接种后四十八小时，将培养物在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸盐缓冲盐水溶液)中洗涤。随后根据以下方案使所述细胞分化：

a)第1阶段(3天)：细胞在MCDB-131培养基(Invitrogen，目录号10372-019)中培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA(Proliant，目录号68700)、0.0012g/ml的碳酸氢钠(SigmaAldrich，目录号S3187)、1X的GlutaMax^TM(Invitrogen，目录号35050-079)、4.5mM的D-葡萄糖(SigmaAldrich，目录号G8769)、100ng/ml的GDF8(R&DSystems)和1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖和100ng/ml的GDF8。

b)第2阶段(2天)：第1阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)和25ng/ml的FGF7(R&DSystems,MN)。

c)第3阶段(2天)：第2阶段细胞随后用BLAR定制培养基(Invitrogen)处理两天，所述BLAR定制培养基补充有1:200稀释度的ITS-X(Invitrogen,Ca)、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1(Sigma,MO)、1μM的RA(Sigma,MO)、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗坏血酸、200nM的TPB(PKC活化剂；目录号565740；EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)，以及100nM的LDN-193189(BMP受体抑制剂；目录号04-0019；Stemgent)。

d)第4阶段(3天)：第3阶段细胞随后用BLAR培养基处理三天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1、100nM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗坏血酸和100nM的TPB。

e)第5阶段(-3天)：第4阶段细胞随后用BLAR培养基处理三天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、50nM的LDN、500-1000nM的各种ALK5抑制剂(关于所使用的抑制剂的列表请参见表III)。

f)第6阶段(7天)：第5阶段细胞随后用BLAR培养基处理，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、500-1000nM的ALK5抑制剂(关于所测试的抑制剂的列表请参见表III)。

在一些培养物中，在第4阶段的第1天结束时，在平皿上培养的细胞在室温下用1X的ACCUTASE^TM(StemCell Tech,Vancouver)处理1-3分钟，之后去除所述酶并且用细胞刮棒刮擦所述细胞。将所得的细胞悬浮液以2-4×10⁶个细胞的密度(在25-50μl的等分试样中)接种到6孔板中的0.4微米多孔细胞培养物滤器芯子(BD 353493)上。将1.5ml的培养基添加至每一滤芯的底部，并且不另外添加培养基至过滤器的顶上侧。培养基在研究持续期间每隔一天更换。

图8示出了如在实例4中所概述的在空气-液体界面处分化和培养的人胚胎干细胞系H1的细胞在空气-液体界面处的第4阶段第1天(S4D1)、第5阶段第3天(S5D3)和第6阶段第6天(S6D6)之后，其中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：PDX1(图8A)、NKX6.1(图8B)、NGN3(图8C)、ABCC8(图8D)、PCSK1(图8E)、生长素释放肽(图8F)、胰高血糖素(图8G)，以及胰岛素(图8H)。

图9示出了如在实例4中所概述分化并且在第5阶段第3天(S5D3)和第6阶段第4天(S6D4)在平面单层培养物中培养的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：PDX1(图9A)、NKX6.1(图9B)、NGN3(图9C)、ABCC8(图9D)、PCSK1(图9E)、生长素释放肽(图9F)、胰高血糖素(图9G)，以及胰岛素(图9H)。图8和图9的比较显示出在第5阶段和第6阶段用ALK5抑制剂II处理平面培养物导致相较于第5阶段，第6阶段的胰岛素表达下降。然而，用ALK5抑制剂对在空气-液体界面处的培养物的处理导致相较于第5阶段，第6阶段的胰岛素表达提升。相较于单层培养物，相同的模式还应用于在空气-液体界面处的培养物中的NGN3和NKX6.1表达。

图10示出了在空气-液体界面处在用1微摩尔SD208抑制剂(实验组9A)或1微摩尔ALK5抑制剂II(实验组10B)处理过的培养基中培养并且针对嗜铬粒蛋白-A(胰腺内分泌标志物)和NKX6.1(胰腺前体标志物和β细胞特异性标志物)进行染色的第6阶段细胞的免疫染色结果。用ALK5抑制剂II处理过的培养物导致NKX6.1和嗜铬粒蛋白-A的共表达。然而，用SD208处理过的培养物显示出非常低的NKX6.1和嗜铬粒蛋白-A共表达。

在空气-液体界面处的滤器芯子上培养胰腺前肠前体细胞与ALK5抑制剂II组合显著提升了共表达胰岛素或嗜铬粒蛋白-A的NKX6.1阳性细胞的数目。此外，应用于在传统单层培养物上培养的细胞的相同方案未能显示出大量的共表达胰岛素或嗜铬粒蛋白-A的NKX6.1阳性细胞。最后，用除ALK5抑制剂II之外的ALK5抑制剂对在空气-液体界面处培养的细胞处理未能显示出大量的共表达胰岛素或嗜铬粒蛋白-A的NKX6.1阳性细胞。这些结果表明在空气-液体界面处培养和用补充有ALK5抑制剂II的培养基培养的独特组合导致胰岛素/嗜铬粒蛋白-A和NKX6.1的共表达。

实例5

在空气-液体界面处培养的细胞的第5阶段和第6阶段中各种ALK5抑制剂的比较

该实例显示ALK5抑制剂II独特地在空气-液体界面处产生表达NKX6.1和胰岛素或嗜铬粒蛋白-A的大量细胞群。另外的TGF-β抑制剂如表IV中所列出的进行测试。

将人胚胎干细胞系H1的细胞(传代40代)作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在MATRIGEL^TM(1:30的稀释度；BD Biosciences,NJ)涂覆的培养皿上的培养基中，所述培养基包含DMEM-F12(Invitrogen,Ca)、GlutaMax^TM(1:100的稀释度，Invitrogen)、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)、100ng/ml的FGF2(R&D systems,MN)、1ng/ml的TGF-β(R&Dsystems)、ITS-X(1:100的稀释度)、2％的无脂肪酸BSA(Lampire,PA)，以及20ng/ml的IGF-1(R&D systems)，所述培养基补充有10μM的Y27632(Rock抑制剂，目录号Y0503，Sigma-Aldrich)。接种后四十八小时，将培养物在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸盐缓冲盐水溶液)中洗涤。随后根据以下方案使所述细胞分化：

a.第1阶段(3天)：细胞在MCDB-131培养基(Invitrogen，目录号10372-019)中培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA(Proliant，目录号68700)、0.0012g/ml的碳酸氢钠(Sigma-Aldrich，目录号S3187)、1X的GlutaMax^TM(Invitrogen，目录号35050-079)、4.5mM的D-葡萄糖(Sigma-Aldrich，目录号G8769)、100ng/ml的GDF8(R&D Systems)和1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有：2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖和100ng/ml的GDF8。

b.第2阶段(2天)：第1阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)和25ng/ml的FGF7(R&DSystems,MN)。

c.第3阶段(2天)：第2阶段细胞随后用BLAR定制培养基(Invitrogen)处理两天，所述BLAR定制培养基补充有1:200稀释度的ITS-X(Invitrogen,CA)、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1(Sigma,MO)、1μM的RA(Sigma,MO)、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗坏血酸、200nM的TPB(PKC活化剂；目录号565740；EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)，以及100nM的LDN-193189(BMP受体抑制剂；目录号04-0019；Stemgent)。

d.第4阶段(2天)：第3阶段细胞随后用BLAR培养基处理两天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1、100nM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗坏血酸和100nM的TPB；随后在第4阶段结束时，在平皿上培养的细胞用10μM的Y27632处理4小时，用PBS冲洗，然后在室温下用1X的TrypLE^TM(Invitrogen)处理5分钟，之后去除所述酶并且用基础培养基冲洗，然后用细胞刮棒刮擦所述细胞。将所得的细胞悬浮液以0.5-0.75×10⁵个细胞的密度(在10μl的等分试样中)接种到6孔板中的0.4微米多孔细胞培养物滤器芯子(BD 353493)上，或接种到10cm培养皿中的10cm滤器芯子(Corning,#3419)上。将1.5ml的培养基添加至6孔板中每一滤芯的底部，以及将7.5ml的培养基添加到每一10cm滤芯的底部。不另外添加培养基至过滤器的顶上侧。培养基在研究持续期间每天更换。

e.第5阶段(3天)：第4阶段细胞随后在空气-液体界面处在BLAR培养基中培养三天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、10μg/ml的肝素(Sigma,#H3149)、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、100nM的LDN-193189、1000nM的各种ALK5抑制剂(关于所使用的抑制剂的列表请参见表IV)。

f.第6阶段(6天)：第5阶段细胞随后用BLAR培养基处理六天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、10μg/ml的肝素(Sigma,#H3149)、0.25μM的SANT-1；100nM的LDN-193189、1000nM的T3、1000nM的ALK5抑制剂(关于所测试的抑制剂的列表请参见表IV)。

图23示出了如在实例5中所概述的在空气-液体界面处分化和培养的人胚胎干细胞系H1的细胞在第5阶段第4天和第6阶段第6天之后，其中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：PDX1(图23A)、NKX6.1(图23B)、NGN3(图23C)、ABCC8(图23D)、胰高血糖素(图23E)，以及胰岛素(图23F)。类似于实例4的结果，在空气-液体界面处的滤器芯子上培养胰腺前肠前体细胞和用ALK5抑制剂II处理显著提升了胰岛素和胰高血糖素的表达。用其他ALK5抑制剂处理胰腺前肠前体细胞并未导致胰岛素或胰高血糖素的显著表达。

实例6

在空气-液体界面处的接种细胞密度对后续分化成内分泌细胞的影响

该实例识别在空气-液体界面的接种密度范围以及所得的内分泌标志物的表达。为了进行该实例中的研究，使用以下论述的方案来使胚胎干细胞分化。

将人胚胎干细胞系H1的细胞(传代40代)作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在MATRIGEL^TM(1:30的稀释度；BD Biosciences,NJ)涂覆的培养皿上的培养基中，所述培养基包含DMEM-F12(Invitrogen,CA)、GlutaMax^TM(1:100的稀释度，Invitrogen)、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)、100ng/ml的FGF2(R&D systems,MN)、1ng/ml的TGF-β(R&Dsystems)、ITS-X(1:100的稀释度)、2％的无脂肪酸BSA(Lampire,PA)，以及20ng/ml的IGF-1(R&D systems)，所述培养基补充有10μM的Y27632(Rock抑制剂，目录号Y0503，Sigma)。接种后四十八小时，将培养物在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸盐缓冲盐水溶液)中洗涤。随后根据以下方案使所述细胞分化：

a)第1阶段(3天)：细胞在MCDB-131培养基(Invitrogen，目录号10372-019)中培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA(Proliant，目录号68700)、0.0012g/ml的碳酸氢钠(Sigma-Aldrich，目录号S3187)、1X的GlutaMax^TM(Invitrogen，目录号35050-079)、4.5mM的D-葡萄糖(Sigma-Aldrich，目录号G8769)、100ng/ml的GDF8(R&D Systems)和1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。接着，细胞在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖和100ng/ml的GDF8。

b)第2阶段(2天)：第1阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)和25ng/ml的FGF7(R&DSystems,MN)。

c)第3阶段(2天)：第2阶段细胞随后用BLAR定制培养基(Invitrogen)处理两天，所述BLAR定制培养基补充有1:200稀释度的ITS-X(Invitrogen,CA)、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1(Sigma,MO)、1μM的RA(Sigma,MO)、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗坏血酸、200nM的TPB(PKC活化剂；目录号565740；EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)，以及100nM的LDN-193189(BMP受体抑制剂；目录号04-0019；Stemgent)。随后，在第3阶段结束时，在平皿上培养的细胞用10μM的Y27632处理4小时，用PBS冲洗，然后在室温下用1X的TrypLE^TM(Invitrogen)处理5分钟，之后去除所述酶并且用基础培养基冲洗，然后用细胞刮棒刮擦所述细胞。将所得的细胞悬浮液以0.1、0.5、1和5×10⁶个细胞的密度(在10μl的等分试样中)接种到6孔板中的0.4微米多孔细胞培养物滤器芯子(BD 353493)上。将1.5ml的培养基添加至每一滤芯的底部，并且不另外添加培养基至过滤器的顶上侧。培养基在研究持续期间每天更换。

d)第4阶段(2天)：第3阶段细胞随后在空气-液体界面处在BLAR培养基中培养两天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、10μg/ml的肝素(Sigma,#H3149)、0.25μM的SANT-1、100nM的RA、2ng/mlFGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗坏血酸，以及100nM的TPB。

e第5阶段(3天)：第4阶段细胞随后用BLAR培养基处理三天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、10μg/ml的肝素(Sigma,#H3149)、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、100nM的LDN-193189、10000nM的ALK5抑制剂II。

f)第6阶段(14天)：第5阶段细胞随后用BLAR培养基处理十四天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、10μg/ml的肝素(Sigma,#H3149)、0.25μM的SANT-1、10000nM的ALK5抑制剂、100nM的LDN-193189，以及1000nM的T3。

采集第4阶段、第5阶段和第6阶段的RNA样本，并且通过实时PCR进行分析。图11示出了如实例6中所概述分化的并且在空气-液体界面处培养的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：ABCC8(图11A)；胰高血糖素(图11B)；淀粉不溶素(图11C)；胰岛素(图11D)；NGN3(图11E)；NKX2.2(图11F)；NKX6.1(图11G)；以及PDX1(图11H)。在0.1-1×10⁶个细胞/10μl的范围内的接种密度导致在第5阶段和第6阶段处相似的胰腺内胚层标志物和内分泌标志物表达。在空气-液体界面处最高的测试接种密度(5×10⁶个细胞/10μl)处，存在内分泌标志物表达的下降。

实例7

0.4微米、1微米和3微米孔尺寸的滤器芯子的比较

该实例比较过滤器孔尺寸对在空气-液体界面处的随后分化的影响。为了进行该实例中的研究，使用以下论述的方案来使胚胎干细胞分化。

将人胚胎干细胞系H1的细胞(传代40代)作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在MATRIGEL^TM(1:30的稀释度；BD Biosciences,NJ)涂覆的培养皿上的培养基中，所述培养基包含DMEM-F12(Invitrogen,CA)、GlutaMax^TM(1:100的稀释度，Invitrogen)、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)、100ng/ml的FGF2(R&D systems,MN)、1ng/ml的TGF-β(R&Dsystems)、ITS-X(1:100的稀释度)、2％的无脂肪酸BSA(Lampire,PA)，以及20ng/ml的IGF-1(R&D systems)，所述培养基补充有10μM的Y27632(Rock抑制剂，目录号Y0503，Sigma)。接种后四十八小时，将培养物在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸盐缓冲盐水溶液)中洗涤。随后根据以下方案使所述细胞分化：

a)第1阶段(3天)：细胞在MCDB-131培养基(Invitrogen，目录号10372-019)中培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA(Proliant，目录号68700)、0.0012g/ml的碳酸氢钠(Sigma-Aldrich，目录号S3187)、1X的GlutaMax^TM(Invitrogen，目录号35050-079)、4.5mM的D-葡萄糖(Sigma-Aldrich，目录号G8769)、100ng/ml的GDF8(R&D Systems)和1μM的MCX。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖和100ng/ml的GDF8。

b)第2阶段(2天)：第1阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)和25ng/ml的FGF7(R&DSystems,MN)。

c)第3阶段(2天)：第2阶段细胞随后用BLAR定制培养基(Invitrogen)处理两天，所述BLAR定制培养基补充有1:200稀释度的ITS-X(Invitrogen,CA)、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1(Sigma,MO)、1μM的RA(Sigma,MO)、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗坏血酸、200nM的TPB(PKC活化剂；目录号565740；EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)，以及100nM的LDN-193189(BMP受体抑制剂；目录号04-0019；Stemgent)。

d)第4阶段(2天)：第3阶段细胞随后用BLAR培养基处理三天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1、100nM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗坏血酸和100nM的TPB。随后，在第4阶段结束时，在平皿上培养的细胞用10μM的Y27632处理4小时，用PBS冲洗，然后在室温下用1X的TrypLE^TM(Invitrogen)处理5分钟，之后去除所述酶并且用基础培养基冲洗，然后用细胞刮棒刮擦所述细胞。将所得的细胞悬浮液以0.5-0.75×10⁶个细胞的密度(在10μl的等分试样中)接种到6孔板中的0.4微米、1微米或3微米多孔细胞培养物滤器芯子上。将1.5ml的培养基添加至每一滤芯的底部，并且不另外添加培养基至过滤器的顶上侧。培养基在研究持续期间每天更换。

e)第5阶段(3天)：第4阶段细胞随后在空气-液体界面处在BLAR培养基中培养三天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、10μg/ml的肝素(Sigma,#H3149)、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、100nM的LDN-193189、10000nM的ALK5抑制剂II。

f)第6阶段(15天)：第5阶段细胞随后用BLAR培养基处理十五天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、10μg/ml的肝素(Sigma,#H3149)、0.25μM的SANT-1、100nM的LDN-193189、1000nM的T3、10000nM的ALK5抑制剂II。

采集第6阶段的RNA样本，并且通过实时PCR进行分析。图12示出了如本实例中所概述分化的并且在空气-液体界面处培养的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：ABCC8(图12A)；胰高血糖素(图12B)；淀粉不溶素(图12C)；胰岛素(图12D)；NGN3(图12E)；NKX2.2(图12F)；NKX6.1(图12G)；以及PDX1(图12H)。在从0.4微米至3微米范围内的滤器芯子孔尺寸并未显著影响在空气-液体界面处的胰腺内胚层标志物或内分泌标志物的表达。

实例8

胰腺前肠前体细胞在空气-液体界面处的滤器芯子上与在液体-液体(L/L)界面处的滤器芯子上的分化比较

该实例比较在空气-液体界面处培养与在液体-液体界面处培养对滤器芯子上的胰腺前肠前体细胞分化的影响。为了进行该实例中的研究，使用以下论述的方案来使胚胎干细胞分化。

将人胚胎干细胞系H1的细胞(传代40代)作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在MATRIGEL^TM(1:30的稀释度；BD Biosciences,NJ)涂覆的培养皿上的培养基中，所述培养基包含DMEM-F12(Invitrogen,CA)、GlutaMax^TM(1:100的稀释度，Invitrogen)、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)、100ng/ml的FGF2(R&D systems,MN)、1ng/ml的TGF-β(R&Dsystems)、ITS-X(1:100的稀释度)、2％的无脂肪酸BSA(Lampire,PA)，以及20ng/ml的IGF-1(R&D systems)，所述培养基补充有10μM的Y27632(Rock抑制剂，目录号Y0503，Sigma-Aldrich)。接种后四十八小时，将培养物在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸盐缓冲盐水溶液)中洗涤。随后根据以下方案使所述细胞分化：

a)第1阶段(3天)：细胞在MCDB-131培养基(Invitrogen，目录号10372-019)中培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA(Proliant，目录号68700)、0.0012g/ml的碳酸氢钠(Sigma-Aldrich，目录号S3187)、1X的GlutaMax^TM(Invitrogen，目录号35050-079)、4.5mM的D-葡萄糖(Sigma-Aldrich，目录号G8769)、100ng/ml的GDF8(R&D Systems)和1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖和100ng/ml的GDF8。

b)第2阶段(2天)：第1阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)和25ng/ml的FGF7(R&DSystems,MN)。

c)第3阶段(2天)：第2阶段细胞随后用BLAR定制培养基(Invitrogen)处理两天，所述BLAR定制培养基补充有1:200稀释度的ITS-X(Invitrogen,CA)、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1(Sigma,MO)、1μM的RA(Sigma,MO)、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗坏血酸、200nM的TPB(PKC活化剂；目录号565740；EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)，以及100nM的LDN-193189(BMP受体抑制剂；目录号04-0019；Stemgent)。

d)第4阶段(2天)：第3阶段细胞随后用BLAR培养基处理两天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1、100nM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗坏血酸和100nM的TPB；随后在第4阶段结束时，在平皿上培养的细胞用10μM的Y27632处理4小时，用PBS冲洗，然后在室温下用1X的TrypLE^TM(Invitrogen)处理5分钟，之后去除所述酶并且用基础培养基冲洗，然后用细胞刮棒刮擦所述细胞。将所得的细胞悬浮液以0.5-0.75×10⁶个细胞的密度(在10μl的等分试样中)接种到6孔板中经MATRIGEL^TM涂覆的0.4微米多孔细胞培养物滤器芯子上。将1.5ml的培养基添加至每一滤芯的底部，并且不另外添加培养基至过滤器的顶上侧。对于L/L条件，还将培养基添加至滤器芯子的顶部上，以产生液体-液体界面。培养基在研究持续期间每天更换。

e)第5阶段(3天)：第4阶段细胞随后在空气-液体界面处在BLAR培养基中培养三天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、10μg/ml的肝素(Sigma,#H3149)、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、100nM的LDN-193189、10000nM的各种ALK5抑制剂II。

f)第6阶段(10天)：第5阶段细胞随后用BLAR培养基处理十天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、10μg/ml的肝素(Sigma,#H3149)、0.25μM的SANT-1、100nM的LDN-193189、1000nM的T3、10000nM的ALK5抑制剂II。

采集第5阶段和第6阶段的RNA样本，并且通过实时PCR进行分析。图13示出了如实例8中所概述分化的并且在空气-液体界面处培养的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：ABCC8(图13A)；胰高血糖素(图13B)；淀粉不溶素(图13C)；胰岛素(图13D)；NGN3(图13E)；NKX2.2(图13F)；NKX6.1(图13G)；以及PDX1(图13H)。相较于空气-液体界面条件，在L/L条件下观测到的最显著差异为胰高血糖素的显著上调(7X)。

实例9

在空气-液体界面处培养的胰腺内胚层/内分泌前体细胞可用于筛选化合物库

该实例检查了空气-液体界面培养物的筛选化合物库的用途。为此，使用以下论述的方案来使胚胎干细胞分化。

将人胚胎干细胞系H1的细胞(传代40代)作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在MATRIGEL^TM(1:30的稀释度；BD Biosciences,NJ)涂覆的培养皿上的培养基中，所述培养基包含DMEM-F12(Invitrogen,Ca)、GlutaMax^TM(1:100的稀释度，Invitrogen)、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)、100ng/ml的FGF2(R&D systems,MN)、1ng/ml的TGF-β(R&Dsystems)、ITS-X(1:100的稀释度)、2％的无脂肪酸BSA(Lampire,PA)，以及20ng/ml的IGF-1(R&D systems)，所述培养基补充有10μM的Y27632(Rock抑制剂，目录号Y0503，Sigma)。接种后四十八小时，将培养物在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸盐缓冲盐水溶液)中洗涤。随后根据以下方案使所述细胞分化：

a)第1阶段(3天)：细胞在MCDB-131培养基(Invitrogen，目录号10372-019)中培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA(Proliant，目录号68700)、0.0012g/ml的碳酸氢钠(Sigma-Aldrich，目录号S3187)、1X的GlutaMax^TM(Invitrogen，目录号35050-079)、4.5mM的D-葡萄糖(Sigma-Aldrich，目录号G8769)、100ng/ml的GDF8(R&D Systems)和1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖和100ng/ml的GDF8。

b)第2阶段(2天)：第1阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)和25ng/ml的FGF7(R&DSystems,MN)。

c)第3阶段(2天)：第2阶段细胞随后用BLAR定制培养基(Invitrogen)处理两天，所述BLAR定制培养基补充有1:200稀释度的ITS-X(Invitrogen,CA)、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1(Sigma,MO)、1μM的RA(Sigma,MO)、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗坏血酸、200nM的TPB(PKC活化剂；目录号565740；EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)，以及100nM的LDN-193189(BMP受体抑制剂；目录号04-0019；Stemgent)。

d)第4阶段(2天)：第3阶段细胞随后用BLAR培养基处理两天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1、100nM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗坏血酸和200nM的TPB；随后在第4阶段结束时，在平皿上培养的细胞用10μM的Y27632处理4小时，用PBS冲洗，然后在室温下用1X的TrypLE^TM(Invitrogen)处理5分钟，之后去除所述酶并且用基础培养基冲洗，然后用细胞刮棒刮擦所述细胞。将所得的细胞悬浮液以0.5-0.75×10⁶个细胞的密度(在10μl的等分试样中)接种到6孔板中经MATRIGEL^TM涂覆的0.4微米多孔细胞培养物滤器芯子上。将1.5ml的培养基添加至每一滤芯的底部，并且不另外添加培养基至过滤器的顶上侧。

e)第5阶段(3天)：第4阶段细胞随后在空气-液体界面处在BLAR培养基中培养三天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、10μg/ml的肝素(Sigma,#H3149)、10μM的ZnSO4(Sigma,Z0251)、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、100nM的LDN-193189、10000nM的ALK5抑制剂II。

f)第6阶段(12天)：第5阶段细胞随后用BLAR培养基处理十二天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、10μg/ml的肝素(Sigma,#H3149)、10μM的ZnSO4(Sigma,Z0251)、0.25μM的SANT-1、100nM的LDN-193189、1000nM的T3、10000nM的ALK5抑制剂II。在该阶段，筛选在表V中列出的化合物以识别影响内胚层标志物和内分泌标志物的潜在化合物。

采集第6阶段的RNA样本，并且通过实时PCR进行分析。图14示出了如实例9中所概述分化的并且在空气-液体界面处培养的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的表达的实时PCR分析的数据：ABCC8(图14A)；胰高血糖素(图14B)；淀粉不溶素(图14C)；胰岛素(图14D)；ISL-1(图14E)；MNX1(图14F)；NKX6.1(图14G)；以及SLC30A8(图14H)。该实例显示在空气-液体界面处培养的细胞作为筛选工具的潜能。

实例10

在空气-液体界面处培养的第5阶段和第6阶段细胞的FACS分布图

该实例研究在空气-液体界面处的第5阶段和第6阶段培养物的组成。为了进行该实例中的研究，使用以下论述的方案来使胚胎干细胞分化成第5阶段和第6阶段培养物。

将人胚胎干细胞系H1的细胞(传代40代)作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在MATRIGEL^TM(1:30的稀释度；BD Biosciences,NJ)涂覆的培养皿上的培养基中，所述培养基包含DMEM-F12(Invitrogen,Ca)、GlutaMax^TM(1:100的稀释度，Invitrogen)、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)、100ng/ml的FGF2(R&D systems,MN)、1ng/ml的TGF-β(R&Dsystems)、ITS-X(1:100的稀释度)、2％的无脂肪酸BSA(Lampire,PA)，以及20ng/ml的IGF-1(R&D systems)，所述培养基补充有10μM的Y27632(Rock抑制剂，目录号Y0503，Sigma)。接种后四十八小时，将培养物在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸盐缓冲盐水溶液)中洗涤。随后根据以下方案使所述细胞分化：

a)第1阶段(3天)：细胞在MCDB-131培养基(Invitrogen，目录号10372-019)中培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA(Proliant，目录号68700)、0.0012g/ml的碳酸氢钠(Sigma-Aldrich，目录号S3187)、1X的GlutaMax^TM(Invitrogen，目录号35050-079)、4.5mM的D-葡萄糖(Sigma-Aldrich，目录号G8769)、100ng/ml的GDF8(R&D Systems)和1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖和100ng/ml的GDF8。

b)第2阶段(2天)：第1阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)和25ng/ml的FGF7(R&DSystems,MN)。

c)第3阶段(2天)：第2阶段细胞随后用BLAR定制培养基(Invitrogen)处理两天，所述BLAR定制培养基补充有1:200稀释度的ITS-X(Invitrogen,Ca)、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1(Sigma,MO)、1μM的RA(Sigma,MO)、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗坏血酸、200nM的TPB(PKC活化剂；目录号565740；EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)，以及100nM的LDN-193189(BMP受体抑制剂；目录号04-0019；Stemgent)。

d)第4阶段(3天)：第3阶段细胞随后用BLAR培养基处理三天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1、100nM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗坏血酸和200nM的TPB；随后在第4阶段结束时，在平皿上培养的细胞用10μM的Y27632处理4小时，用PBS冲洗，然后在室温下用1X的TrypLE^TM(Invitrogen)处理5分钟，之后去除所述酶并且用基础培养基冲洗，然后用细胞刮棒刮擦所述细胞。将所得的细胞悬浮液以0.5-0.75×10⁶个细胞的密度(在10μl的等分试样中)接种到6孔板中经MATRIGEL^TM涂覆的0.4微米多孔细胞培养物滤器芯子上。将1.5ml的培养基添加至每一滤芯的底部，并且不另外添加培养基至过滤器的顶上侧。

e)第5阶段(3天)：第4阶段细胞随后在空气-液体界面处在BLAR培养基中培养三天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、10μg/ml的肝素(Sigma,#H3149)、10μM的ZnSO₄(Sigma,Z0251)、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、100nM的LDN-193189、10000nM的各种ALK5抑制剂II。

f)第6阶段(15天)：第5阶段细胞随后用BLAR培养基处理五至十五天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、10μg/ml的肝素(Sigma,#H3149)、10μM的ZnSO4(Sigma,Z0251)、0.25μM的SANT-1、100nM的LDN-193189、1000nM的T3、10000nM的ALK5抑制剂II。

收集第5阶段和在第6阶段各时间点的细胞，并且通过FACS进行分析。如先前所述地(Diabetes,61,2016,2012)并且使用表VI中列出的抗体进行FACS染色。图15示出了在第5阶段收集的细胞的FACS分布图。图16示出了在空气-液体界面处培养的第6阶段第5天细胞的FACS分布图。最后，图17示出了在空气-液体界面处培养的第6阶段第15天细胞的分布图。如图15所示，在第5阶段，在活跃细胞周期中存在少量共表达胰岛素和NKX6.1的细胞(约1％)和大量的PDX1阳性细胞，如通过PDX1和KI-67的共表达所测量的(约23％；KI-67指示细胞处于活跃细胞周期中)。然而，到第6阶段第5天为止(图16)，存在显著的PDX1+细胞增殖下降(8％)，同时存在共表达嗜铬粒蛋白-A的NKX6.1+细胞的数目的显著增长(51％；嗜铬粒蛋白-A是胰腺内分泌标志物)或共表达胰岛素的NKX6.1+细胞的数目的显著增长(14％)。此外，存在表达内分泌前体标志物ISL-1、NeuroD和NKX2.2的细胞的显著增多。这表明第6阶段的独特培养物允许细胞从增殖祖细胞命运脱离而快速成熟为早熟内分泌细胞。此外，通过延长第6阶段至15天，观测到了共表达胰岛素和NXK6.1的细胞百分比的增长(33％)(图17)。此外，还存在细胞周期中PDX1阳性细胞的百分比的下降(1％)，并且还存在ISL-1和NeuroD的百分比的增长。最后，大部分激素阳性细胞是单激素胰岛素阳性细胞(34％的单激素胰岛素阳性细胞，7％的单激素胰高血糖素阳性细胞，以及8％的多激素细胞)。NKX6.1和嗜铬粒蛋白-A，以及表达NKX6.1(>30％)的单激素胰岛素阳性细胞的显著共表达突出了先前未描述的细胞群。

实例11

NKX6.1+嗜铬粒蛋白-A+胰岛素+细胞、NKX6.1+嗜铬粒蛋白-A-胰岛素-和共表达PDX1和NKX6.1的胰岛素祖细胞相对于人类胰岛在SCID小鼠中的体内成熟

该实例突出了分化的细胞的体外组成及其对体内细胞性能的影响。具体地，将根据实例1在平面培养物上制备的5百万个第4阶段第4天(PDX1+NKX6.1+)胰腺前肠前体细胞、在空气-液体界面处培养的5百万个NKX6.1+嗜铬粒蛋白-A阴性细胞，以及根据实例10在空气-液体界面处制备的3百万个NKX6.1+嗜铬粒蛋白-A阳性细胞移植到未患糖尿病的SCID小鼠的肾包膜中，如在(Diabetes 2012,61(8):2016-29)中所述的。用循环的人类C-肽作为对细胞的成熟状态随时间变化的量度来追踪小鼠。此外，在独立的小鼠群组中，将1500-4000个人类尸体胰岛(PRODO labs,Irvine,CA)当量作为阳性对照移植。

NKX6.1+嗜铬粒蛋白-A阴性细胞群如下所述制备：

将人胚胎干细胞系H1的细胞(传代40代)作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在MATRIGEL^TM(1:30的稀释度；BD Biosciences,NJ)涂覆的培养皿上的培养基中，所述培养基包含DMEM-F12(Invitrogen,Ca)、GlutaMax^TM(1:100的稀释度，Invitrogen)、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)、100ng/ml的FGF2(R&D systems,MN)、1ng/ml的TGF-β(R&Dsystems)、ITS-X(1:100的稀释度)、2％的无脂肪酸BSA(Lampire,PA)，以及20ng/ml的IGF-1(R&D systems)，所述培养基补充有10μM的Y27632(Rock抑制剂，目录号Y0503，Sigma)。接种后四十八小时，将培养物在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸盐缓冲盐水溶液)中洗涤。随后根据以下方案使所述细胞分化：

a.第1阶段(3天)：细胞在MCDB-131培养基(Invitrogen，目录号10372-019)中培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA(Proliant，目录号68700)、0.0012g/ml的碳酸氢钠(Sigma-Aldrich，目录号S3187)、1X的GlutaMax^TM(Invitrogen，目录号35050-079)、4.5mM的D-葡萄糖(Sigma-Aldrich，目录号G8769)、100ng/ml的GDF8(R&D Systems)和1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖和100ng/ml的GDF8。

b.第2阶段(2天)：第1阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)和25ng/ml的FGF7(R&DSystems,MN)。

c.第3阶段(2天)：第2阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有1:200稀释度的ITS-X(Invitrogen,CA)、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1(Sigma,MO)、1μM的RA(Sigma,MO)、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗坏血酸、200nM的TPB(PKC活化剂；目录号565740；EMDChemicals,Gibbstown,NJ)，以及100nM的LDN-193189(BMP受体抑制剂；目录号04-0019；Stemgent)。第3阶段细胞随后在室温下用1X的ACCUTASE^TM处理1-3分钟，之后去除所述酶并且用细胞刮棒刮擦所述细胞。将所得的细胞悬浮液以约2×10⁶个细胞/10μl的密度接种到0.4微米多孔细胞培养物滤器芯子上。将1.5ml的培养基添加至每一滤芯的底部，并且不另外添加培养基至过滤器的顶上侧。

d.第4阶段(2天)：第3阶段细胞随后在空气-液体界面处在MCDB-131培养基中培养两天，所述MCDB-131培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1、100nM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗坏血酸、100nM的T3(T6397,Sigma)和100nM的TPB。

e.第5阶段(2天)：第4阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、50nM的LDN-193189、500nM的ALK5抑制剂(SD208)。

f.第6阶段(6天)：第5阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理六天，所述MCDB-131培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA；0.25μM的SANT-1、50nM的RA、500nM的ALK5抑制剂。

下表VII突出了三种人胚胎干细胞来源的细胞群的各种胰腺内胚层标志物和内分泌标志物的表达水平。具体地，表VII比较了下列的结果：(1)根据实例1(第4阶段第4天)产生的第4阶段第4天的细胞群；(2)根据实例11产生的胰腺内胚层/内分泌前体细胞群(胰腺内胚层/内分泌)；以及(3)根据实例10(NKX6.1+嗜铬粒蛋白-A+胰岛素+)产生的NKX6.1+嗜铬粒蛋白-A+胰岛素+细胞群。每种细胞群的FACS分布图信息示出在图17至图19中。具体地，图17示出了NKX6.1+嗜铬粒蛋白-A+细胞群的FACS分布图；图18示出了第4阶段第4天的细胞的FACS分布图；以及图19示出了根据实例11产生的第6阶段第6天胰腺内分泌细胞的FACS分布图。

在移植之后，周期性地测试小鼠中循环的人类C-肽的浓度。循环的人类C-肽是通过经由隐静脉采血来测试的。将血浆保存在-20℃下，随后使用人类C-肽通过ELISA试剂盒(Alpco Diagnostics,Salem,NH)来进行测定。这些结果也在图20中以图线示出。

图20示出了三种ES来源的细胞群相比于多种剂量的人类胰岛的产生C-肽的动力学图。表达基本上共表达的NKX6.1和嗜铬粒蛋白-A以及NKX6.1和胰岛素的细胞群导致显著地早产生C-肽。在第12周时，C-肽产生的水平类似于移植约4000个人类胰岛。然而，到移植后第16周为止，人类C-肽的水平已经几乎是通过移植4000个人类胰岛实现的C-肽量值的两倍。

然而，移植表达PDX1和NKX6.1的祖细胞或胰腺前体细胞和多激素细胞(嗜铬粒蛋白-A+NKX6.1-)的混合细胞群需要显著更长时期来分泌与4000个人类胰岛等效水平的C-肽。

实例12

γ分泌酶抑制剂XX的添加进一步扩增在空气-液体界面处培养的第6阶段细胞的成熟标志物

该实例突出NOTCH抑制剂，诸如γ分泌酶抑制剂，进一步增加β细胞的成熟标志物，同时维持NKX6.1的表达。将人胚胎干细胞系H1的细胞(传代42代)作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在MATRIGEL^TM(1:30的稀释度；BD Biosciences,NJ)涂覆的培养皿上的培养基中，所述培养基包含DMEM-F12(Invitrogen,Ca)、GlutaMax^TM(1:100的稀释度，Invitrogen)、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)、100ng/ml的FGF2(R&Dsystems,MN)、1ng/ml的TGF-β(R&D systems)、ITS-X(1:100的稀释度)、2％的无脂肪酸BSA(Lampire,PA)，以及20ng/ml的IGF-1(R&Dsystems)，所述培养基补充有10μM的Y27632(Rock抑制剂，目录号Y0503，Sigma)。接种后四十八小时，将培养物在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸盐缓冲盐水溶液)中洗涤。随后根据以下方案使所述细胞分化：

a)第1阶段(3天)：细胞在MCDB-131培养基(Invitrogen，目录号10372-019)中培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA(Proliant，目录号68700)、0.0012g/ml的碳酸氢钠(Sigma-Aldrich，目录号S3187)、1X的GlutaMax^TM(Invitrogen，目录号35050-079)、4.5mM的D-葡萄糖(Sigma-Aldrich，目录号G8769)、100ng/ml的GDF8(R&D Systems)和1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖和100ng/ml的GDF8。

b)第2阶段(2天)：第1阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)和25ng/ml的FGF7(R&DSystems,MN)。

c)第3阶段(2天)：第2阶段细胞随后用BLAR定制培养基(Invitrogen)处理两天，所述BLAR定制培养基补充有1:200稀释度的ITS-X(Invitrogen,Ca)、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1(Sigma,MO)、1μM的RA(Sigma,MO)、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗坏血酸、200nM的TPB(PKC活化剂；目录号565740；EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)，以及100nM的LDN-193189(BMP受体抑制剂；目录号04-0019；Stemgent)。

d)第4阶段(3天)：第3阶段细胞随后用BLAR培养基处理三天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1、100nM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗坏血酸和200nM的TPB；随后在第4阶段结束时，在平皿上培养的细胞用10μM的Y27632处理4小时，用PBS冲洗，然后在室温下用1X的TrypLE^TM(Invitrogen)处理5分钟，之后去除所述酶并且用基础培养基冲洗，然后用细胞刮棒刮擦所述细胞。将所得的细胞悬浮液以0.5-0.75×10⁶个细胞的密度(在10μl的等分试样中)接种到6孔板中经MATRIGEL^TM涂覆的0.4微米多孔细胞培养物滤器芯子上。将1.5ml的培养基添加至每一滤芯的底部，并且不另外添加培养基至过滤器的顶上侧。

e)第5阶段(3天)：第4阶段细胞随后在空气-液体界面处在BLAR培养基中培养三天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、10μg/ml的肝素(Sigma,#H3149)、10μM的ZnSO₄(Sigma,Z0251)、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、100nM的LDN-193189、10000nM的各种ALK5抑制剂II。

f)第6阶段(14天)：第5阶段细胞随后用BLAR培养基处理十四天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、10μg/ml的肝素(Sigma,#H3149)、10μM的ZnSO₄(Sigma,Z0251)、0.25μM的SANT-1、100nM的LDN-193189、1000nM的T3、10000nM的ALK5抑制剂II。

在第6阶段，测试各种剂量(100nM至5000nM)的γ分泌酶抑制剂XX(EMD,#565789)。采集第6阶段第4天和第6阶段第8天的mRNA。图21示出了关键的β细胞成熟标志物以及胰腺祖细胞标志物的PCR数据。如图21所示，成熟标志物，诸如淀粉不溶素(实验组21A)、胰岛素(实验组21B)和MAFA(实验组21C)显著上调，而NKX6.1(实验组21D)的表达则未受到显著影响。然而，胰腺前体标志物，诸如PTF1a(实验组21E)和SOX9(实验组21F)显著下调。

实例13

ALK5抑制剂的存在对于MAFA的上调至关重要，并且进一步添加T3还提升MAFA表达

该实例突出了ALK5抑制剂II添加上调MAFA表达的能力，以及T3与ALK5抑制剂和LDN-193189的添加进一步提升MAFA表达的能力。

将人胚胎干细胞系H1的细胞(传代42代)作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在MATRIGEL^TM(1:30的稀释度；BD Biosciences,NJ)涂覆的培养皿上的培养基中，所述培养基包含DMEM-F12(Invitrogen,Ca)、GlutaMax^TM(1:100的稀释度，Invitrogen)、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)、100ng/ml的FGF2(R&D systems,MN)、1ng/ml的TGF-β(R&Dsystems)、ITS-X(1:100的稀释度)、2％的无脂肪酸BSA(Lampire,PA)，以及20ng/ml的IGF-1(R&D systems)，所述培养基补充有10μM的Y27632(Rock抑制剂，目录号Y0503，Sigma)。接种后四十八小时，将培养物在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸盐缓冲盐水溶液)中洗涤。随后根据以下方案使所述细胞分化：

a)第1阶段(3天)：细胞在MCDB-131培养基(Invitrogen，目录号10372-019)中培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA(Proliant，目录号68700)、0.0012g/ml的碳酸氢钠(Sigma-Aldrich，目录号S3187)、1X的GlutaMax^TM(Invitrogen，目录号35050-079)、4.5mM的D-葡萄糖(Sigma-Aldrich，目录号G8769)、100ng/ml的GDF8(R&D Systems)和1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中再培养一天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖和100ng/ml的GDF8。

b)第2阶段(2天)：第1阶段细胞随后用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有2％的无脂肪酸BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、0.25mM的抗坏血酸(Sigma,MO)和25ng/ml的FGF7(R&DSystems,MN)。

c)第3阶段(2天)：第2阶段细胞随后用BLAR定制培养基(Invitrogen)处理两天，所述BLAR定制培养基补充有1:200稀释度的ITS-X(Invitrogen,Ca)、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1(Sigma,MO)、1μM的RA(Sigma,MO)、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗坏血酸、200nM的TPB(PKC活化剂；目录号565740；EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)，以及100nM的LDN-193189(BMP受体抑制剂；目录号04-0019；Stemgent)。

d)第4阶段(3天)：第3阶段细胞随后用BLAR培养基处理三天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0017g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、0.25μM的SANT-1、100nM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗坏血酸和200nM的TPB；随后在第4阶段结束时，在平皿上培养的细胞用10μM的Y27632处理4小时，用PBS冲洗，然后在室温下用1X的TrypLE^TM(Invitrogen)处理5分钟，之后去除所述酶并且用基础培养基冲洗，然后用细胞刮棒刮擦所述细胞。将所得的细胞悬浮液以0.5-0.75×10⁶个细胞的密度(在10μl的等分试样中)接种到6孔板中经MATRIGEL^TM涂覆的0.4微米多孔细胞培养物滤器芯子上。将1.5ml的培养基添加至每一滤芯的底部，并且不另外添加培养基至过滤器的顶上侧。

e)第5阶段(3天)：第4阶段细胞随后在空气-液体界面处在BLAR培养基中培养三天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、10μg/ml的肝素(Sigma,#H3149)、10μM的ZnSO₄(Sigma,Z0251)、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、100nM的LDN-193189、10000nM的ALK5抑制剂II。

f)第6阶段(8天)：第5阶段细胞随后用BLAR培养基处理八天，所述BLAR培养基补充有1:200稀释度的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMax^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的无脂肪酸BSA、10μg/ml的肝素(Sigma,#H3149)、10μM的ZnSO₄(Sigma,Z0251)、0.25μM的SANT-1、100nM的LDN-193189、1000nM的T3、10000nM的ALK5抑制剂II。

在第6阶段，按照各种组合去除ALK5抑制剂、T3或LDN，以测试每种因子对NKX6.1、胰岛素和MAFA的表达的影响。采集第6阶段第5天和第6阶段第8天的mRNA。图22示出了关键的β细胞成熟标志物以及胰腺祖细胞标志物的PCR数据。如图22所示，在第6阶段ALK5抑制剂的去除导致MAFA的表达显著下降。而ALK5抑制剂、LDN-183189(BMP受体抑制剂)和T3的组合显著提升以下标志物的表达：MAFA(图22A)、胰岛素(图22B)、淀粉不溶素(图22C)，并且适度地改善了NKX6.1的表达(图22D)。

实例14

用于在空气-液体界面处培养第6阶段细胞的其他方案

该实例公开了用于在空气-液体界面处培养第6阶段细胞的其他材料和方法。

所使用的材料包括以下物质：得自Corning的10cm滤器芯子(目录号3419，0.4微米聚碳酸酯膜)；MCDB-131培养基(Invitrogen，目录号10372-019)或BLAR定制培养基(由Invitrogen制备)；ITS-X(Invitrogen,Ca)；甲状腺激素(T3)：Sigma ALK5抑制剂II-ENZO(目录号ALX-27-445)；LDN-193189-StemGent(#04-0074)；肝素(Sigma,H3149)；以及无脂肪酸BSA(Proliant/Lampire,7500804)。

第6阶段的基础培养基的制备：添加1.5克/升的碳酸氢钠至MCDB-131培养基，加上2％的BSA，加上1:200X的ITS-X，加上另外15mM的葡萄糖。

第6阶段的分化培养基的制备：向第6阶段的基础培养基中添加10微摩尔的ALK5抑制剂II、100nM的LDN-193189，以及1微摩尔的T3。

方法

添加7.5ml的第6阶段分化培养基至10cm滤器芯子的底部。添加少量(20-30μl)的细胞簇至滤器芯子的顶部。通常，每10cm的滤芯上放置约50个细胞簇。在接种时，每个细胞簇包含约0.5M的细胞。

培养基优选地每天更换。细胞可通过单独地去除细胞团(诸如通过使用广口移液管头)来从滤器芯子去除，或所有的细胞团可通过用基础培养基冲洗过滤器的顶部来一次性去除。所述细胞团松散地贴附在滤芯上。

除了在先前实例中描述的具体培养条件以外，用于使多能细胞或它们的子代分化成胰腺内分泌细胞的其他合适的培养条件示出于表VIII至XIII中。如在这些表中所使用的，“ALK5 inh.”是ALK5抑制剂，“RA”是视黄酸，“Vit.C”是抗坏血酸，“inh.”是抑制剂，“act.”是活化剂，ZnSO₄是硫酸锌，“MCX”是MCX化合物，以及“AA”是活化素A。在某些实施例中，在一个阶段(例如，第4阶段)中的任一处理剂可与另一阶段(例如，第5阶段)中的任一处理剂组合。

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如在本发明的方法中使用、在表X示出的组分的示例性范围如下所示：

如下所示的表XI示出了适用于本发明方法的实施例的另选的示例性培养条件。

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如下所示的表XII示出了适用于本发明方法的实施例的另选的示例性培养条件。

如上文所详述的，本发明特别提供了一种形成表达β细胞的特征性标志物的细胞的方法，所述方法包括：通过用补充有T3/T4，或ALK5抑制剂、或T3/T4和ALK5抑制剂两者的培养基处理并且在空气-液体界面处培养表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞，来使所述细胞分化成表达β细胞的特征性标志物的细胞。在一个实施例中，仅在空气-液体界面处培养第4阶段至第6阶段细胞。第6阶段细胞可对NKX6.1、PDX1和HB9呈阳性。因而，本发明还提供了一种诱导衍生自多能干细胞的细胞中的PDX1、NKX6.1和HB9表达的方法，所述方法包括：(a)培养多能干细胞；(b)使所述多能干细胞分化成表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞；以及(c)通过用补充有T3/T4，或ALK5抑制剂，或T3/T4和ALK5抑制剂两者的培养基处理并且在空气-液体界面处培养表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞，来使所述细胞分化成表达PDX1、NKX6.1和HB9的细胞。此外，所得的第6阶段细胞可为单激素阳性细胞。在一个实施例中，第6阶段细胞共表达NKX6.1和嗜铬粒蛋白-A。在另一个实施例中，第6阶段细胞共表达NKX6.1和胰岛素。

在某些实施例中，所述方法包括用补充有T3/T4和ALK5抑制剂(诸如ALK5抑制剂II)的培养基处理第5阶段细胞。在这些实施例中，培养基可有利地还补充有一种或多种以下物质：视黄酸、抗坏血酸、SANT-1或LDN-139189。

尽管已结合各种具体材料、程序和实例描述和例示了本发明，然而应当理解，本发明并不限于所选材料和程序的特定组合。本领域的技术人员将理解，可对这些细节作出多种变型。说明书和示例应被认为仅为示例性的，本发明的真实范围和实质由以下权利要求书限定。本申请中所提到的所有参考文献、专利和专利申请均全文以引用方式并入本文中。