一种厚壳贻贝多糖部分酸水解化合物及其制备方法与应用

摘要

本发明涉及医药技术领域，本发明提供了一种新的制备我国东海厚壳贻贝多糖类部分酸水解化合物。本发明还提供了该厚壳贻贝多糖部分酸水解化合物的制备方法，以及在制备抗肿瘤药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，本发明涉及一种新的厚壳贻贝多糖 部分酸水解化合物，同时，还涉及该部分酸水解多糖类化合物的制备方法以及 在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

贻贝是海产双壳贝类，俗称青口、海红，其干制品统称淡菜，除含有丰富的 氨基酸、糖类、蛋白质及维生素外，还含有丰富的微量元素－硒。贝类提取物 具有抗肿瘤，增加机体免疫功能，降血脂，抗衰老及抗病毒和抗菌功能；新近 报道贻贝具有较高的修复DNA损伤的作用，故有望研制出抗肿瘤药物新成分； 贻贝足腺细胞分泌的粘液蛋白含有的贻贝粘着蛋白（属糖蛋白类）为超强度粘 液的研发等。贻贝不仅有很高的营养价值，还具有很好的药用和食疗功效，又 是补肾良药，药效明显。我国沿海所产的食用贻贝主要有紫贻贝、厚壳贻贝和 翡翠贻贝等。目前国内外研究对贻贝蛋白质如过氧化物歧化酶、凝集素等的分 离提纯及功能进行了一定研究，但对于贻贝多糖的研究不多。

从东海厚壳贻贝中分离纯化而来的贻贝多糖具有有明显的增强机体免疫力 作用及体内抗肿瘤等作用。对肿瘤细胞HO-8910、MCF-7、K562及SMMC-7721 均有显著抑制增殖作用。徐红丽等采用热水提取我国东海厚壳贻贝粗多糖， DEAE-Sepharose、Sepharose CL-6B柱层析进一步分离纯化得到贻贝多糖纯品 MP-I。用MTT法进行体外抗肿瘤活性的研究。结果表明贻贝多糖纯品MP-I主要 由葡萄糖组成，对体外多种肿瘤细胞均有不同程度抑制作用（参见文献：徐红 丽，郭婷婷，郭一峰，张建鹏，冯伟华，焦炳华。贻贝水溶性多糖MP-I的分离纯 化及体外抗肿瘤活性研究[J].第二军医大学学报，2006,27（9）：998-1001.）。

由于贻贝多糖精制品是高分子聚合物，在研究其抗肿瘤作用机理时，由于 其本身分子量较大，可能会对肿瘤细胞生长的内外环境造成一定影响，增加研 究结果的不确定性。因此，我们通过对贻贝多糖进行不完全酸水解，模拟体内 消化吸收过程，从而更加真实地反映贻贝多糖体内代谢情况并深入阐释其抗肿 瘤作用机制。

发明内容

本发明的目的在于针对多糖化合物由于其高分子性质，在体内消化吸收过程 复杂，从而影响其生物学功能发挥的缺点，提供一种新的厚壳贻贝部分酸水解 多糖类化合物及其制备方法；本发明的第二目的是提供该部分酸水解多糖类化 合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

本发明的第一方面，本发明提供了厚壳贻贝多糖类化合物及其制备方法，该 方法主要包括：

部分酸水解贻贝多糖的制备：在单因素实验的基础上，针对酸浓度、水解 时间、水解温度等因素采用正交法确定部分酸水解条件。

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

本发明提供了一种厚壳贻贝多糖部分酸水解化合物的制备方法，该方法包 括以下步骤：

A.粗制品制备

新鲜贻贝软体组织匀浆，1%甲醇间歇搅拌浸泡24h去脂，离心取沉淀。加 水煮沸5h，抽滤，残渣重复加水煮沸3h，抽滤，合并滤液。旋转蒸发50℃减压 浓缩滤液。0.5%活性炭脱色，离心去沉淀；加乙醇至终浓度75%，4℃静置醇沉 过夜。离心收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮洗涤2次，干燥得多糖水提物。 多糖水提物溶于水，Sevage法除蛋白，混合液磁力搅拌，分液漏斗静置分层， 弃下层有机溶剂相；反复8次，至界面无白色沉淀。旋转蒸发50℃减压浓缩上 层水相，加三倍体积无水乙醇沉淀过夜，弃上清，冷冻干燥得粗多糖；

B.精制品制备

将粗多糖溶于蒸馏水，离心收集上清，不溶物再次热水浴中溶于蒸馏水， 离心弃沉淀，合并两次上清液，终浓度约0.2g/ml；上DEAE-Sepharose F.F XK-50 离子交换制备柱，蒸馏水洗脱，自动部分接收器收集洗脱液；苯酚-硫酸法（1:5） 跟踪检测收集多糖组分，至无糖洗出为止，480nm处测定OD值，绘制洗脱曲 线；真空冷冻干燥浓缩多糖洗脱液，得到多糖提取物半纯品；多糖提取物复溶 于蒸馏水，离心弃沉淀，浓度约0.2g/ml，上Sepharose CL-6B凝胶制备柱，蒸 馏水洗脱，自动部分接收器收集洗脱液，苯酚-硫酸法跟踪检测收集多糖组分， 至无糖洗出为止。重复上Sepharose CL-6B凝胶制备柱，至HPLC检测呈单一对 称峰。真空冷冻干燥得到多糖精制品；

C.部分酸水解多糖化合物的制备

多糖精制品5mg/ml溶于0.9%NaCI溶液，加浓硫酸至终浓度10%，50℃，水 解2h；旋转蒸发50℃减压浓缩水解液，真空冷冻干燥得到。

本发明还提供了依据上述方法制备得到的厚壳贻贝多糖部分酸水解化合物。

本发明的第二方面，本发明提供了上述的厚壳贻贝多糖部分酸水解化合物在 制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的抗肿瘤药物，其抗肿瘤作用是通过抑制肿瘤细胞NF-κB p65基因表达 而起作用的。

本发明对所述的厚壳贻贝多糖部分酸水解化合物进行了体内外抗肿瘤活性 的检测，证明本发明化合物具有良好的抗肿瘤活性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明 范围的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中的生物材料和主要试剂购自国药集团上海分公司。

实施例1：厚壳贻贝部分酸水解多糖类化合物的制备

厚壳贻贝由浙江省嵊泗县翔远水产有限公司提供，采自浙江省嵊泗县贻贝 养殖水域。

取新鲜贻贝软体组织700g，组织捣碎机匀浆，加1L1%甲醇浸泡24h去脂， 5000rpm×10min离心取沉淀。加水5L，搅拌、煮沸5h，抽滤，残渣重复加水煮 沸3h，抽滤，合并两次滤液。旋转蒸发50℃减压浓缩滤液。0.5%活性炭脱色， 离心去沉淀。加乙醇至终浓度75%，4℃静置醇沉过夜。离心收集沉淀，分别用 无水乙醇和丙酮洗涤2次，干燥得多糖水提物。多糖水提物溶于250ml水，Sevage 法除蛋白（V样品:V氯仿:V正丁醇=20:4:1），混合液磁力搅拌0.5h，分液漏斗静 置分层，弃下层有机溶剂相（含大量蛋白）。反复8次，至界面无白色沉淀。旋 转蒸发50℃减压浓缩上层水相，加三倍体积无水乙醇沉淀过夜，弃上清，冷冻 干燥得粗多糖。将粗多糖溶于蒸馏水，离心收集上清，不溶物再次热水浴中溶 于蒸馏水，离心弃沉淀，合并两次上清液，终浓度约0.2g/ml。上DEAE-Sepharose  F.F XK-50离子交换制备柱，蒸馏水洗脱，自动部分接收器收集洗脱液。苯酚- 硫酸法（1:5）跟踪检测收集多糖组分，至无糖洗出为止（480nm处测定OD值， 绘制洗脱曲线）。真空冷冻干燥浓缩多糖洗脱液，得到多糖提取物半纯品。多糖 提取物复溶于蒸馏水，离心弃沉淀，浓度约0.2g/ml，上Sepharose CL-6B凝胶制 备柱，蒸馏水洗脱，自动部分接收器收集洗脱液，苯酚-硫酸法跟踪检测收集多 糖组分，至无糖洗出为止。重复上Sepharose CL-6B凝胶制备柱，至HPLC检测呈 单一对称峰。真空冷冻干燥得到多糖精制品。

多糖精制品5mg/ml溶于0.9%NaCI溶液，加浓硫酸至终浓度10%，50℃，水 解2h。旋转蒸发50℃减压浓缩水解液，真空冷冻干燥得到部分酸水解多糖化合 物。

实施例2：本发明化合物的抗肿瘤活性的研究

1.体外肿瘤细胞增殖抑制实验

0.25%胰酶消化对数生长期的人胃癌细胞MKN-45，分别调整细胞浓度为2 ×10⁵/ml，接种于96孔板，每组6个重复孔，每孔90μl，37℃，5％CO₂条件下贴 壁24h，加入不同浓度的多糖及部分酸水解多糖溶液10μl，使终浓度分别为 500μg/ml、100μg/ml、20μg/ml，同时设阴性对照组(生理盐水)，阳性对照组(5-Fu)， 使终浓度为5μg/ml。加样后培养72h，每孔加入10μl MTT(5mg/m1)，继续培养 4h。小心吸弃上清(悬浮细胞离心后弃上清)，每孔加入100μl10％SDS，37℃放 置过夜，待结晶完全溶解后，用酶标免疫测定仪590nm处测定各孔吸光度。根据 下面的公式计算出抑制率。

抑制率=(OD对照组-OD实验组)／OD对照组×100％

部分酸水解贻贝多糖的体外抑制肿瘤细胞生长作用的结果显示，贻贝多糖 对MKN-45细胞具有抑制作用，且抑制程度与多糖的剂量呈正相关。

2.部分酸水解贻贝多糖对MKN-45细胞NF-κB p65基因表达的影响

p65是一种重要转录因子，可以通过调控一系列基因的表达参与细胞增殖、 凋亡和肿瘤转化，它的过度表达推进细胞周期演进并抑制凋亡，在肿瘤发生发 展过程中发挥重要作用。0.25%胰酶消化对数生长期的MKN-45肿瘤细胞，调整 细胞浓度为5×10⁵/ml，接种于6孔板，37℃，5％CO₂条件下贴壁生长24h，加入 不同浓度的部分酸水解贻贝多糖溶液50μl，使终浓度分别为500μg/ml、100μg/ml、 20μg/ml，同时设阴性对照组(生理盐水,50μl)，分别继续培养24h、48h。收集细 胞，western blot法检测p65蛋白表达水平。实验结果表明，贻贝多糖能够显著降 低p65蛋白表达水平。因此，部分酸水解贻贝多糖通过降低肿瘤因子p65来抑制 肿瘤细胞的生长可能是其抑制肿瘤生长的机理之一。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业 的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中 描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还 会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发 明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。